腺相關(guān)病毒載體：通往腫瘤基因治療的橋梁

陳秀生1 林創(chuàng)珍2 雷川1 翟向明1 聶鑫1 胡奧1 陳思1 杜紅延1★

腺相關(guān)病毒載體：通往腫瘤基因治療的橋梁

陳秀生1 林創(chuàng)珍2 雷川1 翟向明1 聶鑫1 胡奧1 陳思1 杜紅延1★

腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus，AAV）是一種有缺陷的非致病的人類細(xì)小病毒。腺相關(guān)病毒載體作為基因治療的載體，對長期基因矯正和基因治療具有一定優(yōu)越性。由于其低致病性、易操作性等優(yōu)點，腺相關(guān)病毒載體被作為轉(zhuǎn)導(dǎo)目的基因的理想載體，現(xiàn)已廣泛地應(yīng)用于多種腫瘤等疾病的基因治療研究中。通過對腺相關(guān)病毒載體的改造優(yōu)化，增加其靶向性，減少免疫原性，有望為相關(guān)疾病的基因治療研究提供新的手段和方法。本文就目前腺相關(guān)病毒在腫瘤治療中的應(yīng)用研究加以綜述，旨在對病毒載體在腫瘤生物治療領(lǐng)域中的應(yīng)用提供相應(yīng)的參考。

腺相關(guān)病毒；基因治療；應(yīng)用；研究進(jìn)展

基因治療是生物治療的重要組成部分，是指將外源正?；?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補償缺陷基因原本的功能，從而達(dá)到治療分子病的生物治療方法［1］。該療法作為一種全新的醫(yī)療手段日益引起人們的重視，具有良好的應(yīng)用前景。該治療方法的關(guān)鍵在于尋找有效的治療基因以及如何將安全的治療基因通過合適的載體運送到靶細(xì)胞［2］。傳統(tǒng)基因載體分為病毒載體和非病毒載體2類。一般來說，病毒類載體在表達(dá)強度和組織靶向性方面比非病毒類載體優(yōu)越。

腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus，AAV）是一種有缺陷的非致病的人類細(xì)小病毒，作為基因治療的載體，對長期基因矯正和基因治療具有顯著優(yōu)越性，有著良好的應(yīng)用前景［3］。腺相關(guān)病毒載體是生物技術(shù)產(chǎn)品，可發(fā)揮較強的抗腫瘤作用，且誘發(fā)的免疫反應(yīng)極低，其臨床應(yīng)用符合相關(guān)規(guī)定，因此腺相關(guān)病毒載體已廣泛被應(yīng)用于癌癥、白血病、艾滋病的治療研究，并已獲得美國食品藥物管理署（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)，進(jìn)入了臨床試驗［4］。本文主要就腺相關(guān)病毒載體作一綜述，討論其特點、制備方法、不同的改進(jìn)策略以及在腫瘤基因治療領(lǐng)域應(yīng)用的研究進(jìn)展。

1　腺相關(guān)病毒載體

1.1腺相關(guān)病毒載體的結(jié)構(gòu)

AAV是一種簡單的非致病性的單鏈DNA病毒，其不自我復(fù)制而是依賴于輔助病毒如腺病毒（adenovirus，Ad）或單純孢疹病毒（herpes simplex virus，HSV）來進(jìn)行復(fù)制［5］。AAV基因組長4 675 bp，兩側(cè)是145 bp長的對病毒的復(fù)制和包裝具有決定性作用的倒轉(zhuǎn)末端重復(fù)序列（inverted terminal repeats，ITRs），其中外側(cè)的125個核苷酸呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)，在復(fù)制時有弱啟動子作用，中間基因組編碼兩個蛋白：作為病毒衣殼蛋白的Cap蛋白和參與病毒復(fù)制整合的Rep蛋白。Rep蛋白能幫助病毒基因組整合到人類第19號染色體的AAVS1位點［6］。

