3種觀賞石斛蒴果特征及無菌播種萌發(fā)的影響因素

龔建英　王華新　陳寶玲　等

摘要：針對大苞鞘石斛、腫節(jié)石斛、報春石斛在引種地進行人工輔助授粉，蒴果存在假膨現(xiàn)象、種子量少、種胚發(fā)育不良、無菌萌發(fā)率低等問題，對這3種石斛蒴果特征及無菌播種萌發(fā)影響因素進行研究。結(jié)果表明，大苞鞘石斛、腫節(jié)石斛、報春石斛3種觀賞原球莖顏色為綠色或深綠色，石斛蒴果適宜的采摘時間為150 d；采用MS培養(yǎng)基，添加濃度為0.05～0.40 mg/L 6-BA和有機添加物椰汁有利于提高種子的萌發(fā)率，萌發(fā)率最高達90%，種子萌發(fā)時間縮短為 8～14 d。

關鍵詞：觀賞石斛；蒴果特征；無菌播種；萌發(fā)因素

中圖分類號： S682.310.4文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）01-0184-03

收稿日期：2014-03-11

基金項目：廣西自然科學基金（編號：2011GXNSFB018039）；廣西林業(yè)科技專項（編號：桂林科字[2010]第一號）；廣西林業(yè)科學院基本科研業(yè)務費專項（編號：林科201425號）。

作者簡介：龔建英（1978—），女，廣西三江人，碩士，工程師，主要從事園林花卉研究。E-mail：282305221@qq.com。石斛是我國蘭科植物石斛屬（Dendrobium）植物的總稱，全世界有1 500～1 600個原生種，我國正式發(fā)表和鑒定的石斛蘭種類有81種[1]。石斛是傳統(tǒng)的名貴中藥，也是重要的花卉植物，在石斛屬植物野生種中約有1/4可供觀賞，石斛蘭是蘭科植物中觀賞價值較高的四大名蘭之一。大苞鞘石斛（Dendrobium wardianum Warner）花徑大，唇盤具紫黑色斑眼；腫節(jié)石斛（Dendrobium pendulum Roxb）節(jié)腫大，呈優(yōu)美的算珠狀；報春石斛（Dendrobium primulinum Lindl）花瓣淺紫色，具有飄逸美感，均是觀賞價值很高的石斛種類[2]。然而，由于長期采挖，多種石斛原生種已瀕臨滅絕。目前，針對這3種觀賞石斛的研究主要集中在組織培養(yǎng)和快速繁殖，如陳娜等對大苞鞘石斛種子離體萌發(fā)培養(yǎng)及萌發(fā)過程的形態(tài)變化進行研究[2-3]，霍麗麗等對腫節(jié)石斛的無菌播種和快速繁殖技術進行試驗[4]，李媛等以腫節(jié)石斛和報春石斛莖段為外植體，進行組培和離體快繁技術研究[5-6]。有關3種觀賞石斛在引種地種胚發(fā)育不良、無菌播種萌發(fā)率低的影響因素缺乏系統(tǒng)研究。

筆者早期研究表明，大苞鞘石斛、腫節(jié)石斛、報春石斛在引種地經(jīng)人工輔助自交授粉能坐果，但存在假膨現(xiàn)象，種胚發(fā)育不良，種子含水率高、呈團粘連，無菌播種萌發(fā)率低，甚至不萌發(fā)。為更好地保護和利用野生石斛資源，筆者從廣西、云南、海南等地引進大苞鞘石斛、腫節(jié)石斛、報春石斛原生種進行遷地保護，并進行人工輔助自交授粉，對觀賞石斛蒴果特征及無菌播種萌發(fā)的影響因素進行研究，以期利用種子進行無菌播種、擴大繁殖，獲得大量的觀賞石斛遺傳材料和種苗。

1材料與方法

1.1材料

將大苞鞘石斛、腫節(jié)石斛、報春石斛采集引種至廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學研究院園林花卉研究所種質(zhì)創(chuàng)新試驗區(qū)，經(jīng)人工輔助自交授粉，獲得蒴果。

1.2方法

1.2.1蒴果測量以直尺測定蒴果縱徑，以游標卡尺測定蒴果橫徑，膨大率按蒴果橫徑與縱徑的比值計算。

1.2.2蒴果滅菌選取3種觀賞石斛蒴果，去除宿存花被；用75%乙醇擦拭表面，2%HgCl2消毒5 min，無菌水沖洗5～6次，備用。

1.2.3無菌播種無菌條件下，用鑷子將種胚均勻撒播（或點播）于各種培養(yǎng)基上，在光照強度為2 000～3 000 lx、溫度為（24 ± 1） ℃、光照時間為10～12 h/d條件下，離體培養(yǎng) 60 d，統(tǒng)計種胚萌發(fā)率。萌發(fā)率按萌發(fā)面積占培養(yǎng)面積的百分比計算。

