宮炎凈提取物中生物堿對子宮內膜炎家兔的抗炎作用機理

賈書紅　李效振　張東升　等

摘要：為研究中藥復方宮炎凈提取物中生物堿對子宮內膜炎家兔的抗炎作用機理，通過制備子宮內膜炎家兔模型，給予不同劑量的生物堿治療后采血，分別對血液中超氧化物歧化酶（SOD）活性，丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）、前列腺素E2（PGE2）含量，白細胞介素2（IL-2）、白細胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）表達水平進行測定。結果表明，中藥復方宮炎凈中生物堿能顯著增強血清中SOD活性，并顯著或極顯著降低血清中MDA、NO、IL-2、IL-6及TNF-α含量（P<0.05或P<0.01）。以上結果表明，生物堿能降低子宮內膜炎家兔脂質過氧化物含量，提高機體的抗氧化能力，降低機體炎性細胞因子含量，降低機體損傷。

關鍵詞：生物堿；家兔；子宮內膜炎模型；抗炎機理

中圖分類號： S853.74文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）01-0209-03

收稿日期：2014-03-24

基金項目：新疆生產建設兵團科技支疆項目（編號：2013AB010）。

作者簡介：賈書紅（1989—），女，河北石家莊人，碩士研究生，從事中草藥的開發(fā)與利用研究。E-mail：jiashuhong16@163.com。

通信作者：谷新利，男，教授，博士生導師，從事中草藥的開發(fā)與利用研究。E-mail：xlgu@shzu.edu.cn。奶牛子宮內膜炎是子宮內膜發(fā)生炎癥的病理過程[1]，在臨床上治療該病大多依賴抗生素，而使用抗生素會帶來細菌耐藥性、藥物殘留等問題，迫使人們越來越傾向使用中草藥治療奶牛子宮內膜炎[2-4]。近年來，對于中草藥治療該病的報道較多，且對中草藥的抗炎作用也進行了大量研究，但對中草藥治療奶牛子宮內膜炎的機理鮮有報道。研究人員依據中藥復方配方原則將益母草、五靈脂、紅花、肉桂等中藥組合研制開發(fā)的中藥復方宮炎凈用于治療奶牛子宮內膜炎，并在臨床上取得較好的治療效果[5]。本試驗目的是從中藥抗氧化以及對細胞因子影響方面觀察中藥復方宮炎凈提取物中生物堿對子宮內膜炎家兔模型血液中一氧化氮（NO）、前列腺素E2（PGE2）、丙二醛（MDA）含量，超氧化物歧化酶（SOD）活性以及細胞因子IL-2、IL-6、TNF-α表達水平變化，旨在初步探討中藥復方宮炎凈提取物中生物抗炎作用機理。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗藥物中藥復方宮炎凈主要有益母草、當歸、川芎、桃仁、五靈脂、甘草等組成，由石河子大學動物科技學院中獸醫(yī)實驗室提供。中藥復方宮炎凈提取物：取中藥復方宮炎凈2 kg，加入10倍量70%乙醇浸泡24 h，裝柱，以2 mL/s的速度滲漉48 h，收集滲漉液，于旋轉蒸發(fā)器濃縮至生藥含量為1 g/mL。將制備好的宮炎凈提取液，用稀鹽酸調pH值4～5，抽濾，通過已處理好的陽離子交換樹脂柱，至流出液與10%硅鎢酸呈陽性反應為止。先用去離子水洗至流出液為近中性，再以5%鹽酸溶液洗脫至生物堿反應為陰性。收集洗脫液，蒸干即得生物堿。將生物堿溶于蒸餾水中，配成質量濃度為0.04 g/mL的溶液。

1.1.2試驗動物健康無生殖疾病的未孕新西蘭雌兔，體質量2.0～2.5 kg，由石河子大學試驗動物中心提供。家兔子宮內膜炎模型制作[6]： 取30只新西蘭雌兔，飼喂1周后，隨機分組，其中5只作為正常對照組，其余25只作為試驗組，試驗組家兔子宮灌注大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的12 h培養(yǎng)物等比例混合菌液2 mL/（只·d），每天1次，連續(xù)4 d。通過觀察家兔臨床癥狀、體溫變化、子宮分泌物變化、白細胞分類變等確認造模成功后用于試驗。

1.1.3主要試劑與儀器地塞米松磷酸鈉注射液（1206091，河南潤宏制藥有限公司）；冰醋酸為國產分析純；NO測試盒（硝酸還原酶法，20130824）、SOD測試盒（羥胺法，20130820）、MDA測試盒（硫代巴比妥酸法，20130823）均購于南京建成生物工程研究所；IL-2、IL-6、PGE2與TNF-a ELISA測定試劑盒均購于美國RD公司。 BioTek SynergeyTM 2多功能酶標儀 （550，Bio-Rad）；TDL-5離心機（Z36 HK，上海安亭科學儀器廠）；電熱恒溫水浴箱（WB-3-2.0T，上海實貝儀器設備廠）；渦旋混勻器。

