熒光定量PCR定量檢測5種假絲酵母菌方法的建立

夏乾峰，傅瓊瑤，鄔強(qiáng)，覃西，姚茂忠，黃綿慶，邢桂蘭，錢士勻

(1.海南海醫(yī)藥物安全性評價(jià)研究有限責(zé)任公司，海南海口570102; 2.海南醫(yī)學(xué)院熱帶醫(yī)學(xué)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，海南?？?70102)

熒光定量PCR定量檢測5種假絲酵母菌方法的建立

夏乾峰1，傅瓊瑤2，鄔強(qiáng)2，覃西1，姚茂忠1，黃綿慶1，邢桂蘭1，錢士勻1

(1.海南海醫(yī)藥物安全性評價(jià)研究有限責(zé)任公司，海南?？?70102; 2.海南醫(yī)學(xué)院熱帶醫(yī)學(xué)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，海南?？?70102)

目的建立并評價(jià)從血液標(biāo)本中檢測5種假絲酵母菌的熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法。方法以5種假絲酵母菌共有的高度保守序列為靶序列，設(shè)計(jì)特異引物和探針進(jìn)行檢測，優(yōu)化定量PCR體系，并進(jìn)行方法學(xué)評價(jià)。結(jié)果建立的熒光定量PCR方法，其線性范圍為101～109CFU/mL;靈敏度為5 CFU/mL;批內(nèi)和批間CV值均＜5%;對19份模擬血液標(biāo)本進(jìn)行檢測，其中分別含有5種假絲酵母菌的標(biāo)本均為陽性，而分別含有常見血液感染曲霉菌和細(xì)菌的檢測結(jié)果均為陰性。結(jié)論建立的檢測血中假絲酵母菌熒光定量PCR方法快速、準(zhǔn)確，結(jié)果可靠，可對常見的臨床血液感染假絲酵母菌進(jìn)行定量檢測。

假絲酵母菌;實(shí)時PCR;定量

隨著廣譜抗菌藥物、免疫抑制劑等的廣泛使用，以及介入治療的大量開展，侵襲性真菌感染(invasive fungal infection，IFI)逐年增多，其發(fā)病率和死亡率居高不下。IFI已成為影響人類生活質(zhì)量、威脅生命健康的重要疾病之一[1]。白假絲酵母菌是IFI最重要的致病菌，但近年來臨床分離的非白假絲酵母珠菌顯著增多，如光滑假絲酵母、熱帶假絲酵母、克柔假絲酵母和近平滑假絲酵母。

由于IFI大多發(fā)生在有嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病的患者中，病死率高，假絲酵母病病死率可達(dá)40%[2]。兩個獨(dú)立研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，IFI的死亡率與抗真菌治療時機(jī)有重大關(guān)系，48 h后對患者進(jìn)行抗真菌治療的死亡率比12 h內(nèi)采取抗真菌治療高25%，而血液培養(yǎng)陽性率18 h內(nèi)僅為9%，24 h內(nèi)為23%[3－4]。建立快速檢測真菌的方法，早期獲取檢測結(jié)果可指導(dǎo)臨床及時采取適當(dāng)治療方案，將大大降低患者的死亡率[5]。然而，培養(yǎng)法耗時長且不夠敏感，常常延誤診斷和治療，而且有45%～70%的播散性假絲酵母病和幾乎全部的IA的血培養(yǎng)結(jié)果都是陰性[6];絕大多數(shù)IFI患者無特異的臨床表現(xiàn)，只能根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)或典型的影像學(xué)表現(xiàn)進(jìn)行判斷，很難與其它疾病區(qū)分，這就決定了該類疾病抗真菌治療絕大多數(shù)是經(jīng)驗(yàn)性治療[7]。盡管傳統(tǒng)真菌鏡檢、培養(yǎng)以及組織學(xué)檢查仍然是診斷真菌病的金標(biāo)準(zhǔn)，但非培養(yǎng)方法因其高度敏感和特異性在真菌病的診斷上日益成為重要的工具。

實(shí)時聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)因其信號檢測與PCR擴(kuò)增同管、同步進(jìn)行，屬于均相測定，故可減少污染，操作簡化，并且可自動化完成擴(kuò)增及定量檢測[8]。我們通過生物信息學(xué)方法確定5種假絲酵母菌共同保守序列，設(shè)計(jì)特異性引物和熒光探針，建立檢測5種假絲酵母菌的實(shí)時PCR方法，并進(jìn)行了方法學(xué)評價(jià)。

材料和方法

一、材料

1.菌株來源白假絲酵母菌(ATTCC 10231)、近平滑假絲酵母菌(ATTCC 22019)熱帶假絲酵母菌(C2f)、光滑假絲酵母菌(C6e)及克柔假絲酵母菌(C6a)由國家醫(yī)學(xué)真菌保藏中心提供。常見的血液感染病原菌為海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科微生物室臨床分離保存，包括:煙曲霉菌、黃曲霉菌、土曲霉菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、糞腸球菌、屎腸球菌、肺炎鏈球菌、沙門菌、陰溝腸桿菌。

