手足口病患者柯薩奇病毒核酸檢測結(jié)果分析*

王武琦，蘇國生，韋善求(.廣西壯族自治區(qū)玉林市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科 537000；.廣西壯族自治 區(qū)南寧市第四人民醫(yī)院/廣西醫(yī)科大學(xué)附屬南寧市傳染病醫(yī)院/廣西艾滋病臨床治療中心，南寧53003)

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·論 著·

手足口病患者柯薩奇病毒核酸檢測結(jié)果分析*

王武琦1，蘇國生2△，韋善求2(1.廣西壯族自治區(qū)玉林市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科 537000；2.廣西壯族自治 區(qū)南寧市第四人民醫(yī)院/廣西醫(yī)科大學(xué)附屬南寧市傳染病醫(yī)院/廣西艾滋病臨床治療中心，南寧530023)

目的 探討手足口病患者柯薩奇病毒核酸檢測的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法 利用實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)，以EV71/CA16基因組編碼區(qū)的高度保守區(qū)為靶區(qū)域，設(shè)定特異性引物及熒光探針，通過一步法RT-PCR擴(kuò)增對EV71 RNA/CA16 RNA進(jìn)行檢測。結(jié)果 在428份患者標(biāo)本中，EV71-RNA陽性136份，CA16-RNA陽性6份，其中有1例患者既是EV71-RNA咽拭子和肛拭子均陽性又是CA16-RNA咽拭子陽性。而有40例(80份標(biāo)本)患者EV71-RNA咽拭子和肛拭子均陽性，46份EV71-RNA單獨(dú)肛拭子陽性，10份EV71-RNA單獨(dú)咽拭子陽性。在6份CA16-RNA陽性患者標(biāo)本中，4份為肛拭子陽性，2份為咽拭子陽性。結(jié)論 手足口病患者柯薩奇核酸檢測對重癥患者判斷預(yù)后有重要的指導(dǎo)意義，對指導(dǎo)臨床合理制訂治療方案有重要的參考價(jià)值，值得推廣應(yīng)用。

手足口??； 柯薩奇病毒； 核酸檢測； 基因

近幾年來，玉林市手足口病的暴發(fā)流行有著逐年上升的趨勢，并且已經(jīng)成為當(dāng)前玉林市兒童急性傳染病的重要疾病，防控工作非常嚴(yán)峻。發(fā)病范圍由點(diǎn)到面，迅猛增長，患病兒童病死率也呈逐年增高的發(fā)展趨勢。由于手足口病的傳播途徑非常復(fù)雜，病原體種類繁多，且目前沒有相應(yīng)的疫苗可以預(yù)防，因此至今沒有較好的預(yù)防控制措施[1-3]。手足口病是由多種腸道病毒感染引起的一種常見傳染病，在核酸分型中主要以EV71型和CA16型最多見。多以嬰幼兒發(fā)病最高，隨著疾病的發(fā)展，10～18歲的兒童感染的概率也屢見不鮮，大多數(shù)患者發(fā)病癥狀較輕，以發(fā)熱和口腔、手、足、臀部等部位的皮疹或皰疹為主要特征，部分患兒有咳嗽、惡心、嘔吐、食欲不振、流涕和頭疼等癥狀，少數(shù)患者可并發(fā)嚴(yán)重的心肌炎,無菌性腦膜炎以及肺水腫等致命性并發(fā)癥[4-5]。廣西醫(yī)科大學(xué)附屬南寧市傳染病醫(yī)院作為南寧市唯一一家綜合性三級傳染病醫(yī)院，一直是本市手足口病的定點(diǎn)治療醫(yī)院。為了解2012年廣西醫(yī)科大學(xué)附屬南寧市傳染病醫(yī)院柯薩奇病毒核酸檢測的結(jié)果及臨床應(yīng)用，現(xiàn)將檢測相關(guān)情況報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2012年在本院住院治療的214例手足口病患兒咽拭子和肛拭子共計(jì)428份標(biāo)本進(jìn)行核酸檢測，患兒年齡4個(gè)月至10歲，平均年齡1歲零8個(gè)月，男性多于女性，本年度感染高發(fā)期在4～8月。感染患兒以散居兒童為主，其次為幼托兒童，最后為學(xué)生。

