CELL-DYN Sapphire血液分析儀的CD61免疫學法、光學法、電阻抗法在低值血小板計數(shù)中的比較與應用

張馳，張洪波

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院檢驗科，湖北武漢430030)

CELL-DYN Sapphire血液分析儀的CD61免疫學法、光學法、電阻抗法在低值血小板計數(shù)中的比較與應用

張馳，張洪波

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院檢驗科，湖北武漢430030)

目的評價和比較CELL－DYN Sapphire血液分析儀的3種檢測方法在低值血小板(PLT)檢測方面的優(yōu)劣性。方法選擇基礎血液病或腫瘤化療后引起的PLT低于50×109/L 100例，分別使用電阻抗法、光學法和CD61免疫學法3種方法進行PLT計數(shù)，并與顯微鏡手工法(MPLT)作比較。運用SPSS 19.0和MedCalc V12.7.2.0分析軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析、Passing－Bablok回歸分析和Bland－Altman偏倚分析。結(jié)果ANOVA分析顯示，電阻抗法、光學法PLT計數(shù)與MPLT比較，差異有統(tǒng)計學意義(分別為P=0.00，P=0.002)，CD61免疫學法與MPLT差異無統(tǒng)計學意義(P=0.915);OPLT和CD61免疫學法與MPLT的相關性較好(分別為slope 1.0，95%CI為0.95～1.06，r=0.946和slope 1.0，95%CI為0.99～1.01，r=0.998)，電阻抗法與MPLT的相關性較差(slope 1.27，95%CI為1.10～1.44，r=0.845)。通過偏差分析，電阻抗法、光學法PLT計數(shù)比MPLT檢測的數(shù)值更高(差異均值分別為6.3、1.3)，CD61免疫學法與MPLT檢測的數(shù)值差異無統(tǒng)計學意義(差異均值=－0.02)。結(jié)論在低值PLT的檢測中，電阻抗法與MPLT存在明顯的統(tǒng)計學差異，相關性差，且結(jié)果有明顯偏差(偏高);光學法與MPLT存在統(tǒng)計學差異，結(jié)果仍存在少量偏差(偏高)，但相關性較好;而CD61免疫學法與MPLT均值無明顯差異，相關性好，結(jié)果無明顯偏差。所以，當臨床出現(xiàn)低值病例時，推薦使用CD61免疫學法PLT進行計數(shù)。

低值PLT;CD61免疫學法;光學法;電阻抗法;CD－SAPPHIRE;預防性血小板輸注

如何準確地計數(shù)外周血循環(huán)中的血小板(PLT)，一直以來都是醫(yī)學界的熱門話題。但實際工作中，尤其是在低值PLT計數(shù)時，想得到一個準確的結(jié)果，卻絕非易事。當今市面上的血液分析儀大多數(shù)采用電阻抗法，即庫爾特原理。因為其本身特性的限制，易受細胞碎片、小紅細胞、大PLT、PLT聚集簇、細菌等非PLT顆粒的影響，這種缺陷對低值PLT樣本進行計數(shù)時，影響尤為顯著。而雅培公司的CD－SAPPHIRE血液分析儀在保留電阻抗法的同時，增加從兩維度分析細胞的多角度散射光法，使小紅細胞、紅細胞碎片與PLT更容易分辨，提高了PLT測定的準確度和精密度。但因光學法每次計數(shù)PLT的絕對數(shù)量低于電阻抗法，其重復性仍劣于電阻抗法。此外，該設備還具有免疫學原理和流式細胞術相結(jié)合的技術檢測PLT，即利用CD61單克隆抗體特異性結(jié)合PLT表面糖蛋白Ⅲa的特性，先用含有熒光基團(如異硫氰酸熒光素)的單克隆抗體(CD41或CD61)標記PLT，排除血液中“非PLT顆?！钡母蓴_，再行計數(shù)，使其準確性有所提高[2]，對檢測低值PLT標本和存在干擾的病理性血液標本具有重要意義[3]。我們將系統(tǒng)性地探討CDSAPPHIRE血液分析儀CD61免疫學法與其它兩種分析方法(電阻抗法和光學法)比較的優(yōu)劣性和臨床應用價值。