2.儀器與試劑引物和探針由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成;Fastfire qPCR PreMix(Probe)反應(yīng)試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司;真菌基因組DNA提取試劑盒為北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn);沙保弱培養(yǎng)基、血平板均由海南醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室配制。Mx3005P QPCR System熒光定量PCR儀由美國Agilent公司生產(chǎn);電泳成像系統(tǒng)為Tanon 1600成像系統(tǒng)。

二、方法

1.標(biāo)準(zhǔn)品DNA的制備將培養(yǎng)好的白假絲酵母菌加入生理鹽水中混勻，采用牛鮑計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)算出菌液濃度，進(jìn)行10倍梯度稀釋得6個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品103～108CFU/mL。真菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，保存于－20℃。

2.引物探針的設(shè)計(jì)在NCBI的Gen Bank數(shù)據(jù)庫獲取5種假絲酵母菌的5.8srRNA、28srRNA基因、ITS區(qū)的DNA序列分別為:C.albicans (AM998790)、C.dubliniensis(FN178506)、C.tropicalis (AB437044)、C.parapsilosis(GU373657)、C.glabrata (AM492797)和C.krusei(AY235807)。Alignment在線工具對各病原體靶基因核苷酸序列進(jìn)行多序列比較、分析，尋找出適合設(shè)計(jì)引物和探針的核苷酸序列區(qū)域。采用計(jì)算機(jī)軟件PRIMER EXPRESS 2.0，以白假絲酵母菌靶基因(基因序列號，AM998790)進(jìn)行引物和探針設(shè)計(jì)，引物和探針須為5種酵母菌的共同序列;探針的5'端標(biāo)記FAM熒光報(bào)告基團(tuán)，3'端標(biāo)記非熒光的淬滅基團(tuán)BHQ1。P1:5'－CAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGC－3';P2:5'－GGGCGCAATGTGCGTTCAA－3';probe: FAM－5'ATCGATGAGAACGCAGCGAATGCGATA3'－BHQ1。PCR產(chǎn)物長度為113 bp，引物和探針均由寶生物工程(大連)有限公司合成及標(biāo)記。

3.熒光定量PCR體系的建立選用20 μL反應(yīng)體系，模板用量2 μL，F(xiàn)astfire qPCR PreMix (Probe)13 μL，10 μmol/L引物各1 μL，10 μmol/L探針0.5 μL。反應(yīng)條件:50℃2 min，95℃2 min; 95℃15 s，58℃35 s，共40個循環(huán)。在擴(kuò)增結(jié)束后按同一條件分析數(shù)據(jù)，確定各樣品的閾值循環(huán)數(shù)(threshold cycle，Ct)。

4.方法學(xué)評價(jià)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，維持相關(guān)系數(shù)(r)在0.99以上，判斷方法的線性范圍。對高濃度(1.0×106CFU/mL)和低濃度(1.0× 103CFU/mL)陽性的樣品重復(fù)做5個平行管，定量結(jié)果計(jì)算CV值，判斷批內(nèi)重復(fù)性;相同的樣品重復(fù)檢測5次，重復(fù)檢測5次，定量結(jié)果計(jì)算CV值，判斷批間重復(fù)性。將DNA模板以10倍連續(xù)稀釋至1 CFU/mL，用ddH2O做陰性對照，進(jìn)行熒光定量PCR，能區(qū)別于陰性對照的最低濃度即為該法的靈敏度。對常見的血液感染致病微生物進(jìn)行檢測，鑒定其特異性。

5.模擬臨床標(biāo)本檢測將100 μL濃度為104CFU/mL菌液的白假絲酵母菌、近平滑假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌及克柔假絲酵母菌分別種植于健康體檢者1 mL血液中，提取總DNA后，采用本法檢測。

結(jié)果

一、標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將白假絲酵母菌標(biāo)準(zhǔn)品DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋得6個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品:103～108CFU/mL，分別以每個濃度標(biāo)準(zhǔn)品作為模板進(jìn)行熒光定量檢測，所得熒光曲線經(jīng)軟件處理自動獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。

二、方法學(xué)評價(jià)

1.線性范圍當(dāng)白假絲酵母菌DNA倍比稀釋度在101～109CFU/mL時，有很好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.997。

2.靈敏度將能擴(kuò)出目的片段、出現(xiàn)典型S型曲線的最低濃度定為檢出限，本法的檢出限為5 CFU/mL。

3.重復(fù)性分別對高、低濃度樣品進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)性測定，結(jié)果低濃度樣品的批內(nèi)重復(fù)性CV為4.32%，批間CV為4.87%;高濃度樣品的批內(nèi)CV為3.12%，批間CV為3.58%，兩者CV值均＜5%。