1.2腺相關(guān)病毒載體的安全性

腺相關(guān)病毒載體是利用天然存在的腺相關(guān)病毒某些特征經(jīng)過基因工程改造后產(chǎn)生的一種可供人工轉(zhuǎn)基因方向應(yīng)用的載體。源于非致病的野生型腺相關(guān)病毒的重組腺相關(guān)病毒載體，通過改造后其具有安全性好、宿主細(xì)胞范圍廣、免疫原性低等特點［7］，有很大的應(yīng)用前景，在基因治療和疫苗研發(fā)中得到廣泛應(yīng)用。腺相關(guān)病毒載體與人類已知疾病沒有關(guān)聯(lián)，流行病學(xué)資料表明，世界各地大多數(shù)人感染過野生型AAV［8］，尚無證據(jù)表明AAV的感染與某種疾病的發(fā)生有關(guān)［9］。另一方面，腺相關(guān)病毒載體能轉(zhuǎn)導(dǎo)外源基因進(jìn)入非分裂細(xì)胞，長期表達(dá)外源基因，其現(xiàn)已逐漸成為主流的高效基因轉(zhuǎn)移載體，用于神經(jīng)肌肉基因治療、神經(jīng)退行性病變基因治療等方面［10］。為了提高腺相關(guān)病毒載體的安全性，改進(jìn)措施不斷被提出。有研究表明，去掉所有腺病毒基因部分的載體比單純只刪掉E1區(qū)域的腺相關(guān)病毒載體能夠裝載更大的外源基因，并減少了細(xì)胞毒性反應(yīng)和免疫原反應(yīng)。刪除腺相關(guān)病毒載體的末端反向重復(fù)序列能夠減少靶基因在宿主細(xì)胞內(nèi)的隨機整合［11］。這些改造措施都極大的增強了腺相關(guān)病毒載體的安全性。

1.3腺相關(guān)病毒載體的靶向性

腺相關(guān)病毒載體對不同組織器官的感染效率不同，例如其相較于淋巴細(xì)胞、造血干細(xì)胞等更偏愛于侵染骨骼肌、肝細(xì)胞［12］。腺相關(guān)病毒具有多種血清型，在體內(nèi)能成功轉(zhuǎn)導(dǎo)多種組織，目前已有數(shù)種不同血清型的AAV用于基因治療研究。體內(nèi)外實驗均證明，不同的AAV血清型具有不同的組織或細(xì)胞特異性［13］，可利用AAV血清型的不同以及所轉(zhuǎn)導(dǎo)的組織不同來進(jìn)行靶向治療，其中AAV8對肝臟的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率最高［14］，肌內(nèi)注射AAV5相較于使用AAV2載體更能增加分泌型轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的血清水平，AAV1載體比AAV5載體更能有效的轉(zhuǎn)導(dǎo)外源基因到肌肉細(xì)胞，AAV2載體是目前在臨床上運用最為廣泛的血清型［15］。研究表明，可以通過基因改造技術(shù)來使特異性配體表達(dá)于病毒衣殼表面，通過配體與靶組織表面受體特異性結(jié)合，從而使AAV載體擁有組織特異性，增強其靶向性。同樣，用特定多肽替換AAV結(jié)構(gòu)蛋白的環(huán)VI區(qū)域能夠使AAV載體靶向更廣泛的細(xì)胞株，如使AAV2載體靶向小鼠黑色素瘤細(xì)胞，這是野生型AAV2載體無法做到的［16］。并且有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，對不同血清型的腺相關(guān)病毒部分單個氨基酸進(jìn)行突變可以提高靶器官的感染效率［17-18］，這給基因治療發(fā)展又提供了一個有力的支持。

1.4腺相關(guān)病毒載體的制備

腺相關(guān)病毒載體的制備和純化工藝在很大程度上決定了最終產(chǎn)品的性質(zhì)和異物含量。異物主要于腺相關(guān)病毒載體的準(zhǔn)備階段引入，包括宿主細(xì)胞蛋白、哺乳動物DNA和其他污染物，這些會影響最終產(chǎn)品的免疫原性。現(xiàn)階段，唯一能應(yīng)用于人類血管內(nèi)高劑量注射的AAV載體來源于HEK293細(xì)胞的三重轉(zhuǎn)染，多用于治療血友病B［17］。通過其它技術(shù)如桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)或借助輔助病毒制備的病毒載體同樣可用于人類疾病的治療，但基本都是通過肌內(nèi)或視網(wǎng)膜下注射［19］。除了使用宿主細(xì)胞平臺來制備AAV載體，另一個決定載體品質(zhì)高低的關(guān)鍵因素是下游純化過程。一般來說，柱層析法并不適合分離空的病毒衣殼，而在純化過程中加入梯度離心步驟能有效提高分離病毒衣殼的效率［20］。

除了選擇表達(dá)系統(tǒng)和純化手段以外，構(gòu)建腺相關(guān)病毒載體也有一定的要求，包括治療基因的長度不能過大，AAV的總?cè)萘繛?.7kb；不需要目的基因立刻表達(dá)；不需要基因高水平表達(dá)等。為了增加AAV介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，可以構(gòu)建自身互補AAV（self-complementary adeno-associated virus，scAAV）載體，其含有雙鏈DNA，越過了第二鏈合成的障礙，但其包裝容量只是傳統(tǒng)單鏈AAV包裝容量（4.8 kb）的一半［21］。

