preS/S 區(qū)基因變異與隱匿性HBV 感染的關(guān)系▲

景媛媛 段 勇 郭 燕

(陜西省西安市中心血站檢驗科，西安市 710061，E－mail:jingyuanyuantg@163.com)

隱匿性HBV 感染(occult hepatitis B virus infection，OBI)指患者HBV 標志物HBsAg 及HBeAg 陰性或抗－HBs與抗－HBc 陽性，血清中可檢測到低水平HBV－DNA 或肝組織檢測出HBsAg 或HBcAg。傳統(tǒng)的慢性HBV 感染是通過檢測血清中HBsAg 確定診斷。目前越來越多研究表明，無論是急性自限性肝炎，還是成功進行抗HBV 治療后慢性乙型肝炎患者，HBsAg 清除后部分患者肝組織中仍可檢出HBV DNA，肝臟損害依然存在(多為慢性嚴重肝損傷)，仍可發(fā)展為肝硬化或肝癌［1－4］。早在20 年前就有人發(fā)現(xiàn)血清中含抗－HBs 的供血者能傳播HBV 感染，特別是僅抗－HBc 陽性的傳播可能性更大［5］。因此隱匿性HBV的感染機制是近年來此類疾病的研究熱點。有研究表明在HBV Pre－s/s 區(qū)域的任何突變均可改變HBsAg 的抗原性和抑制抗－HBs 的產(chǎn)生［6］。在s 區(qū)域的124 ～147 氨基酸序列包含了“α”決定子和一個應答抗－HBs 的顯性B 細胞抗原簇［7］。單個氨基酸在這個區(qū)域的替換可間接破壞抗－HBs的循環(huán)產(chǎn)生，導致在接種疫苗或隱匿性HBV 感染后發(fā)生變異性感染［8－9］。有人發(fā)現(xiàn)氨基酸第129 位天門冬氨酸和第145 位丙氨酸置換可導致血循環(huán)中HBsAg 陰性;s 蛋白第122 與123 位之間、123 與124 位之間，分別有2 ～3 個氨基酸插入，也可導致HBsAg 不能檢出［10－12］。本文通過對HBsAg 陰性患者及HBsAg 陽性患者的血清進行DNA 提取及分析，探討了HBV preS/S 區(qū)基因變異與OBI及肝臟損傷的關(guān)系，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇我單位2014 年1 ～12 月116 例HBsAg 陰性患者(為乙型肝炎康復患者)及102 例HBsAg陽性患者。HBsAg 陰性患者中男67 例，女49 例，年齡23 ～69(43.2±5.1)歲;HBsAg 陽性患者中男66例，女36 例，年齡20 ～71(41.9±4.3)歲。根據(jù)美國創(chuàng)傷外科協(xié)會(American Association of the Surgery of Trauma，AAST)分級標準［8］對兩組患者肝損傷程度進行分級，在一級以上均定義為肝損傷，一級至三級定義為慢性肝損傷，三級以上(不包括三級)為嚴重肝損傷。HBsAg 陽性患者伴嚴重肝損傷共73 例，HBsAg 陰性患者伴嚴重肝損傷38 例，其中后者肝損傷多為慢性嚴重肝損傷。兩組患者的性別、年齡等數(shù)據(jù)比較，差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)，具有可比性。所有患者均在知情情況下參與此次研究，并已簽署知情同意書。

1.2 主要儀器及試劑 HBV－DNA 熒光定量檢測試劑盒(德國凱杰公司，批號:51306);LightCycler480 熒光定量PCR 儀［羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司］。

1.3 HBV－DNA 提取與定量檢測 兩組患者均于清晨空腹肘靜脈采集血液3 ml，3 000 r/min 離心10 min 后取上清液至于－20℃待檢。使用HBV－DNA 熒光定量檢測試劑盒進行DNA 的提取:取樣本血清置入試管，使用一步法在血清中加入核算釋放劑后全部轉(zhuǎn)入擴增，50℃反應2 min，于94℃保溫5 min 后再按94℃15 s、57℃30 s進行45 個循環(huán);使用LightCycler480 熒光定量PCR 儀進行定量檢測，敏感性設(shè)定為500 IU/ML。

1.4 PCR 擴增HBV 核酸檢測 對116 例HBsAg 陰性患者的DNA 進行PCR 擴增HBV 核酸檢測，依照文獻［13］的方法進行引物的設(shè)計，分別針對preS/S 區(qū)、pre－core/core區(qū)及X 基因區(qū)的巢式PCR 反應體系對OBI進行檢測。使用MBI Frematas Taq 在PCR 儀上進行擴增，具體方法如下:第一輪總體系10 μl，雙蒸水5.0 μl，緩沖液1.0 μl，鎂離子1.0 μl，Dntp 0.8 μl，兩側(cè)引物各0.05 μl，Taq 酶0.2 μl，DNA 模板1 μl。循環(huán)條件為預變性94℃、5 min，變性94℃、30 s，退火56℃、30 s，延伸72℃、30 s，進行30 個循環(huán);第二輪其他條件不變，循環(huán)增加至40 個。DNA 樣本以出現(xiàn)兩個或兩個以上片段的特異性擴增產(chǎn)物為OBI 基因組陽性。