材料和方法

一、一般材料

2012年6月至12月，在華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院收集全血標本光學法(OPLT)計數(shù)≤50×109/L的病例100例，其中男50例，女50例，平均年齡45歲(7～87歲)，中位數(shù)為47歲。所有病例都是血液病或腫瘤化療后引起的PLT減低的患者[4]?？崭钩槿§o脈血2 mL置于含乙二胺四乙酸二鉀(EDTA－K2)抗凝劑的真空管中，所有檢測均在標本采集后2 h內(nèi)完成。剔除所有儀器提示有PLT聚集警示，或者有其它干擾警示(如冷凝集或PLT異常分布等)的檢測樣本的結(jié)果。

二、儀器和試劑

1.儀器美國雅培公司CELL－DYN SAPPHIRE全自動血液分析儀，Leica光學顯微鏡，改良牛鮑細胞計數(shù)板，20 μL微量采血管，美國BD公司EDTA－K2真空采血管。

2.試劑CELL－DYN SAPPHIRE原裝進口配套試劑、原裝CELL－DYN 29 Plus Control(with Retic)質(zhì)控品(level－L、N、H)，原裝CELL－DYN Immuno PLT(CD61)單克隆試劑管，PLT稀釋液使用10 g/L草酸銨溶液，按《全國臨床檢驗操作規(guī)程(第三版)》[5]配制，并于4℃冰箱保存。

三、試驗方法

1.儀器經(jīng)培訓考核合格的人員操作，測定時儀器在校準期內(nèi)，并按要求進行重復性、精密度、攜帶污染率試驗[10]，同時用配套低、中、高值3種質(zhì)控品進行質(zhì)控檢測。以確保各自儀器性能的穩(wěn)定。

2.CD61免疫學法、光學法和電阻抗法測定的重復性分別為1.40%、1.52%和2.44%，攜帶污染率分別為0.113%、0.135%和0.233%，均符合儀器技術指標要求[6]。精密度的測定，選取3個PLT(低、中、高值)樣本，分別使用3種方法計數(shù)，測定10次，測得PLT的、s、CV。

3.CD－SAPPHIRE血液分析儀的計數(shù)法(電阻抗法、光學法、CD61免疫學法)EDTA－K2抗凝管采集空腹靜脈血后，按照制造商說明書要求，在CELL－DYN SAPPHIRE分析儀執(zhí)行全血測定，并使用3種方法來檢測PLT，即電阻抗法、光學法和CD61免疫學法。電阻抗法和光學法在儀器的常規(guī)模式下同時完成檢測，即“CBC模式”。CD61免疫學法在儀器的特殊模式下完成檢測，即“CBC+ CD61模式”。進樣模式均采用閉合自動進樣模式。

4.PLT計數(shù)參考方法(手工法)該法為世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦[6－8，11]。按《全國臨床檢驗操作規(guī)程(第3版)》[5]操作。手工法由2名主管及以上老師雙盲法完成計數(shù)，結(jié)果取2次結(jié)果的均值(誤差＜5%)。所有操作均在2 h內(nèi)完成。

四、統(tǒng)計學方法

以PLT手工計數(shù)法(MPLT)為對照組，使用單因素方差分析，來檢驗4組均值差異是否有統(tǒng)計學意義，然后再使用Dunnett檢驗分別檢驗MPLT與電阻抗法、光學法、CD61免疫學法的PLT均值是否存在明顯差異;使用線性回歸分析，分別計算MPLT與電阻抗法、光學法、CD61免疫學法之間的皮爾森相關系數(shù)(r)、確定系數(shù)(R2)，來分別確定它們之間的線性相關性;使用BLANDALTMAN分析來評估均值偏差，分別計算MPLT法與電阻抗法、光學法、CD61免疫學法的均值差、標準差、95%可信區(qū)間的差異;然后以手工法PLT計數(shù)為參考方法，通過秩和檢驗分析臨床上依據(jù)電阻抗法、光學法、CD61免疫學法的PLT結(jié)果進行不合理PLT輸注的發(fā)生頻率。以上所有的統(tǒng)計分析均使用Microsoft Office Excel 2012、MedCalc V12.7.2.0和SPSS 13.0軟件完成。