腺相關(guān)病毒載體能夠高效的把外源DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)。為進(jìn)一步提高腺相關(guān)病毒載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，還可對其進(jìn)行優(yōu)化改造。其中通過修飾病毒衣殼而改變靶向性，或是制造重組載體來提升將外源DNA插入到染色體的效率，這些都能夠有效提升腺相關(guān)病毒載體的性能［22］。

2　腺相關(guān)病毒載體在腫瘤基因治療中的研究進(jìn)展

AAV因其獨特的生物學(xué)性狀，與以往的幾種病毒載體相比具有許多優(yōu)點：低致病性、低免疫原性、易操作等，尤其是可長期穩(wěn)定表達(dá)外源基因的特點能夠彌補腺病毒載體只能短期表達(dá)的不足。由此，其已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多種腫瘤的基因治療研究中。

2.1腺相關(guān)病毒載體與肺癌

廣泛的研究表明新生血管的形成在實體惡性腫瘤的生長和侵襲中起關(guān)鍵作用，如果離開新血管系統(tǒng)的維持，腫瘤的直徑只能保持在幾毫米以內(nèi)，因而抑制血管形成的治療手段成為腫瘤治療中很有前景的方案。血管形成是促進(jìn)和抑制因子之間的平衡調(diào)控，利用腺相關(guān)病毒載體過表達(dá)血管生成抑制因子可以對抗腫瘤引起的血管生成，從而有效抑制腫瘤的增殖［23］。色素上皮源性因子（pigment epithelium-derived factor，PEDF）是一個50 kDa分泌性糖蛋白，屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族，但沒有蛋白酶抑制劑的活性。PEDF能夠通過Fas/Fas-L途徑激活上皮細(xì)胞的凋亡，并且打破促進(jìn)和抑制血管生成因子之間的平衡，從而對腫瘤血管的生成產(chǎn)生強烈的抑制作用［24］。He［25］等人檢測了AAV介導(dǎo)的腫瘤內(nèi)表達(dá)PEDF對Lewis肺癌的抑制效果，將Lewis肺癌細(xì)胞用藻酸鹽包被成微球后移植到C57BL/6小鼠背部，次日向小鼠注射AAV-PEDF并構(gòu)建對照組，11天后取出微球離心測量上清的熒光強度，發(fā)現(xiàn)AAV-PEDF處理的小鼠熒光強度較于對照組組顯著降低，并且發(fā)現(xiàn)AAV-PEDF處理的小鼠中微血管密度降低73％，同時腫瘤體積降低58％，從而說明PEDF能夠顯著抑制Lewis肺癌組織血管的形成，進(jìn)而抑制腫瘤增殖。腺相關(guān)病毒載體表達(dá)PEDF的治療手段在肺癌的治療中有重要的意義和良好的前景。

2.2腺相關(guān)病毒載體與神經(jīng)膠質(zhì)瘤

神經(jīng)膠質(zhì)瘤亦稱膠質(zhì)細(xì)胞瘤，是發(fā)生于神經(jīng)外胚層的腫瘤。由于腫瘤浸潤性生長，與腦組織間無明顯邊界，難以做到全部切除，治愈難度大，近期運用基因治療作為替代治療方案取得了令人期待的效果［26］。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和腺相關(guān)病毒載體是運用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療最主要的基因治療載體。主流的基因治療方法包括：把無毒的酶導(dǎo)入到腫瘤細(xì)胞內(nèi)，該酶能夠把藥物前體轉(zhuǎn)化為有毒的化合物從而殺死腫瘤細(xì)胞；通過病毒載體使特定毒素大量表達(dá)，該毒素針對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞表面特定受體，從而使腫瘤細(xì)胞死亡；通過病毒載體使細(xì)胞因子如GM-CSF等過量表達(dá)，激活T細(xì)胞免疫或動員樹突狀細(xì)胞，增強免疫反應(yīng)，達(dá)到治療效果［27］。腺相關(guān)病毒載體因為其安全和高效性在對神經(jīng)膠質(zhì)瘤基因治療中發(fā)揮重要作用。Zolotukhin等［28］為了提高腺相關(guān)病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)基因進(jìn)入神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的能力，設(shè)計出2種改善AAV的方案，其一是去掉AAV2衣殼表面暴露的酪氨酸殘基，因為磷酸化的酪氨酸殘基是遍在化的一個信號，去掉酪氨酸殘基后減弱了蛋白酶體降解活性從而有利于病毒載體向細(xì)胞核定位，進(jìn)而增強了基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率；其二是ShH19，即改組的AAV2，部分序列是來自其他血清型的病毒。研究發(fā)現(xiàn)改變衣殼的腺相關(guān)病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)外源基因進(jìn)入神經(jīng)膠質(zhì)瘤GL261細(xì)胞的能力顯著增強，腺相關(guān)病毒載體在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的基因治療中發(fā)揮著重大作用，前景看好。