1.5 HBV preS/S 區(qū)全長基因進行測序分析 查照HBV 參考序列，使用Primer Premier5 進行分析后設(shè)計一條正向引物(P1，5'－TTCTTGGGAACAAGAGCTAC－3')，兩條反向引物(R1，5'－GCAAAGCCCAAAAGACCCAGAAT－3';R2，5'－TGACAATACTTTCCAATCAAT－3')。兩 對 引 物 擴增片段分別為1410 bp 和1383 bp。擴增產(chǎn)物在理論上已經(jīng)包含了HBV preS/S 區(qū)基因。使用PCR 儀進行擴增，將產(chǎn)物過瓊脂糖凝膠電泳后進行純化回收，進行檢序，無法直接檢序的在產(chǎn)物末端加A 尾后連接T 載體，檢測結(jié)果使用SciEd7 軟件進行分析。分別比較OBI 患者與HBsAg 陽性患者、伴有嚴重肝損傷的OBI 患者與HBsAg 陽性患者的preS/S 區(qū)基因序列突變或缺失情況。

1.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以表示，組間對比采用t 檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，以P ＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 PCR 擴增HBV 核酸檢測結(jié)果 對116 例HBsAg陰性患者的DNA 進行PCR 擴增HBV 核酸檢測，出現(xiàn)preS/S 區(qū)、pre－core/core 區(qū)、X 基因區(qū)的例數(shù)分別為49、64、27，HBV DNA 陽性者70 例，最終OBI 檢出率(即HBV－DNA 陽性率)為60.34%(70/116)，其中男性48例，女性22 例，伴有嚴重肝損傷患者38 例。

2.2 preS/S 區(qū)全長基因進行測序分析結(jié)果

2.2.1 OBI 患者與HBsAg 陽性患者的preS/S 區(qū)基因序列比較:OBI 患者M1I、Q2K、Q129N/R/P、S210R 及G185R的突變頻率均明顯高于HBsAg 陽性患者(P ＜0.05)，OBI患者的preS 缺失率也高于HBsAg 陽性患者(P ＜0.05)。見表1。

表1 OBI 患者與HBsAg 陽性患者preS/S 區(qū)基因序列突變或缺失比較(n，%)

2.2.2 伴有嚴重肝損傷的OBI 患者與HBsAg 陽性患者的preS/S 區(qū)基因序列比較:兩者Q129N/R/P 突變頻率及preS 缺失率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)，伴有嚴重肝損傷的OBI 患者M1I、Q2K、S210R 及G185R 突變頻率均明顯高于HBsAg 陽性患者(P ＜0.05)。見表2。

表2 伴有嚴重肝損傷的OBI 患者與HBsAg陽性患者的preS/S 區(qū)基因序列突變或缺失比較(n，%)

3 討 論

OBI 的發(fā)生是病毒和機體相互作用的結(jié)果，其可能有多種發(fā)病機制:(1)HBV 低水平復制，抗原表達量低;(2)HBV 基因變異;(3)HBV 整合到宿主染色體中;(4)外周血單核細胞感染HBV;(5)宿主免疫應答異常;(6)受其他病毒感染的干擾;(7)試劑的靈敏度和質(zhì)量問題。OBI 普遍存在，其意義有下面幾個方面:(1)輸血、血液透析以及臟器移植傳播HBV 的潛在危險。(2)隱源性肝病的病因。(3)OBI 病情惡化已有諸多報道，但發(fā)生頻率尚不清楚。(4)在肝細胞癌病人中常常發(fā)現(xiàn)OBI 的存在，認為與原發(fā)性肝癌發(fā)生有關(guān)，尤其是合并丙肝病毒感染時。(5)當丙肝病毒感染合并OBI時，將會影響其自然病程或增加疾病的嚴重程度。(6)乙肝疫苗接種無應答的原因之一。此外HBV 隱匿性感染者是HBV 母嬰傳播途徑的重要傳染源［14－16］。

本研究對大量臨床實例的血液DNA 樣本進行監(jiān)測，探討了HBV preS/S 區(qū)基因變異與OBI 及肝臟損傷的關(guān)系，結(jié)果顯示OBI 患者M1I、Q2K、Q129N/R/P、S210R 及G185R 的突變頻率均明顯高于HBsAg 陽性患者(P ＜0.05)，OBI 患者的preS 缺失發(fā)生率亦高于HBsAg陽性患者(P ＜0.05);提示OBI 患者與HBsAg 陽性患者在基因?qū)用嫔系陌l(fā)病機制有著較大的不同，M1I、Q2K、Q129N/R/P、S210R 及G185R 的突變及preS 缺失對OBI 的診斷有一定的指導幫助。伴有嚴重肝損傷的OBI患者Q129N/R/P 突變率及preS 缺失率與HBsAg 陽性伴嚴重肝損傷的患者比較，差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)，但M1I、Q2K、S210R 及G185R 突變頻率均明顯高于均明顯高于HBsAg 陽性伴嚴重肝損傷的患者(P ＜0.05)，提示以上preS/S 區(qū)基因序列的突變對評價OBI 患者的肝損傷有一定的指導作用，但當患者存在肝損傷時Q129N/R/P變異及preS 缺失對OBI 的診斷作用可能受到影響。

綜上所述，OBI 與HBsAg 陽性患者之間導致慢性嚴重肝損傷的病毒學因素不同，M1I、Q2K、S210R 及G185R 等突變對于OBI 患者而言可能是評價其是否可能發(fā)展為慢性嚴重肝損傷的重要指標，同時從另一方面說明了對HBsAg 陰性人群進行HBV－DNA 檢測的必要性。

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