1.2方法

將25只造模成功的新西蘭母兔隨機分成5組，每組5只，分別為中藥高劑量組、中劑量組、低劑量組、模型組和地塞米松組。中藥高中低3個劑量組分別給予生物堿（10、5、2.5 mL/只）；地塞米松組給予地塞米松，劑量為 5 mg/kg；模型組不予治療；正常對照組給予生理鹽水。給予頻率1次/d，連續(xù)7 d。

樣品采集和處理。各組家兔于末次給藥后，分別心臟采血約10 mL，室溫下靜置1 h，3 000 r/min離心10 min，分離血清于-20 ℃保存待用，用以SOD活性，MDA、NO、PGE2含量以及IL-2、IL-6、TNF-α表達水平的測定。

1.3檢測指標

1.3.1家兔SOD活性及MDA、NO、PGE2含量測定SOD活性的測定采用黃嘌呤氧化酶法，MDA含量的測定采用硫代巴比妥酸法（TBA），NO含量的測定采用硝酸還原酶法，PGE2含量的測定采用雙抗體夾心法。嚴格按照試劑盒使用說明測定，并根據相應計算公式計算出試驗結果。

1.3.2家兔血清中IL-2、IL-6、TNF-α表達水平的測定IL-2、IL-6、TNF-α表達水平的測定均采用雙抗夾心法。測定原理為雙抗體夾心法的基本原理，即利用特異性抗體包被微孔板，制成固相抗體，然后和待檢血清中相應抗原結合形成免疫復合物，洗滌后加酶標抗體，與免疫復合物中抗原結合形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經徹底洗滌后加底物顯色。用酶標儀在450 nm處測吸光度，通過標準曲線計算樣品濃度。

1.4數據處理

試驗數據采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，試驗結果均以“平均數±標準差”表示。

2結果與分析

2.1家兔血清中SOD活性以及MDA含量的測定

由表1可見，子宮內膜炎家兔模型組血清中SOD的活性以及MDA的含量均極顯著低于空白對照組。生物堿高劑量組SOD活性極顯著強于模型組；生物堿中劑量組和低劑量組SOD活性均顯著強于模型組；生物堿高、中、低3個劑量組均與空白對照組差異不顯著，且均與地塞米松組差異不顯著；生物堿高、中、低3個劑量組間無顯著差異。而子宮內膜炎家兔模型組血清中MDA含量除顯著高于生物堿低劑量組外，均與其他組差異極顯著。生物堿高、中、低3個不同劑量組MDA含量均與空白對照組差異不顯著，且均與地塞米松組差異不顯著。表明中藥復方宮炎凈中生物堿能顯著增強血清中SOD活性，降低MDA含量，提高機體抗氧化能力，降低機體損傷。

2.2家兔血清中NO、PGE2含量的測定

由表2可見，子宮內膜炎家兔模型組血清中NO含量極顯著高于空白對照組；生物堿高劑量組和中劑量組NO含量均極顯著低于模型組，均與地塞米松組差異顯著，且均與空白對照組差異不顯著；生物堿低劑量組NO含量顯著高于生物堿高劑量組和中劑量組。而家兔血清中PGE2含量變化不明顯。表明生物堿能顯著降低子宮內膜炎家兔血液中NO含量。

表1家兔血清中SOD活性以及MDA含量測定結果（n=5）

表2家兔血清中NO、PGE2含量測定結果（n=5）

組別NO含量

（μmol/L）PGE2含量

（ng/L）生物堿高劑量組58.07±0.52bBC347.62±17.12生物堿中劑量組61.93±7.98bBC385.79±22.53生物堿低劑量組83.45± 10.23aAC 360.43±21.82地塞米松組53.24±4.69bB364.63±19.60模型組92.69± 6.92aA 384.95±24.02空白對照組52.83±5.08bB377.11±16.87