結(jié)果

一、電阻抗法、光學法和CD61免疫學法PLT精密度測定結(jié)果

結(jié)果顯示均具有較好的精密度，變異系數(shù)(CV)均＜4.0%，符合儀器技術指標要求[6]。見表1。

二、手工法與CD61免疫學法、光學法和電阻抗法PLT計數(shù)的比較

共收集100份樣本。在CD－SAPPHIRE自動分析儀進行檢測時，分別得到電阻抗法結(jié)果82例(82%)，光學法結(jié)果100例(100%)，CD61免疫學法PLT結(jié)果100例(100%)，其中電阻抗法PLT計數(shù)有18例(18%)儀器未提供結(jié)果。在儀器檢測的同時，MPLT計數(shù)PLT，獲得結(jié)果100例(100%)。MPLT、電阻抗法、光學法、CD61免疫學法PLT的±s分別為(25.14±12.73)×109/L、(35.11±13.68)×109/L、(26.45±13.06)×109/L、(25.12±12.72)×109/L。

運用SPSS19.0軟件進行Kolmogorov－Smirnov test分析，4組數(shù)據(jù)P均＞0.05，無明顯線性偏離，顯示呈近正態(tài)分布。MPLT(100例)、電阻抗法(82例)、光學法(100例)、CD61免疫學法PLT (100例)P值分別為0.596、0.706、0.755、0.801。

運用SPSS 19.0軟件對4組PLT結(jié)果均值進行ANOVA分析:Levene=0.915，P=0.434，所以方差齊;F=10.212，P=0.000，4組均值差異有統(tǒng)計學意義;再行Dunnett檢驗進行兩兩之間的比較，發(fā)現(xiàn)MPLT與電阻抗法的均值差異有統(tǒng)計學意義(P =0.000)，MPLT與光學法的均值差異有統(tǒng)計學意義(P=0.002)，MPLT與CD61免疫學法的均值差異無統(tǒng)計學意義(P=0.915)。

運用MedCalc V12.7.2.0軟件，以MPLT為參照，分別與電阻抗法、光學法、CD61免疫學法PLT進行相關性分析、Passing－Bablok回歸分析和Bland－Altman偏倚分析。結(jié)果見表2。電阻抗法、光學法、CD61免疫學法PLT及MPLT的PLT計數(shù)之間均無明顯線性偏離(P均＞0.05)，但光學法(r =0.946)、CD61免疫學法PLT(r=0.998)的線性相關性明顯好于電阻抗法(r=0.845)。見表2。

電阻抗法、光學法、CD61免疫學法PLT與MPLT進行Passing－Bablok回歸分析，回歸方程分別為Y=－1.066 7+1.266 7X，Y=0.650 0+ 1.000 0X，Y=－0.150 0+1.000 0X。因斜率的95%CI不包含1，說明真實斜率與理論值1之間有明顯不同，則2組數(shù)據(jù)之間存在明顯的比例量系統(tǒng)誤差，所以電阻抗法(斜率為1.27，95%CI為1.10～1.44)與手工法PLT計數(shù)差異有統(tǒng)計學意義，而光學法(斜率為1.0，95%CI為0.95～1.06)和CD61免疫學法PLT(斜率為1.0，95%CI為0.99～1.01)與MPLT PLT計數(shù)均無明顯差異。見圖1～3。

對電阻抗法、光學法、CD61免疫學法PLT與MPLT進行Bland－Altman偏倚分析。CD61免疫學法PLT(Mean difference=－0.02，P=0.70)與MPLT PLT計數(shù)無明顯偏倚，而光學法(Mean difference=1.3，P=0.70)和電阻抗法(Mean difference=6.3，P=0.16)與MPLT PLT計數(shù)均有輕度偏倚，但電阻抗法的偏倚程度明顯高于光學法。