1.2.4試驗設計研究不同培養(yǎng)基（MS、1/2MS、花寶1號、花寶2號、N6）、激素種類和濃度（0.2 mg/L NAA，0.05、0.10、0.20、0.40、0、80 mg/L 6-BA）、不同有機添加物（馬鈴薯、蘋果、香蕉、椰汁）、果齡（90、150、270、360、390 d）對3種石斛種胚萌發(fā)的影響。

2結(jié)果與分析

2.1 3種觀賞石斛成熟蒴果及種子特征

由表1可見，大苞鞘石斛蒴果最長，果皮灰綠色，棱不明顯，種子呈灰白色，量少，極少數(shù)分散，多數(shù)發(fā)育不良呈海綿狀粘連；腫節(jié)石斛蒴果膨大率最高，果實飽滿，果皮綠色，具明顯的三棱，種子呈白色，量少，極少數(shù)分散，多數(shù)發(fā)育不良呈海綿狀粘連；報春石斛膨大率最低，果皮深綠色，棱不明顯，種子呈黃色，量極多，含水量大，呈團狀粘連。表13種觀賞石斛成熟蒴果及種子特征

品種名稱蒴果種子形狀顏色棱特征橫徑（cm）縱徑（cm）膨大率顏色數(shù)量特征大苞鞘石斛長橢圓形灰綠色不明顯2.105.40.39灰白色少呈海綿狀粘連腫節(jié)石斛橢圓形綠色具三棱2.234.00.56白色少呈海綿狀粘連報春石斛長橢圓形深綠色不明顯1.424.50.32黃色多呈團狀粘連

2.23種觀賞石斛無菌播種萌發(fā)的影響因素

2.2.1基本培養(yǎng)基對3種石斛種胚萌發(fā)的影響由表2可見，大苞鞘石斛、腫節(jié)石斛、報春石斛種子在MS、1/2MS、花寶1號、花寶2號及N6培養(yǎng)基上均能萌發(fā)，MS培養(yǎng)基萌發(fā)效果最好，種子萌動時間為8～12 d，萌發(fā)率為65%～85%，原球莖顏色為深綠色；1/2MS和花寶2號次之，種子萌動時間為12～14 d，萌發(fā)率為60%～80%，原球莖顏色為綠色至深綠色；花寶1號和N6培養(yǎng)基稍差，種子萌動時間為15～20 d，萌發(fā)率為50%～65%，原球莖顏色為淺綠色至綠色。表2基本培養(yǎng)基對3種觀賞石斛種胚萌發(fā)的影響

（%）MS深綠色1275深綠色1265深綠色8851/2MS深綠色1470綠色1460深綠色1280花寶1號綠色1860淺綠色2050綠色1560花寶2號綠色1470綠色1460綠色1275N6綠色1865淺綠色2055綠色1565注：培養(yǎng)基中共同添加0.5 g/L活性炭、2.0 g/L蛋白胨、25 g/L蔗糖、4.2 g/L瓊脂粉、100 g/L馬鈴薯、0.2mg/L 6-BA。

2.2.2激素種類和濃度對3種石斛種胚萌發(fā)的影響由表3可見，與對照相比，MS培養(yǎng)基中添加適宜濃度的激素可明顯提高3種觀賞石斛種胚的萌發(fā)率，縮短種子萌動時間；添加005～0.40 mg/L 6-BA效果最佳，10～14 d種子萌發(fā)變綠，種子萌發(fā)率最高可達88%；6-BA使用濃度增加至0.8 mg/L，種子萌發(fā)率最高為92%，但原球莖顏色變?yōu)辄S綠色；添加生長素NAA對種胚萌發(fā)促進效果不明顯，種子萌動時間長，需20～25 d，種子萌發(fā)率為40%～60%，原球莖顏色為黃綠色；不添加任何激素的培養(yǎng)基配方，種胚萌發(fā)率低至20%～50%，甚至不萌發(fā)（腫節(jié)石斛）。表3激素種類和濃度對3種觀賞石斛種胚萌發(fā)的影響

激素名稱濃度

（%）NAA0.20黃綠色2550黃綠色2540黃綠色21606-BA0.05深綠色1470綠色1465深綠色12856-BA0.10深綠色1475深綠色1465深綠色12856-BA0.20深綠色1280深綠色1270深綠色10886-BA0.40綠色1280綠色1275綠色10886-BA0.80黃綠色1085黃綠色1075黃綠色892CK0淺綠色3020—綠色2150注：在MS培養(yǎng)基中共同添加0.5 g/L活性炭、2.0 g/L蛋白胨、25 g/L蔗糖、4.2 g/L瓊脂粉、100 g/L馬鈴薯。

2.2.3不同有機添加物對3種石斛種胚萌發(fā)的影響由表4可見，不同的有機添加物對3種觀賞石斛種胚萌發(fā)效果影響明顯，以椰汁的萌發(fā)效果最佳，種子萌動時間短，為7～10 d，萌發(fā)率高，為80%～90%，原球莖顏色為綠色；馬鈴薯和香蕉次之，種子萌動時間為10～15 d，萌發(fā)率為65%～85%，原球莖顏色為綠色至深綠色；蘋果對種子萌發(fā)效果最差，萌發(fā)率低，為20%～70%，萌發(fā)所需時間長，為18～21 d，原球莖顏色為淡黃色。表4不同有機添加物對3種觀賞石斛種胚萌發(fā)的影響

