SSR標(biāo)記變性聚丙烯酰胺凝膠快速銀染方法的建立

李建武，李 寧

（1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所，甘肅 蘭州 730 0 70；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730 0 70)

聚丙烯酰胺凝膠電泳（Polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）由Raymond和Weintraub[1]建立，是分析蛋白質(zhì)和核酸的一種常用的電泳方法。由于其具有上樣量少、不易擴(kuò)散、分辨率高且易于觀察的特點(diǎn)，在分子生物學(xué)及相關(guān)學(xué)科的基礎(chǔ)和臨床研究中得以廣泛的應(yīng)用。目前該方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜構(gòu)建等過(guò)程中AFLP（Amplified fragment length polymorphism）、 SSR（Simple sequence repeats）等分子標(biāo)記的檢測(cè)[2-5]。

目前常規(guī)的聚丙烯酰胺凝膠的銀染過(guò)程耗時(shí)長(zhǎng)，步驟繁瑣，大批量的試驗(yàn)不僅費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，且存在染色時(shí)間較長(zhǎng)或分辨率較低等方面的缺點(diǎn)。為了提高分子標(biāo)記等試驗(yàn)的效率，利用相同的SSR-PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，對(duì)文獻(xiàn)報(bào)道的4種方法[4,6-8]與在An等[8]方法基礎(chǔ)上改良的銀染方法進(jìn)行比較，經(jīng)反復(fù)摸索、改良，建立了一種高效、快速的變性聚丙烯酰胺凝膠銀染方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

從甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所西北旱作馬鈴薯觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站采集馬鈴薯20份株系的幼嫩葉片，保存在冰盒中，帶回實(shí)驗(yàn)室采用北京天根生化科技有限公司植物基因組DNA提取試劑盒（DP305）提取葉片基因組DNA。

1.2 PCR擴(kuò)增體系和程序

采用SSR-PCR產(chǎn)物來(lái)比較分析各種染色方法的效果，引物參考Ghislain等[9]發(fā)表的引物STI 034，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列如下。

正向引物序列：5'-CAAGAAACCAAGAGCAAAT TTCA-3'；反向引物序列：5'-TGGCGAATGTGAGAA ACAAA-3'。

PCR反應(yīng)體系：采用20 μL反應(yīng)體系，1.5 μL 10×Buffer，0.75 μL dNTP（2.5 mM/L），3 μL DNA（20 μmoL/μL），1.2 μL正向和反向引物（10 mM/L），0.3 μL Taq酶（5U/μL），加ddH2O至體積20 μL。

PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，10℃保存。擴(kuò)增反應(yīng)在Bio-T100 PCR儀上進(jìn)行。

1.3 電 泳

SSR-PCR產(chǎn)物加1/2體積的變性上樣緩沖液混合，經(jīng)95℃變性5 min后置于冰上冷卻停止反應(yīng)，上樣量為2.5 μL，采用6%（29:1）變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離擴(kuò)增片段，穩(wěn)壓1 380 V，電泳120 min，電泳結(jié)束后銀染顯色、拍照。

1.4 銀 染

采用5種銀染方法，其中參考文獻(xiàn)方法4種，試驗(yàn)改良方法1種，各銀染方法步驟見表1，銀染試驗(yàn)重復(fù)2次，試驗(yàn)用水全部采用實(shí)驗(yàn)室制作的蒸餾水。

表1 變性聚丙烯酰胺凝膠各銀染方法操作過(guò)程Table 1 Silver staining methods of polyacrylamide gel

1.5 統(tǒng)計(jì)拍照

將銀染的玻璃膠板晾干后放置在白熾燈箱上，按照點(diǎn)樣順序逐條對(duì)多態(tài)性進(jìn)行比對(duì)，在出現(xiàn)差異譜帶的地方進(jìn)行記錄，有記為1，無(wú)則記為0，不清楚記為“-”，使用數(shù)碼照相機(jī)拍照保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同銀染方法的染色效果比較

變性聚丙烯酰胺凝膠不同銀染方法銀染結(jié)果見圖1～5。從圖中可以看出，銀染方法2、3的銀染結(jié)果背景較深，但方法2、3、4擴(kuò)增目標(biāo)片段較為模糊，不夠清晰，不利于條帶多態(tài)性統(tǒng)計(jì)；方法1的銀染結(jié)果背景淺，目標(biāo)片段清晰，便于條帶統(tǒng)計(jì)，且條帶信息豐富，效果最好。方法5的銀染結(jié)果背景較淺，呈淺黃色，目標(biāo)片段較為清晰，便于條帶統(tǒng)計(jì)。