1.2 核酸檢測方法 利用實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)，以EV71/CA16基因組編碼區(qū)的高度保守區(qū)為靶區(qū)域，設(shè)定特異性引物及熒光探針，通過一步法逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增對EV71 RNA/CA16 RNA進(jìn)行檢測。

1.2.1 標(biāo)本采集 (1)咽拭子樣本：采集患者發(fā)病3 d內(nèi)的咽拭子樣本，用專用采樣棉簽，適度用力拭抹咽后壁和兩側(cè)扁桃體部位，應(yīng)避免觸及舌部；迅速將棉簽放入裝有3～5 mL保存液(維持液或生理鹽水，推薦使用維持液)的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封，以防干燥。(2)肛拭子樣本：采集患者發(fā)病7 d內(nèi)的肛拭子樣本，采樣方法同咽拭子。(3)皰疹液：可同時(shí)采集多個(gè)皰疹作為1份樣本。先用75%乙醇對皰疹周圍的皮膚進(jìn)行消毒，然后用消毒針將皰疹挑破用棉簽蘸取皰疹液，迅速將棉簽放入內(nèi)裝有3～5 mL保存液(維持液或生理鹽水，推薦使用維持液)的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封。(4)標(biāo)本保存和運(yùn)送：標(biāo)本可立即用于測試，也可保存于-40 ℃待測，保存期為4個(gè)月。長期保存，請置于-70 ℃。標(biāo)本運(yùn)送時(shí)應(yīng)采用0 ℃冰壺。

1.2.2 樣本處理及RNA提取 (1)拭子樣本強(qiáng)烈振蕩1 min，取100 μL(待測樣本不足100 μL時(shí)請補(bǔ)加適量生理鹽水重懸)，放置于1.5 mL滅菌離心管，加入200 μL Trizol試劑及100 μL氯仿，用振蕩器強(qiáng)力振蕩20 s后靜置3 min，然后12 000 r/min離心2 min。(2)小心取出無色上層液體(注意不可觸及中間絮狀層)，轉(zhuǎn)移至新滅菌的1.5 mL離心管，然后加入10 μL RNA提取液A(充分混勻后吸取)，再用振蕩器充分混勻，8 000 r/min離心1 min后，小心棄去所有液體。(3)加入溶液C(確認(rèn)已加入無水乙醇)400 μL，充分振蕩混勻，8 000 r/min離心1 min，盡可能將液體去除干凈(避免觸及沉淀顆粒)。(4)將裝有沉淀的離心管擺在通風(fēng)櫥中風(fēng)干15 min(也可使用開放式加熱器于60 ℃ 干燥5 min，需防止樣本交叉污染)，然后加入30 μL DEPC H2O，吸打混勻管中沉淀，得到白色的懸濁液，可直接用于檢測，也可存于-70 ℃待用。

1.2.3 注意事項(xiàng) PCR 熒光定量檢測法比較容易受污染，所以試驗(yàn)過程中應(yīng)盡量避免反復(fù)開蓋，所用耗材均需高壓滅菌；RNA 提取步驟建議冰上操作；吸取血清/血漿時(shí)注意勿帶入紅細(xì)胞；試劑使用前要完全解凍，但應(yīng)避免反復(fù)凍融；RNA 提取液A必須充分混勻后吸取，RNA 提取液B需溶解混勻后使用；逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA后，需馬上進(jìn)行下一步試驗(yàn)，否則請轉(zhuǎn)移上清至滅菌EP管，保存于-20 ℃待用；試驗(yàn)完畢應(yīng)用有效氯濃度為1 000 mg/L的健之素消毒液擦拭桌面，打開紫外線燈消毒 30 min以上。