為了評估實驗室提供的不準確的PLT計數(shù)值對臨床的影響，我們先假定世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的MPLT PLT計數(shù)值最為接近患者真值，把參照MPLT PLT進行的PLT預防性輸注，分別與參照自動分析儀提供的電阻抗法、光學法、CD61免疫學法PLT進行的輸注患者的例數(shù)進行比較。然后設定4個等級的PLT輸注閾值: 5×109/L，10×109/L，20×109/L和50×109/L;臨床上依據(jù)自動分析儀PLT結(jié)果(3種測定方法)進行PLT預防性輸注，導致的輸注不足和輸注過度情況，見表3～5。

H檢驗顯示電阻抗法、光學法與MPLT比較，PLT閾值為50×109/L組的輸注不合理情況和其它各組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。而CD61免疫學法與MPLT比較，不同PLT閾值各組之間差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

討論

CELL－DYN SAPPHIRE血液分析儀PLT檢測方法在保留了傳統(tǒng)的庫爾特原理外，還采用了雙維度多角度散射光檢測計數(shù)，并利用免疫學原理和流式細胞術相結(jié)合的技術使用CD61免疫學PLT計數(shù)法[10]。本試驗在保證分析儀3種PLT檢測法重復性、攜帶污染率、精密度均合格的基礎上，主要研究該儀器3種方法在低值PLT檢測方面的優(yōu)劣性。通過ANOVA分析發(fā)現(xiàn)，MPLT與CD61免疫學法PLT計數(shù)均值無顯著性差異，但與電阻抗法、光學法PLT計數(shù)的均值差異有統(tǒng)計學意義(表1)。通過PASSING－BABLOK回歸分析發(fā)現(xiàn)，除電阻抗法外，光學法和CD61免疫學法與MPLT PLT計數(shù)的相關性均較好，且CD61免疫學法要優(yōu)于光學法(圖1～3)。通過偏倚分析發(fā)現(xiàn)，與MPLT相比，電阻抗法比光學法的偏倚更加顯著，而CD61免疫學法與MPLT之間無顯著偏倚(圖1～3)。文獻中得知[11－15]，電阻抗法由于方法學局限，不能很好地把血液中非PLT顆粒從PLT中精準的區(qū)別開來;光學法雖提高了PLT甄別的靈敏度，但卻因受到顆粒體積的限制，對大PLT檢測無能為力;而CD61免疫學法因為利用PLT表面特有物質(zhì)——表面糖蛋白Ⅲa，使用單克隆抗體特異性標記PLT，可以有效排除血液中“非PLT顆?！钡母蓴_，獲得更為準確的PLT結(jié)果。本研究所用樣本主要來源于血液病或者化療后患者，該群體血液中更可能存在紅細胞碎片、白細胞凋亡顆粒等非PLT干擾顆粒，從而使得實驗結(jié)果更有代表性，更能反映3種方法之間的優(yōu)劣性。

