假臭草殺蟲(chóng)成分的微波輔助提取及生物活性

李水清　張琳琳

摘要：在微波加熱條件下，以石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醇為溶劑對(duì)假臭草葉干粉進(jìn)行提取，研究了上述溶劑提取物對(duì)蓼藍(lán)齒脛葉甲幼蟲(chóng)的觸殺、胃毒及拒食活性的影響。研究結(jié)果表明，各溶劑提取物對(duì)蓼藍(lán)齒脛葉甲幼蟲(chóng)均具有一定的觸殺、胃毒和拒食活性，其中以乙醇提取物的觸殺作用最強(qiáng)，處理后48 h的校正死亡率達(dá)到39.22%；丙酮提取物的胃毒活性和拒食活性最強(qiáng)，處理48、72 h后分別達(dá)到 45.27%、46.67%。

關(guān)鍵詞：：假臭草；蓼藍(lán)齒脛葉甲；觸殺；胃毒；拒食

中圖分類(lèi)號(hào)：S482.3+9文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）01-0136-03

收稿日期：2014-03-09

基金項(xiàng)目：湖北省教育廳科研項(xiàng)目（編號(hào)：Q200712003）；長(zhǎng)江大學(xué)博士科研基金。

作者簡(jiǎn)介：李水清（1969—），男，湖北仙桃人，博士，教授，從事化學(xué)生態(tài)學(xué)和害蟲(chóng)綜合治理研究。E-mail：shuiqing2000@163.com。假臭草（Eupatorium catarium）是菊科澤蘭屬一年生草本植物。在國(guó)內(nèi)，假臭草于20世紀(jì)80年代在香港首次被發(fā)現(xiàn)，但一直被誤認(rèn)為是熊耳草（Ageratum houstonianum Mill），直到1995年才被鑒定。上世紀(jì)90年代假臭草開(kāi)始在深圳出現(xiàn)，現(xiàn)在已經(jīng)占領(lǐng)了廣東、福建、澳門(mén)、香港、臺(tái)灣、海南等沿海地區(qū)大部分荒坡、荒地、灘涂、林地、果園。由于假臭草對(duì)土壤肥力的吸收力強(qiáng)，會(huì)極大地消耗土壤養(yǎng)分，因此對(duì)土壤可耕性的破壞極為嚴(yán)重，嚴(yán)重影響林木的生長(zhǎng)[1-2]。假臭草含有許多具有生物活性的次生代謝產(chǎn)物，如鄧世明等從假臭草的70%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物中分離得到5種黃酮化合物[3]。假臭草揮發(fā)油對(duì)許多植物種子萌發(fā)和生長(zhǎng)具有抑制作用，如鄧世明等研究表明高濃度的假臭草超聲提取液能顯著抑制小粒的種子萌發(fā)，抑制植物幼根的生長(zhǎng)[4]；林成俊等在假臭草中分離、鑒定出一種全順-環(huán)己烷-1，2，4-三醇的物質(zhì)，該物質(zhì)能抑制蘿卜和小白菜種子的萌發(fā)[5]。假臭草的揮發(fā)油還能對(duì)昆蟲(chóng)和真菌能產(chǎn)生忌避或抑制作用[4]，如假臭草的甲醇與乙醇的提取物均對(duì)螺旋粉虱成蟲(chóng)、荔枝粗脛翠尺蛾具有較強(qiáng)的殺蟲(chóng)活性和拒食活性[7-8]，岑伊靜等發(fā)現(xiàn)假臭草揮發(fā)油對(duì)柑橘木虱成蟲(chóng)也有顯著的驅(qū)避作用[9]。本試驗(yàn)在微波加熱條件下，以石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醇為溶劑分別對(duì)假臭草中的生物活性物質(zhì)進(jìn)行提取，并研究了各溶劑提取物對(duì)蓼藍(lán)齒脛葉甲的觸殺、胃毒及拒食活性的影響，旨在為充分利用植物資源、開(kāi)發(fā)與環(huán)境相適應(yīng)的生物農(nóng)藥提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1植物材料野生假臭草采自長(zhǎng)江大學(xué)周邊，洗凈，取其葉，自然風(fēng)干，然后在60 ℃恒溫干燥箱中干燥8 h，粉碎，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2供試?yán)ハx(chóng)蓼藍(lán)齒脛葉甲（Gastrolphysa atrocyanea）幼蟲(chóng)，采集于荊州護(hù)城河畔皺葉酸模上，室內(nèi)飼養(yǎng)后挑選整齊一致的幼蟲(chóng)供試。室內(nèi)飼養(yǎng)條件：溫度（27±1） ℃，空氣相對(duì)濕度（80±5）%，光-暗周期14 h-10 h。