2 結(jié) 果

在428份患者標(biāo)本中，EV71-RNA陽性136份，CA16-RNA陽性6份，其中有1例患者既是EV71-RNA咽拭子和肛拭子均陽性又是CA16-RNA咽拭子陽性。而有40例(80份標(biāo)本)患者EV71-RNA咽拭子和肛拭子均陽性，46份EV71-RNA單獨(dú)肛拭子陽性，10份EV71-RNA單獨(dú)咽拭子陽性。在6份CA16-RNA陽性患者標(biāo)本中，4份為肛拭子陽性，2份為咽拭子陽性。在214例患者中有6例由于病情嚴(yán)重送入ICU進(jìn)行治療，有3例患者EV71-RNA咽拭子和肛拭子均陽性并有1例包含了CA16-RNA咽拭子陽性。此3例患者由于轉(zhuǎn)入ICU后病情繼續(xù)加重，醫(yī)治無效病死，其余單純1份標(biāo)本EV71-RNA陽性患者病情好轉(zhuǎn)救治成功。

3 討 論

由柯薩奇病毒引起的手足口病是一種風(fēng)險(xiǎn)較高的傳染病，其預(yù)防控制措施多以控制傳染源為主，切斷傳播途徑并進(jìn)行廣泛深入的手足口病防治健康教育，提高廣大群眾的自我保護(hù)意識[6]。當(dāng)前本地區(qū)手足口病的防控工作主要還是切斷傳播途徑、保護(hù)易感人群。在以往經(jīng)驗(yàn)和防控措施的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步完善各項(xiàng)防控措施，堅(jiān)持不懈抓落實(shí)。加大傳染源歸口管理，嚴(yán)格按照規(guī)定隔離患者和疑似患者，減少接觸傳播，減少第2代患者發(fā)生；加強(qiáng)區(qū)域小學(xué)及托幼機(jī)構(gòu)的管理，堅(jiān)持晨檢和消毒工作，發(fā)現(xiàn)可疑病患需及時(shí)報(bào)告并隔離；加強(qiáng)手足口病的防治宣教工作，將防控措施及方法傳達(dá)給每位兒童家長；做好調(diào)查研究及科研工作，尋求更好的防控方法。

柯薩奇病毒作為一種單股正鏈小RNA病毒，其基因長度為7.4 kb，堿基對(G+C)的濃度大約為47%。兩端為保守的非編碼區(qū)，中間為編碼區(qū)[7]。5′端以共價(jià)鍵結(jié)合1個(gè)小分子蛋白質(zhì)Vpg(約7×103)，其作用與病毒RNA的合成和基因的組裝配有關(guān)；3′端則帶有polyA尾。編碼區(qū)編碼的病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1～VP4與CoxV、EV71一樣，VP1、VP2和VP3均暴露在病毒衣殼的表面，具有中和抗原位點(diǎn)；VP4位于衣殼內(nèi)部，病毒VP1一旦與受體結(jié)合后，VP4即被釋出，衣殼松動，病毒基因組脫殼穿入[8]。5′非編碼區(qū)沒有多聚嘧啶區(qū)和多聚C區(qū)?？滤_奇病毒在氣候變暖的季節(jié)里，容易污染環(huán)境，適合生存在濕、熱的環(huán)境下并瘋狂地傳播；病毒比較耐熱，失活溫度在50 ℃以上，在4 ℃下可存活1年以上，而在-20 ℃下可長期保存，因此，在常規(guī)環(huán)境下可長期存活[9]?？滤_奇病毒存在核苷酸多態(tài)性或毒力位點(diǎn)的變異性。免疫功能不全的嬰幼兒易感染，只要接觸被病毒污染的外環(huán)境，就有可能被感染[10]。由于嬰幼兒皮膚膚質(zhì)較嫩，暴露部位較多，防護(hù)能力差，病原極易侵入機(jī)體而感染。

本研究結(jié)果顯示，手足口病患者柯薩奇病毒核酸檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因型EV71-RNA感染率較高，而CA16-RNA感染率較低，但從病情發(fā)展情況看，CA16-RNA感染的嚴(yán)重程度較高，很難進(jìn)行救治，往往病情加重并發(fā)心肌炎而病死。另外，EV71-RNA咽拭子和肛拭子同時(shí)陽性的患者，其病情也較單一標(biāo)本陽性者嚴(yán)重，更難醫(yī)治，病死的危險(xiǎn)率增高。由此可見，可疑手足口病患者，入院后及時(shí)進(jìn)行柯薩奇病毒核酸檢測，了解核酸的多態(tài)性和變異性，更有利于病患的救治。

綜上所述，手足口病患者柯薩奇核酸檢測在臨床上具有重要的臨床意義，對重癥患者而言，病原學(xué)的診斷對判斷預(yù)后和指導(dǎo)臨床合理制訂治療方案有重要的參考價(jià)值，值得推廣應(yīng)用。

[1]海巖,王文瑞,郭衛(wèi)東，等.內(nèi)蒙古地區(qū)2010年柯薩奇病毒A組16型VP1區(qū)序列測定及系統(tǒng)進(jìn)化分析[J].中華流行病學(xué)雜志,2013,34(5):539-540.