2.3家兔血清中IL-2、IL-6、TNF-α表達水平測定

由表3可見，子宮內膜炎家兔模型組的IL-2、IL-6、TNF-α含量與均極顯著高于空白對照組。生物堿高劑量組的IL-2與IL-6表達水平均與模型組差異極顯著，與地塞米松組差異不顯著，且與空白對照組差異不顯著；而生物堿中劑量組的IL-2與IL-6的表達水平均顯著低于模型組，且與空白對照組和地塞米松組差異不顯著；生物堿低劑量組 IL-2 與IL-6含量均與模型組差異不顯著；生物堿高、中、低3個劑量組之間均差異不顯著。模型組TNF-α的表達水平與生物堿低劑量組差異顯著，與其他各組均差異極顯著；生物堿高、中劑量組與地塞米松組均差異不顯著，且均與空白對照組均差異不顯著。生物堿高、中、低3個劑量組TNF-α水平的表達之間差異不顯著。表明生物堿能顯著降低血液中IL-2、IL-6、TNF-α的表達水平，且以生物堿高劑量組效果最好。表3家兔血清中IL-2、IL-6與TNF-α表達水平測定結果（n=5）

組別IL-2表達水平

3結論與討論

正常狀態(tài)下，機體內抗氧化能力始終與機體清除自由基之間維持動態(tài)平衡，以維持機體內環(huán)境穩(wěn)定保護機體組織不被損傷。近年研究結果表明，機體許多疾病如炎癥、自身免疫疾病等均與機體內過量的氧自由基有關，即機體抗氧化能力下降或氧自由基產生過多則會引起組織損傷[7]。正常情況下，體內產生的氧自由基不僅無毒性作用，還具有獨特的生理作用，能殺滅有害微生物、消滅突變的細胞、解毒以及免疫調節(jié)等作用。但如果體內氧自由基產生過多或機體清除氧自由基的能力降低之后，能引起氧自由基蓄積引起組織損傷。SOD在機體組織內廣泛存在，是機體重要的抗氧化酶，能保護細胞免受自由基損傷，SOD活性間接反映機體清除自由基的能力。MDA是機體脂質過氧化反應的終末代謝產物，機體內MDA含量?？梢苑从硻C體脂質過氧化狀態(tài)，從而可以間接反映機體受氧自由基攻擊的嚴重程度。本試驗結果顯示，子宮內膜炎家兔模型組血清中SOD活性顯著減弱，MDA含量顯著升高；而中藥復方宮炎凈中生物堿能顯著增強血清中SOD活性，降低MDA含量。表明子宮內有炎癥時機體MDA含量顯著升高，體內氧化過程加劇自由基產生過多，此時SOD活性顯著減弱，機體抗氧化能力顯著下降，最終導致機體抗氧化能力與清除自由基之間動態(tài)平衡被打破，引起機體損傷。而生物堿能提高機體抗氧化能力，降低機體損傷，這與郭宏斌等的報道[8-9]一致。

NO是一種具有不配對電子的自由基，能與超氧陰離子反應生成強氧化性物質—過氧化亞硝酸鹽，這種強氧化性物質不僅具有毒性，導致脂質過氧化，而且還能進一步產生多種毒性物質，引發(fā)組織損傷，在炎癥的發(fā)生及發(fā)展過程中起重要作用[10]。PGE2是花生四烯酰合成酶的代謝產物，由巨噬細胞分泌合成，是一種重要的炎性介質，在局部炎癥和骨關節(jié)炎中研究較多[11-14]。本試驗結果顯示，子宮內膜炎家兔模型組血清中NO含量顯著升高，且生物堿能顯著降低血清中NO含量，而各組血清PGE2含量均變化不明顯。表明NO參與機體炎癥過程，導致細胞損傷，而生物堿能降低NO的生成，起到抗炎作用；PGE2可能在局部炎癥中生成會增多，但在子宮內膜炎家兔血清中變化不顯著，說明生物堿對家兔子宮內膜炎的抗炎機理可能與抑制NO生產有關，與李曉紅等的研究結果[15-16]一致。

細胞因子主要是指由免疫細胞和非免疫細胞分泌的一類小分子多肽或蛋白質。細胞因子根據Th細胞亞群分泌特點將其劃分為2種：Th1型和Th2型細胞因子。前者主要包括IL-2、IFN-γ以及TNF-β，主要參與細胞介導免疫；后者主要包括IL-4、IL-5、IL-6、IL8以及IL-10，參與體液介導免疫。在機體發(fā)生炎癥、變態(tài)反應、休克或自身免疫疾病時，某些細胞因子的表達量會大量增加。 IL-2主要由Th1細胞產生，可誘導T細胞增殖，誘導NK細胞和LAK細胞產生IFN-γ、TNF-α等細胞因子，活化巨噬細胞[17]，但在生殖免疫方面，因IL-2不利于胚胎生產，被認為是有害的細胞因子。IL-6 是由多種淋巴細胞和淋巴細胞產生的一種糖蛋白，生物活性多種多樣，參與機體炎癥反應。TNF-α主要由單核巨噬細胞產生，其生物活性十分廣泛，對機體免疫反應、炎癥反應及代謝具有重要的調節(jié)和介導作用。張冬波研究發(fā)現，子宮內膜炎的輕重程度與炎性細胞因子水平有關，奶牛發(fā)生子宮內膜炎后，子宮內膜炎組織中IL-2、IL-6、TNF-α的水平均高于正常奶牛[18]。趙廣興等用混合菌接種法制作慢性盆腔炎動物模型，發(fā)現模型輸卵管局部組織中IL-2 和 IL-6 水平顯著增高[19]。葉贊等通過建立大鼠產后子宮炎癥模型，發(fā)現模型組血清中TNF-α水平顯著升高，益母草能使血清中TNF-α水平顯著下降[20]。本試驗結果顯示，子宮內膜炎家兔模型組血清中IL-2、IL-6與TNF-α表達水平均顯著高于空白對照組，生物堿能顯著降低家兔血清中IL-2、IL-6、TNF-α表達水平，與上述報道一致。