有機添加物大苞鞘石斛腫節(jié)石斛報春石斛原球莖

顏色種子萌動

時間（d）萌發(fā)率

（%）原球莖

顏色種子萌動

時間（d）萌發(fā)率

（%）原球莖

顏色種子萌動

時間（d）萌發(fā)率

（%）馬鈴薯深綠色1280深綠色1470深綠色1085蘋果淡黃色2140淡黃色2120淡黃色1870香蕉綠色1570綠色1465綠色1285椰汁綠色1085綠色1080綠色790注：MS培養(yǎng)基中共同添加0.5 g/L活性炭、2.0 g/L蛋白胨、25 g/L蔗糖、4.2 g/L瓊脂粉、0.2 mg/L 6-BA。

2.2.4果齡對3種石斛種胚萌發(fā)的影響分別于人工授粉后90、150、270、360、390 d采集3種觀賞石斛種子進行無菌播種。由表5可見，在果齡90 d時，3種石斛種胚無菌培養(yǎng)20 d后開始褐化，不能萌發(fā)；150 d至390 d果齡的種子均能正常萌發(fā)；果齡150 d時，大苞鞘石斛、腫節(jié)石斛、報春石斛的萌發(fā)率分別為80%、75%、88%，較果齡270 d時種子萌發(fā)率略低；果齡在270 d至390 d，3種石斛種子萌發(fā)率較高，萌發(fā)率為80%～90%。表5果齡對3種觀賞石斛種胚萌發(fā)的影響

果齡

（d）大苞鞘石斛腫節(jié)石斛報春石斛原球莖

顏色種子萌動

時間（d）萌發(fā)率

（%）原球莖

顏色種子萌動

時間（d）萌發(fā)率

（%）原球莖

顏色種子萌動

時間（d）萌發(fā)率

（%）90——0——0——0150綠色1480綠色1475深綠色1288270綠色1485綠色1480深綠色1290360綠色1485綠色1480深綠色1290390綠色1485綠色1480深綠色1290注：培養(yǎng)基配方均為MS+0.5 g/L活性炭+2.0 g/L蛋白胨+25 g/L蔗糖+4.2 g/L瓊脂粉+ 0.2 mg/L 6-BA。

3結(jié)論

大苞鞘石斛和腫節(jié)石斛在種子達到成熟期后，均呈白色、量少，種子聚集成團，極少數(shù)分散，與胎座等組織緊密貼生，多數(shù)發(fā)育不良，呈海綿狀粘連，比報春石斛的種胚發(fā)育差，萌發(fā)率低，萌發(fā)時間長；報春石斛種子呈黃色，量多，無明顯的胎座等組織，但種子含水量高，呈團狀粘連，其種胚發(fā)育相對較好，萌發(fā)率高，萌發(fā)時間相對較短。

石斛種子內(nèi)部生理對其種胚萌發(fā)具有重要的影響[7]。3種觀賞石斛不同果齡的種胚處于不同發(fā)育期，對種胚萌發(fā)產(chǎn)生明顯的影響，人工授粉90 d種子，無菌播種20 d，種胚褐化，不能萌發(fā)，這說明種胚尚未成熟；果齡150～390 d時，提供適宜的培養(yǎng)基，種子均能正常萌發(fā)，這時可采摘蒴果進行無菌播種。目前，石斛蒴果貯藏存在保存時間短、容易腐爛霉變、種子干燥操作繁瑣、滅菌困難等問題。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，3種觀賞石斛在授粉后390 d內(nèi)，蒴果未開裂，且具有較高的萌發(fā)率。因此，根據(jù)無菌播種和育苗時間需要，采摘蒴果時間可延遲至授粉后390 d。

石斛種胚萌發(fā)還受培養(yǎng)條件的影響。采用MS培養(yǎng)基，3種觀賞石斛種子萌發(fā)效果最佳，這可能與MS培養(yǎng)基營養(yǎng)元素比較全面有關；添加天然椰汁對石斛種子的萌發(fā)效果最好，但由于椰汁價格較貴，且不易就地取材，添加有機物馬鈴薯對石斛種子萌發(fā)效果與椰汁差異不大，且價格便宜、容易獲取，因此可以使用馬鈴薯代替椰汁進行石斛規(guī)?；N苗繁育，有利于降低生產(chǎn)成本；濃度為0.05～0.40 mg/L 6-BA有利于觀賞石斛種胚的萌發(fā)，萌發(fā)率最高達88%，萌發(fā)時間縮短為10～14 d，原球莖顏色為綠色或深綠色，但如果6-BA使用濃度繼續(xù)提高，石斛種子萌發(fā)率雖然有所上升，但原球莖質(zhì)量變差，顏色變?yōu)辄S綠色。

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