2.3腺相關(guān)病毒載體與胰腺導(dǎo)管腺癌

胰腺導(dǎo)管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）是常見的胰腺腫瘤，是一種惡性程度高、診斷和治療都很困難的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率逐年上升。運用腺相關(guān)病毒載體進(jìn)行基因治療，把治療基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入PDAC細(xì)胞中，是目前治療胰腺癌的一種很有前景的方法。通過修飾病毒衣殼表面，使其展示一種特異性結(jié)合網(wǎng)蛋白-1的多肽，從而使基因改造的AAV2載體能夠特異性靶向PDAC細(xì)胞［29］。這種特異性結(jié)合網(wǎng)蛋白-1的多肽（plectin-1 targeting peptide，PTP）被插入到AAV2衣殼的環(huán)Ⅵ區(qū)域，Konkalmatt等人［30］檢測了重組載體體內(nèi)和體外實驗的轉(zhuǎn)導(dǎo)效果，發(fā)現(xiàn)AAV2-PTP相較于非胰腺細(xì)胞能夠更好的靶向人類PDAC細(xì)胞，包括PANC-1、MIAPaCa-2、HPAC等胰腺細(xì)胞株。AAV-PTP對PANC-1腫瘤移植物的親嗜性是其他組織的37倍左右。改造后的AAV載體并不整合入宿主的染色體，而是作為穩(wěn)定的游離基因長期進(jìn)行基因表達(dá)。綜上所述，腺相關(guān)病毒載體介導(dǎo)的基因治療在胰腺癌的治療中具有相當(dāng)?shù)臐摿Α?/p>

2.4腺相關(guān)病毒載體與宮頸癌

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤，近年來其發(fā)病有年輕化的趨勢。盡管宮頸癌的發(fā)病率和死亡率已有明顯下降，但仍是全球婦女中僅次于乳腺癌和結(jié)直腸癌的第三個常見的惡性腫瘤［31］。LIGHT是腫瘤壞死因子超家族中的一種配體，能夠在腫瘤位點構(gòu)建淋巴樣組織并且能招募初始T細(xì)胞進(jìn)入腫瘤，顯示出了強大的抗腫瘤活性，在腫瘤治療中有很大的應(yīng)用前景［32］。腺相關(guān)病毒載體由于其高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和低免疫原性被選為LIGHT的轉(zhuǎn)導(dǎo)載體。Maitituoheti等人［33］發(fā)現(xiàn)在體外AAVLIGHT能夠刺激T淋巴細(xì)胞的增殖和活化，并且通過構(gòu)建C57BL/6小鼠TC-1 CC動物模型，發(fā)現(xiàn)皮下注射AAV-LIGHT能夠顯著降低腫瘤的大小和重量，表明AAV-LIGHT能夠通過活化細(xì)胞毒性T細(xì)胞和增強腫瘤位點的淋巴細(xì)胞浸潤來起到抑制腫瘤生長的作用，腺相關(guān)病毒載體介導(dǎo)的基因治療在宮頸癌的治療中顯示了巨大的應(yīng)用前景。

2.5基因疫苗載體

基因疫苗是指將編碼外源性抗原基因通過合適的載體系統(tǒng)導(dǎo)入人體或動物體內(nèi)，讓其在宿主細(xì)胞中表達(dá)抗原蛋白，直接誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答從而達(dá)到預(yù)防疾病的目的。抗原基因在一定時限內(nèi)的持續(xù)表達(dá)，不斷刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)，從而到達(dá)預(yù)防疾病的目的。其中人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）腺相關(guān)載體疫苗已在人體進(jìn)行了免疫試驗。在利用腺病毒載體表達(dá)人瘧原蟲CS抗原蛋白進(jìn)行免疫研究中證明，其免疫效果甚至比放射孢子體的免疫效果還要好［34］。盡管人源腺相關(guān)病毒在試驗動物體內(nèi)取得較好的免疫效果，但是在多數(shù)人不同程度的存在人腺相關(guān)病毒的中和抗體的情況下，這些中和抗體會阻礙腺相關(guān)病毒載體在體內(nèi)有效地表達(dá)外源基因。怎樣避免腺相關(guān)病毒特異性的中和抗體是目前腺相關(guān)病毒載體疫苗研究中的一個主要的問題［35］。