臨床醫(yī)生在進行PLT預防性輸注(prophylactic platelet transfusions，PPT)干預時，如PLT計數(shù)不準確有可能會發(fā)生“PLT輸注不足”與“PLT輸注過度”的輸注情況?！癙LT輸注不足”是指:臨床醫(yī)生依據(jù)實驗室提供的假性增高的PLT數(shù)值(真值低于輸注閾值)，對本該進行輸注治療的患者未進行輸注，造成治療的延誤;“PLT輸注過度”是指，臨床醫(yī)生依據(jù)實驗室提供的假性減低的PLT數(shù)值(真值高于輸注閾值)，對本不該進行輸注治療的患者進行了不必要的輸注，造成經(jīng)濟上或醫(yī)療資源的浪費。在一些研究中，自動化血液分析儀由于方法學局限，可能會出現(xiàn)一些假性增高的PLT結(jié)果，對臨床預防性PLT輸注可能存在潛在影響[16－17]。從表3～5可知，因電阻抗法PLT會明顯高于實際值，當使用較低PLT輸注閾值時，會導致患者PLT輸注不足，只有當閾值升至50×109/L時，才能減低PLT輸注不足的情況發(fā)生，但同時可能導致一些患者過度輸注和醫(yī)療資源的浪費。光學法的情況稍好，但也不容樂觀，當閾值為5×109/L、10×109/L或20×109/L時，仍有20%以上輸注不足的情況。如能依據(jù)CD61免疫學法PLT值進行PLT輸注，即使PLT值下降到5 ×109/L，也可基本保證臨床干預治療的正確性。因為準確檢測低值PLT的困難性客觀存在，臨床醫(yī)生應對不準確PLT導致的PLT輸注不足的情況引起重視，也應對臨床實驗室采用何種方法檢測PLT有充分了解，這樣才能根據(jù)實際情況，制定合適的預防性PLT輸注閾值，給患者帶來積極、正確的干預治療。雖然PLT的過度輸注并不會對患者帶來致命傷害，但從減輕患者的經(jīng)濟負擔、減低輸血帶來的感染風險、減少醫(yī)療資料的浪費方面有著積極的醫(yī)學意義。本研究結(jié)果提示，臨床實驗室在低值PLT檢測中，尤其對于血液病或腫瘤化療后患者，應避免使用電阻抗法計數(shù)，雖光學計數(shù)法可接受，但在有條件的情況下，宜采用CD61免疫學計數(shù)法，為臨床提供一個更可靠的試驗數(shù)據(jù)。

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Comparison and application of low platelet counts by CD61 immunological，optical，electrical impedance methods of CELL-DYN Sapphire hematology analyzer

ZHANG Chi1，ZHANG Hongbo2.(Department of Clinical Laboratory，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Hubei Wuhan 430030，China)

ObjectiveTo evaluate and compare the advantages and disadvantages of 3 detection methods of CELL－DYN Sapphire hematology analyzer in the aspect of low platelet(PLT)detection.MethodsA total of 100 patients whose platelet＜50×109/L caused by basis hematonosis or after chemotherapy were enrolled.PLT counts were determined by electrical impedance method(IPLT)，optical method(OPLP)and CD61 immunological method (CD61－PLT).The results were analyzed comparatively with those of manual microscopy.Variance analysis，Passing－Bablok regression analysis and Bland－Altman bias analysis were performed by SPSS 19.0 and MedCalc V12.7.2.0 softwares statistically.ResultsANOVA analysis showed that there was statistical significance for IPLT and OPLT with manual method(MPLT).(P=0.00，P=0.002).CD61－PLT and MPLT had no statistical significance(P=0.915).OPLT and CD61－PLT had good correlation with MPLT without statistical significance[slope 1.0，95%confidence interval(CI):0.95－1.06，r=0.946 and slope 1.0，95%CI:0.99－1.01，r=0.998].IPLT had poor correlation with MPLT with statistical significantce(slope 1.27，95%CI:1.10－1.44，r=0.845).According to variance analysis，the values of IPLT and OPLT were higher than those of MPLT(mean deviations were 6.3 and 1.3).CD61－PLT and MPLT had no significant difference(mean deviation was－0.02).ConclusionsIPLT has significantly statistical difference with MPLT for low PLT determination，with poor correlation，and the result has a significant upward deviation.The means of OPLT and MPLT have statistical significance with good correlation，but the result has a still small upward deviation.The CD61－PLT and MPLT have no obvious difference with a good correlation，and the results are not significantly different.Therefore，it is recommended that we can use CD61－PLT as a new reference method and OPLT and IPLT as alternative methods.

Low platelet;CD61 immunological method;Optical method;Electrical impedance method; CD－SAPPHIRE;Prophylactic platelet transfusion

1673－8640(2015)03－0274－06

R446.11

A

10.3969/j.issn.1673－8640.2015.03.018

2014－07－03)

(本文編輯:范基農(nóng))

張馳，男，1980年生，碩士，主管技師，主要從事感染免疫學相關研究。