圖1 方法1的銀染結(jié)果Figure 1 Silver staining results for method 1

圖2 方法2的銀染結(jié)果Figure 2 Silver staining results for method 2

圖3 方法3的銀染結(jié)果Figure 3 Silver staining results for method 3

圖4 方法4的銀染結(jié)果Figure 4 Silver staining results for method 4

圖5 方法5的銀染結(jié)果Figure 5 Silver staining results for method 5

2.2 不同銀染方法所需試劑

變性聚丙烯酰胺凝膠不同銀染方法所需試劑如表2所示。所有操作過(guò)程均在1 000 mL蒸餾水溶液中進(jìn)行。

從表2中可以看出，銀染方法1、2所用的冰乙酸、AgNO3和NaOH的用量都比其他方法的用量多，尤其是比較昂貴的AgNO3用量達(dá)到了2 g，造成試劑的很大浪費(fèi)，加大了試驗(yàn)成本。銀染方法4用了大量的HNO3，危險(xiǎn)性高，不利于操作人員的健康。銀染方法3不使用無(wú)水乙醇、冰乙酸、HNO3和Na2CO3，是參試方法中試劑用量最少的方法，成本最低。銀染方法5降低了部分試劑的使用量，同時(shí)減少了對(duì)人的傷害和對(duì)環(huán)境的污染，降低了試驗(yàn)成本。

2.3 不同銀染方法所需時(shí)間

變性聚丙烯酰胺凝膠不同銀染方法所需時(shí)間如表3所示。通過(guò)表3可知，銀染方法1、2、3都耗費(fèi)了很長(zhǎng)的時(shí)間，在大批量銀染實(shí)際操作中是不可取的。銀染方法4操作過(guò)程需要10 min，耗時(shí)最短，銀染方法5耗時(shí)12 min，這2種方法較其他方法節(jié)省了時(shí)間，易于批量操作。

表2 5種銀染方法所需的各種試劑數(shù)量Table 2 Reagents used in five silver staining methods

表3 5種銀染方法所需時(shí)間Table 3 Time needed for five silver staining methods

表4 5種銀染方法的綜合比較Table 4 Comprehensive comparison of five silver staining methods

2.4 不同銀染方法的綜合比較

對(duì)變性聚丙烯酰胺凝膠5種銀染方法的操作時(shí)間長(zhǎng)短、染色背景深淺、目標(biāo)片段清晰程度、操作步驟、染色/顯影液制作和溫度條件方面進(jìn)行綜合比較分析（表4）。銀染方法1用時(shí)長(zhǎng)，染色效果最好，但顯影過(guò)程必須在55℃下進(jìn)行，顯影水溶液溫度不易控制，操作繁瑣。銀染方法2、3耗時(shí)長(zhǎng)，銀染方法4的染色/顯影液不能長(zhǎng)期保存反復(fù)使用。銀染方法5操作耗時(shí)少，操作簡(jiǎn)單，顯影出的膠板背景顏色深，條帶較清晰，便于觀察、記錄，適宜批量操作。

3 討論

近年來(lái)，隨著分子標(biāo)記技術(shù)的日益成熟和數(shù)量遺傳學(xué)統(tǒng)計(jì)分析軟件的不斷更新，開展遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、基因定位等研究均需要較大規(guī)模的群體為基礎(chǔ)，樣品數(shù)量多，若想提高整個(gè)研究的效率，首先必須從提高DNA提取效率及后續(xù)變性PAGE電泳、染色等步驟的效率著手。變性聚丙烯酰胺凝膠銀染顯色整個(gè)過(guò)程需要固定、銀染、漂洗、顯影、終止等多個(gè)環(huán)節(jié)，常規(guī)的顯色方法需要花費(fèi)較長(zhǎng)的時(shí)間。本研究以得到理想的目的片段為前提條件，以縮短顯色染色時(shí)間、簡(jiǎn)化操作過(guò)程、降低研究成本和提高銀染效率為目的。

銀染過(guò)程容易受試劑純度、外界溫度、水、操作時(shí)間等因素影響，研究統(tǒng)一使用實(shí)驗(yàn)室制作的蒸餾水，國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?，可能影響了部分銀染方法的染色效果。銀染方法1（Byun等[6]方法），背景較深，條帶清晰，便于統(tǒng)計(jì)，但其染色時(shí)間長(zhǎng)，整個(gè)染色過(guò)程需要30 min以上，顯影液需要保持在55℃，過(guò)程繁瑣，操作難度大。銀染方法2（梁宏偉等[4]方法）與銀染方法4（An等[8]方法），操作簡(jiǎn)單，但條帶模糊，不便統(tǒng)計(jì)分析。銀染方法3（高東等[7]方法），條帶清晰程度較差，染色時(shí)間較長(zhǎng)。改良方法是在An等[8]方法基礎(chǔ)上通過(guò)減少染色和顯影試劑使用量，延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間取得了較好的銀染效果。研究改良的高效快速銀染方法與常規(guī)方法相比，不僅縮短了工作時(shí)間，提高了試驗(yàn)效率，還節(jié)約了部分化學(xué)試劑的種類及用量，降低了試驗(yàn)成本，且取得了可與常規(guī)方法相媲美的效果。綜上所述，優(yōu)化后的銀染方法可滿足變性聚丙烯酰胺凝膠快速銀染要求。

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