除此之外，其他表達(dá)轉(zhuǎn)基因的腺相關(guān)病毒載體也顯示出比較好的治療效果。有報道稱利用表達(dá)粒性巨噬細(xì)胞集落刺激因子的腺相關(guān)病毒載體治療黑色素瘤的臨床試驗，顯示了強大的抗癌效果［36］。病毒性腫瘤、致癌基因過表達(dá)引起的腫瘤能夠表達(dá)誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫反應(yīng)的腫瘤抗原。但是許多腫瘤卻可以規(guī)避有效的抗腫瘤T-細(xì)胞免疫反應(yīng)［37］。研究表明，用腺相關(guān)病毒載體連續(xù)表達(dá)多個腫瘤抗原的CTL表位，具有很好的抗腫瘤活性。腫瘤組織選擇性復(fù)制的腺相關(guān)病毒載體被用來表達(dá)抗腫瘤細(xì)胞因子激活物具有明顯的抗癌效果［38］。

3　結(jié)論與展望

腺相關(guān)病毒載體是將天然存在的腺相關(guān)病毒經(jīng)過基因工程改造后產(chǎn)生的一種基因載體。由于有眾多的腺病毒種類，使得我們可以根據(jù)不同的需要來研究開發(fā)不同的腺相關(guān)病毒載體?？梢愿鶕?jù)需要改變病毒衣殼表面來改變腺病毒的宿主親嗜性，制造出靶向定位的腺相關(guān)病毒載體，從而將載體靶向到特定的組織器官中來治療人類各種疾?。灰部梢愿淖兿俨《净蚪M從而擴(kuò)大載體容量，使腺相關(guān)病毒載體更好地為人類服務(wù)。隨著研究的深入，腺相關(guān)病毒載體廣泛用于基因治療和基因疫苗載體。通過對載體的改造和所裝載外源治療基因的選擇，對于攻克威脅人類健康的癌癥和各種遺傳性疾病具有潛在的應(yīng)用價值。

盡管腺相關(guān)病毒載體在基因治療和基因疫苗治療等方面研究較多，但在臨床運用上還存在問題［39］。重組的AAV是由待轉(zhuǎn)導(dǎo)的真核基因和病毒衣殼構(gòu)成的重組分子，不能編碼任何病毒蛋白質(zhì)，但重組的病毒衣殼仍與野生型病毒衣殼很相似，因此當(dāng)暴露于機體免疫系統(tǒng)時仍然會激發(fā)針對核衣殼和外源基因的免疫反應(yīng)［40］。相信隨著病毒分子生物學(xué)技術(shù)和疫苗技術(shù)的不斷發(fā)展，腺相關(guān)病毒載體疫苗和治療藥物必將會從研究走向臨床應(yīng)用，為人和動物的衛(wèi)生健康服務(wù)。

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Adeno-associated virus（AAV）-based vector：a bridge towards tumor gene therapy

CHEN Xiusheng1，LIN Chuangzhen2，LEI Chuan1，QU Xiangming1，NIE Xin1，HU Ao1，CHEN Si1，DU Hongyan1★
（1.School of Biotechnology，Southern Medical University，Guangzhou，Guangdong，China，510515；2.The First Affiliated Hospital of Southern Medical University，Guangzhou，Guangdong，China，510515）

Adeno-associated virus（AAV）is a kind of human parvovirus that is defective and non-pathogenic.AAV vector，as the vector of gene-therapy，has superiority in long-term gene-correction and gene-therapy.AAV vector is considered to be the ideal vector to transfect target gene because of its mildly pathogenicity and easy to operation and now it has been widely used in different kinds of research on gene-therapy to neoplastic disease.Through improving its targeting and reducing its immunogenicity by reforming and optimizing the AAV vector，it is hopeful to provide new methods and measures to the research about gene-therapy of tumor.In this paper many researches on application of AAV vector in tumor gene therapy are summarized，which will be helpful for studies on tumor gene therapy.

Adeno-associated virus（AAV）；Gene therapy；Application；Research progress

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）（2012AA020205）；國家自然科學(xué)基金（81401920）；2013國家教育部博士點基金（20134433120020）；2013年國家級“大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃”項目（1212113058）；南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)研究前期啟動項目（QD2013N005）；廣東省“大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計劃”（201412121094）

1.南方醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，廣東，廣州510515 2.南方醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東，廣州510515

杜紅延，E-mail：gzduhongyan@126.com

注：陳秀生，林創(chuàng)珍為共同第一作者