1.1.3主要儀器微電腦微波化學(xué)反應(yīng)器WBFY-201（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；DNP-9052BS-Ⅲ電熱恒溫培養(yǎng)箱、QHX-250BS-Ⅲ人工氣候箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）。

1.1.4化學(xué)試劑石油醚、乙酸乙酯（分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠），三氯甲烷、丙酮（分析純，武漢市中天化工有限責(zé)任公司），乙醇（分析純，安徽安特生物化學(xué)有限公司）；瓊脂粉（化學(xué)純，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；十二烷基磺酸鈉（分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）。

1.2方法

1.2.1微波輔助提取準(zhǔn)確稱(chēng)取10 g假臭草葉干粉，分為5 份，分別放入 100 mL圓底燒瓶中，往燒瓶中分別加入 40 mL石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醚。將燒瓶放入微電腦微波化學(xué)反應(yīng)器中，并安裝好冷凝裝置，提取5 min。將提取液減壓抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至稠膏狀為止。將稠膏狀提取物用丙酮稀釋后轉(zhuǎn)入 50 mL容量瓶中，加入10 mL 0.1% 十二烷基磺酸鈉，配制成40 mg/mL的丙酮溶液，供試。

1.2.2觸殺活性的測(cè)定采用點(diǎn)滴法[10]，即將各溶劑提取物用微量點(diǎn)滴器點(diǎn)滴于試蟲(chóng)的前胸背板，每蟲(chóng)點(diǎn)滴1 μL，以用0.1%十二烷基磺酸鈉水溶液稀釋后的丙酮溶液為對(duì)照。處理后的幼蟲(chóng)置于培養(yǎng)皿（內(nèi)墊濾紙，加少許蒸餾水保濕）中，每皿接入大小基本一致的蓼藍(lán)齒脛葉甲幼蟲(chóng)20頭，以保鮮膜封口，膜上打孔以利通風(fēng)透氣，每個(gè)處理重復(fù)3 次。于處理后12、24、36、48 h后分別檢查并記錄死亡情況。以毛筆尖碰觸幼蟲(chóng)腹部的末端，頭部不能擺動(dòng)，身體不能向前爬行判為死亡的標(biāo)記。計(jì)算死亡率、校正死亡率，用DPS軟件分析數(shù)據(jù)。