4.特異性對多種常見血液感染曲霉菌和細(xì)菌進(jìn)行檢測，未發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果，證明本法特異性強(qiáng)。

5.模擬標(biāo)本檢測模擬白假絲酵母菌、近平滑假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌及克柔假絲酵母菌血液感染的標(biāo)本均能夠用本法檢出。

討論

熒光定量PCR分為染料法和探針法兩類。染料法利用游離DNA染料不發(fā)射熒光，而一旦與雙鏈DNA結(jié)合后，熒光值大大增強(qiáng)的原理，其優(yōu)勢在于能夠監(jiān)測任何雙鏈DNA，只需設(shè)計(jì)普通引物，不必設(shè)計(jì)探針，使檢測方法簡化，成本低;但也正是由于染料能夠與任何雙鏈DNA結(jié)合，因此其也能和非特異性產(chǎn)物如引物二聚體、非特異擴(kuò)增產(chǎn)物、雙鏈模板等結(jié)合，產(chǎn)生非特異熒光信號，降低了特異性，故不適于臨床檢測[9]。探針法包括TaqMan探針、蝎型探針、分子信標(biāo)等。這些探針均是在與模板互補(bǔ)的同一寡核苷酸鏈上，分別標(biāo)記熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，每一次擴(kuò)增中通過水解或者雜交等方式破壞兩者之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)，從而發(fā)出與擴(kuò)增產(chǎn)物等量的熒光信號，故其特異性高，定量準(zhǔn)確，因而被廣泛應(yīng)用于科研和臨床診斷中[10]。

近年來，敏感、特異的早期快速診斷方法用于真菌診斷研究的報(bào)道逐漸增多。包括免疫學(xué)技術(shù)檢測體液、組織中的真菌抗原(包括葡聚糖、甘露聚糖、蛋白質(zhì)、脂類、黑色素)或抗體;分子生物學(xué)技術(shù)用于真菌的檢測對某些深部真菌病的早期診斷具有重要價(jià)值[11]。分子生物學(xué)技術(shù)主要采用真菌核糖體RNA基因(rDNA)片段作為靶基因。真菌核糖體的基因包括4種，25S rDNA、5S rDNA、18S rDNA和5.8S rDNA。它們在染色體上頭尾相連、串聯(lián)排列，相互之間由間隔區(qū)分隔。間隔區(qū)是位于核糖體大小亞基基因之間的核苷酸序列，因其具有一定種間特異性和種內(nèi)保守性而被作為種間鑒定的靶點(diǎn)。我們通過對5種假絲酵母菌的rDNA片段進(jìn)行多序列比較、分析，獲得保守序列，并通過BLAST比對，設(shè)計(jì)出特異的PCR引物和探針。該法能夠檢測出模擬血液感染的5種假絲酵母菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株，并且和常見的臨床血液感染曲霉菌和細(xì)菌無交叉反應(yīng)，有較好的準(zhǔn)確性和特異性。

本研究所建立的實(shí)時熒光定量PCR方法可對5種假絲酵母菌進(jìn)行準(zhǔn)確定量，為臨床血液假絲酵母菌感染提供了快速、準(zhǔn)確的方法。

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(本文編輯:范基農(nóng))

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《檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)》編輯部

Establishment of fluorescence quantitation PCR for the quantitative detection of five species of Candida

XIA Qianfeng1，F(xiàn)U Qiongyao1，WU Qiang1，QIN Xi1，YAO Maozhong1，HUANG Mianqing1，XING Guilan1，QIAN Shiyun2.(1.Research for Drug Safety Evaluation of Hainan Province，Hainan Haikou，China;2.The Faculty of Laboratory Medicine and Tropical Medicine，Hainan Medical College，Hainan Haikou 570102，China)

ObjectiveTo establish and evaluate fluorescence quantitation polymerase chain reaction(PCR)for the quantitative detection of 5 species of Candida.MethodsThe presence of DNA from pathogens in the Candida species was detected by the PCR targeting internal transcribed spacer region of fungal gene.The PCR was optimized and evaluated methodologically.ResultsThe fluorescence quantitation PCR showed a wide range of linearity from 101－109CFU/mL，high sensitivity 5 CFU/mL，within－run and between－run coefficients of variation(CV)＜5%.When the PCR was applied directly to identify 19 mocked double－blind blood samples，5 of them were positive to 5 species of Candida，and the other 14 of them were negative to other pathogens.ConclusionsThe PCR may be appropriate for clinical laboratories as accurate，rapid and reliable determination for the most frequently encountered Candida species.

Candida;Fluorescence quantitation polymerase chain reaction;Quantitation

1673－8640(2015)03－0265－04

Q503

A

10.3969/j.issn.1673－8640.2015.03.016

2014－10－20)

海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(813187);海口市重點(diǎn)科技計(jì)劃項(xiàng)目(2012－063)

夏乾峰，1979年生，博士，教授，從事臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)教學(xué)和科研工作。

錢士勻，聯(lián)系電話:0898－66893746。