[2]梅玉發(fā),王喜云,崔龍，等.湖北省十堰市59例柯薩奇病毒A組6型手足口病流行病學(xué)特征與臨床特點(diǎn)分析[J].疾病監(jiān)測,2013,28(12):981-983.

[3]張建華,江炳福,程險(xiǎn)峰，等.腸道病毒71型和柯薩奇病毒A16型分離株的VP1基因特征分析[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版,2013,32(2):173-179.

[4]楊國梁,馬超鋒,陳海龍，等.2013年西安地區(qū)柯薩奇病毒A6流行情況及基因特征[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版,2014,35(4):486-489.

[5]高勇,韓明鋒,李秀勇，等.阜陽市2011年手足口病實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果分析[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2013,28(9):796-800.

[6]宋建,都鵬飛,程邦寧，等.合肥市0～14歲人群柯薩奇病毒A組16型和腸道病毒71型的感染狀況調(diào)查[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2014,21(7):1013-1015.

[7]殷繼東,伍仕敏,項(xiàng)杰，等.2011年武漢及周邊城市手足口病病原學(xué)及流行病學(xué)研究[J].軍事醫(yī)學(xué),2013,37(6):435-438.

[8]許國章,倪紅霞,易波，等.浙江省寧波市2008～2011年手足口病流行病學(xué)及病原學(xué)特征分析[J].中華流行病學(xué)雜志,2013,34(4):361-365.

[9]譚徽,謝群,何清懿，等.湖南省郴州市2009～2011年手足口病流行病學(xué)特征研究[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2014,41(2):329-332.

[10]梁勇彪,屈雅川,曹棨，等.手足口病感染病毒分布及感染趨勢評估[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2013,23(22):5485-5487.

Analysis on results of Coxsackie virus nucleic acid detection in HFMD patients*

WANGWu-qi1,SUGuo-sheng2△,WEIShan-qiu2

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,YulinMunicipalHospitalofChineseMedicine,Yulin,Guangxi537000,China;2.DepartmentofClinicalLaboratory,NanningMunicipalFourthPeople′sHospital/GuangxiAIDSClinicalTreatmentCenter,Nanning,Guangxi530023,China)

Objective To investigate the clinical application value of Coxsackie virus nucleic acid detection in the patients with hand-foot-mouth disease(HFMD).Methods The real-time fluorescent PCR technology was adopted,with a highly conserved region of EV71/CA16 genomic coding regionas the target area,the specific primers and fluorescent probes were set,EV71 RNA/CA16 RNA was detected by the one-step method of RT-PCR amplification.Results In 428 patients samples,136 cases were EV71-RNA positive,6 cases were CA16-RNA positive,including 1 case of EV71-RNA positive in throat swabs and anal swabs and CA16-RNA positive in throat swab.And there were 40 cases (80 specimens) of EV71-RNA positive in swabs and anal swabs,46 cases of single EV71-RNA positive in anal swab,10 cases of single EV71-RNA positive in throat swabs.In 6 cases of CA16-RNA positive specimens,4 cases were positive in anal swab,two cases were positive in throat swab.Conclusion The Coxsackie nucleic acid testing in HFMD patients has an important guiding significance for judging the severe patients and their prognosis and has an important reference value for guiding clinic to formulate the treatment plan.

foot and mouth disease; coxsackie virus; nucleic acid detection; gene

廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳自籌經(jīng)費(fèi)科研課題(Z2010483)。

王武琦，女，本科，主管技師，主要從事臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)研究。

△通訊作者，E-mail：suguoshengv@sina.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.18.016

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1672-9455(2015)18-2688-02

2015-04-15

2015-05-25)