死亡率=死蟲(chóng)數(shù)/供試蟲(chóng)數(shù)×100%；

校正死亡率=（處理組死亡率-對(duì)照組死亡率）/（1-對(duì)照組死亡率）×100%。

1.2.3胃毒活性的測(cè)定采用帶毒夾片法[11]，即取皺葉酸模葉片，洗凈后，用直徑3.0 cm的打孔器打成直徑為3.0 cm的葉碟，取2片同樣大小的皺葉酸模葉碟，在其中一片的背面用醫(yī)用脫脂棉均勻涂抹不同溶劑的假臭草提取液（40 mg/mL），在另一片的正面涂上瓊脂（瓊脂粉加水煮沸調(diào)配而成），迅速將2片葉碟對(duì)合，制成帶毒夾片。將帶毒夾片置于培養(yǎng)皿（內(nèi)墊濾紙，加少許蒸餾水保濕）中，每皿放8個(gè)帶毒夾片，接入大小基本一致的蓼藍(lán)齒脛葉甲幼蟲(chóng)20頭。以保鮮膜封口，膜上打孔以利通風(fēng)透氣。以用0.1%十二烷基磺酸鈉水溶液稀釋后的丙酮溶液為溶劑對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。于處理24、48、60、72 h后后分別檢查并記錄蓼藍(lán)齒脛葉甲幼蟲(chóng)死亡情況，計(jì)算死亡率、校正死亡率。

1.2.4拒食活性的測(cè)定采用小葉碟法[12]，即取皺葉酸模葉片，洗凈后用直徑1.5 cm的打孔器打成直徑為1.5 cm的葉碟，分別浸漬于不同溶劑的假臭草提取液（40 mg/mL）中3 s，取出后用吸水紙吸取葉碟邊緣的多余藥液，放入培養(yǎng)皿（內(nèi)墊濾紙，加少許蒸餾水保濕）中，每皿放50片葉碟，接入20只試蟲(chóng)。以保鮮膜封口，膜上打孔以利通風(fēng)透氣。以用0.1%十二烷基硫酸鈉水溶液稀釋后的丙酮溶液為溶劑對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。于處理12、24、36、48 h后分別調(diào)查取食情況，計(jì)算取食指數(shù)和拒食率。按下面的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)及公式統(tǒng)計(jì)計(jì)算。

零級(jí)：無(wú)取食痕跡；Ⅰ級(jí)：零星取食；Ⅱ級(jí)：有明顯取食缺刻；Ⅲ級(jí)：取食面積約占1/3；Ⅳ級(jí)：取食面積約占1/2；Ⅴ級(jí)：取食面積約占3/4；Ⅵ級(jí)：僅留下少量殘?jiān)?/p>

取食指數(shù)=∑（危害級(jí)別×各級(jí)葉碟數(shù)）總?cè)~碟數(shù)×最高級(jí)別×參試總蟲(chóng)數(shù)×100%；

拒食率=對(duì)照取食指數(shù)-處理取食指數(shù)對(duì)照取食指數(shù)×100%。

2結(jié)果與分析

2.1假臭草各溶劑提取物對(duì)蓼藍(lán)齒脛葉甲幼蟲(chóng)的觸殺活性

微波加熱條件下，假臭草各溶劑提取物對(duì)蓼藍(lán)齒脛葉甲幼蟲(chóng)的觸殺活性見(jiàn)表1。從表1可看出，在微波輔助加熱條件下，5種溶劑的假臭草提取物在濃度為 40 mg/mL時(shí)， 對(duì)蓼

表1假臭草各溶劑提取物對(duì)蓼藍(lán)齒脛葉甲幼蟲(chóng)觸殺活性的影響

藍(lán)齒脛葉甲幼蟲(chóng)均有一定的觸殺活性。處理12、24、36、48 h后，均以乙醇提取物的觸殺活性最強(qiáng)，與其他幾種溶劑提取物相比，觸殺活性存在顯著差異，而石油醚提取物的觸殺活性最弱。此外，隨時(shí)間的增加，各溶劑提取物的觸殺活性均有增強(qiáng)趨勢(shì)。

2.2假臭草各溶劑提取物對(duì)蓼藍(lán)齒脛葉甲幼蟲(chóng)的胃毒活性

假臭草各溶劑提取物對(duì)蓼藍(lán)齒脛葉甲幼蟲(chóng)的胃毒活性見(jiàn)表2。由表2可看出，5種溶劑的假臭草提取物在濃度為 40 mg/mL，處理24、48、60、72 h后均對(duì)蓼藍(lán)齒脛葉甲幼蟲(chóng)表現(xiàn)一定的胃毒活性，以丙酮提取物的胃毒活性最強(qiáng)，處理后 72 h 校正死亡率為46.67%。