參考文獻：

[1]佘銳萍. 動物病理學[M]. 北京：中國農業(yè)出版社，2007：607-609.

[2]倪鴻韜，王瑜. 復方楊黃灌注液對奶牛子宮內膜炎的藥效試驗[J]. 中國草食動物，2011，31（3）：76-77.

[3]李世宏，嚴作廷，謝家聲，等. “清宮液2號”治療奶牛子宮內膜炎試驗研究[J]. 中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2009，28（6）：32-33.

[4]冀紅，侯曉明，廖磊. 復方益母草膏藥效學實驗研究[J]. 首都醫(yī)藥，2006，8（14）：42-43.

[5]李正國.抗奶牛子宮內膜炎復方中藥的藥理作用研究[D]. 石河子：石河子大學，2009.

[6]孔祥峰，胡元亮，郭振環(huán)，等. 家兔子宮內膜炎模型的建立和臨床病理學觀察[J]. 中國實驗動物學報，2006，14（3）：213-216，封三.

[7]Andreoli S P. Reactive oxygen molecules，oxidant injury and renal disease[J]. Pediatric Nephrology，1991，5（6）： 733-742.

[8]郭紅斌，弓素梅，全軍，等. 加味益母生化栓治療奶牛子宮內膜炎的研究[J]. 中國獸醫(yī)雜志，2008，44（2）：49-50.

[9]李德軍，郭定宗，裴小英.子宮內膜炎奶牛產后氧化損傷與抗氧化變化[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2010，37（4）：174-177.

[10]Kasimanickam R，Duffield T F，Foster R A，et al. Endometrial cytology and ultrasonography for the detection of subclinical endometritis in postpartum dairy cows[J]. Theriogenology，2004，62（1/2）： 9-23.

[11]鄧琪，黃美景，郭麗冰，等. 三丫苦抗炎鎮(zhèn)痛作用及機制研究[J]. 中國實驗方劑學雜志，2011，17（4）：125-128.

[12]許偉朋. TNF-α、PGE2和MMP-9在膝骨關節(jié)炎滑膜中的表達及意義[D]. 鄭州：鄭州大學，2012.

[13]吳紅娟，孫必強，朱傳湘，等. 鹽酸青藤堿對家兔骨關節(jié)炎關節(jié)液IL-1β、PGE2生成與關節(jié)組織結構的影響[J]. 湖南中醫(yī)藥大學學報，2010，30（9）：84-86.

[14]王力民，湯慧. 骨性關節(jié)炎患者關節(jié)囊滑液MMP-3、PGE2檢測的臨床意義[J]. 放射免疫學雜志，2010，23（1）：59-61.

[15]李曉紅，齊云，蔡潤蘭，等. 甘草總皂苷抗炎作用機制研究[J]. 中國實驗方劑學雜志，2010，16（5）：110-113.

[16]韓召敏，華小黎，呂永寧，等. 拔葜抗炎作用及對炎癥介質的影響[J]. 中華中醫(yī)藥學刊，2008，26（2）：295-297.

[17]金伯泉，金伯泉. 細胞和分子免疫學[M]. 西安：世界圖書出版西安公司，1995：95-135.

[18]張冬波. 奶牛子宮內膜炎組織相關因子的研究[D]. 哈爾濱：東北農業(yè)大學，2006.

[19]趙廣興，馬寶璋，袁家麟. 慢性盆腔炎輸卵管病理與IL-2 IL-6的關系[J]. 遼寧中醫(yī)雜志，2003，30（9）：704-705.

[20]葉贊，王若光. 益母草對產后子宮內膜炎大鼠內膜止血修復的實驗研究[J]. 藥物評價研究，2012，35（4）：246-249.黃勇，吳德華，宋珍華，等. 德國牧羊犬與史賓格犬性情行為的比較[J]. 江蘇農業(yè)科學，2015，43（1）：212-213，223.