表2假臭草各溶劑提取物對(duì)蓼藍(lán)齒脛葉甲幼蟲(chóng)胃毒活性的影響

2.3假臭草各溶劑提取物對(duì)蓼藍(lán)齒脛葉甲幼蟲(chóng)的拒食活性

假臭草各溶劑提取物對(duì)蓼藍(lán)齒脛葉甲幼蟲(chóng)的拒食活性見(jiàn)表3。從表3可看出，假臭草的丙酮提取物對(duì)蓼藍(lán)齒脛葉甲幼蟲(chóng)的拒食活性最強(qiáng)。

3結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，在微波輔助加熱條件下，石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醇的假臭草葉提取物對(duì)蓼藍(lán)齒脛葉甲幼蟲(chóng)均表現(xiàn)出一定的觸殺、胃毒和拒食活性。其中，以乙醇提取物的觸殺作用最強(qiáng)，而丙酮提取物的胃毒活性和拒食活性最強(qiáng)。今后將對(duì)假自草乙醇和丙酮提取物進(jìn)行分離、提純，鑒定出具有殺蟲(chóng)活性的物質(zhì)，開(kāi)發(fā)與環(huán)境相適應(yīng)的植物源農(nóng)藥。

表3假臭草各溶劑提取物對(duì)蓼藍(lán)齒脛葉甲幼蟲(chóng)拒食活性的影響

參考文獻(xiàn)：

[1]Huang Q Q，Wu J M，Bai Y Y，et al. Identifying the most noxious invasive plants in China：role of geographical origin，life form and means of introduction[J]. Biodiversity and Conservation，2009，18（2）：305-316.

[2]Weber E，Sun S G，Li B. Invasive alien plants in China：diversity and ecological insights[J]. Biological Invasions，2008，10（8）：1411-1429.

[3]鄧世明，楊先會(huì)，王 寧，等. 外來(lái)入侵植物假臭草的黃酮類(lèi)成分研究[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，2009，29（12）：2548-2550.

[4]鄧世明，王寧，湯麗昌，等. 外來(lái)入侵植物假臭草的化感作用研究[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26（16）：277-280.

[5]林成俊，郭煥佳，龐淇尹. 入侵植物假臭草化感物質(zhì)的分離及鑒定[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（9）：3497-3498.

[6]王真輝，安鋒，陳秋波. 外來(lái)入侵雜草——假臭草[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，26（6）：33-37.

[7]鐘寶珠，呂朝軍，孫曉東，等. 青葙提取物對(duì)螺旋粉虱的殺蟲(chóng)活性研究[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，2010，31（11）：2025-2029.

[8]成家寧，陳炳旭，曾鑫年，等. 14種植物乙醇提取物對(duì)荔枝粗脛翠尺蛾成蟲(chóng)產(chǎn)卵和幼蟲(chóng)取食的影響[J]. 果樹(shù)學(xué)報(bào)，2011，28（2）：290-295.

[9]岑伊靜，葉峻銘，徐長(zhǎng)寶，等. 柑橘木虱對(duì)幾種非嗜食植物揮發(fā)油的趨性反應(yīng)測(cè)定[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，26（3）：41-44.

[10]慕立義. 植物化學(xué)保護(hù)研究方法[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1994：54-60.

[11]吳文君. 植物化學(xué)保護(hù)實(shí)驗(yàn)技術(shù)導(dǎo)論[M]. 西安：陜西科學(xué)技術(shù)出版社，1988：43-49.

[12]張興，趙善歡. 楝科植物對(duì)幾種害蟲(chóng)的拒食和忌避作用[J]. 華南農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，1983，4（3）：1-7.李屹，韓睿，王麗慧，等. 菊芋葉片提取物對(duì)辣椒疫霉菌的抑菌效果及盆栽驗(yàn)證試驗(yàn)[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（1）：139-141.