乳膠顆粒凝集法檢測(cè)梅毒特異性抗體的性能評(píng)估

胡亮，陳藝，陳長(zhǎng)強(qiáng)，瞿晨蕓，顧志冬，樊綺詩

(1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院北院檢驗(yàn)科，上海201801; 2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海200025)

乳膠顆粒凝集法檢測(cè)梅毒特異性抗體的性能評(píng)估

胡亮1，陳藝1，陳長(zhǎng)強(qiáng)1，瞿晨蕓1，顧志冬2，樊綺詩1

(1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院北院檢驗(yàn)科，上海201801; 2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海200025)

目的對(duì)乳膠顆粒凝集法梅毒螺旋體特異性抗體檢測(cè)試劑(Mediace TPLA)進(jìn)行性能評(píng)估。方法參考美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)EP系列文件，評(píng)估Mediace TPLA的分析性能。用Mediace TPLA檢測(cè)111例梅毒確診患者和78例排除梅毒感染者的血清，并與化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析法(CMIA)進(jìn)行比較。結(jié)果Mediace TPLA檢測(cè)結(jié)果在8.0、28.6及166.0 T.U.這3個(gè)水平的總變異系數(shù)(CV)分別為8.77%、3.94%和6.57%;檢測(cè)線性范圍為0～250 T.U.;總回收率為95.31%;一定程度的溶血(血紅蛋白＜4.8 g/L)、脂血(甘油三酯＜8 mmol/L)、黃疸(膽紅素＜20 μmol/L)及類風(fēng)濕因子(＜450 IU/mL)對(duì)檢測(cè)結(jié)果無明顯影響;排除梅毒感染的30例抗核抗體(ANA)陽性患者、10例肝炎患者及10例妊娠期婦女血清檢測(cè)結(jié)果為陰性。以CMIA結(jié)果為相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)，Mediace TPLA Cut－off值取10 T.U.時(shí)，其檢測(cè)靈敏度為99%、特異性為100%。結(jié)論Mediace TPLA具有抗干擾能力強(qiáng)、重復(fù)性好、準(zhǔn)確性好、線性范圍寬及特異度高等特點(diǎn)，可在全自動(dòng)生化分析儀中使用。

梅毒;乳膠顆粒凝集法;血清學(xué)檢測(cè)

梅毒(syphilis)是由梅毒螺旋體感染人體所引起的一種常見的性傳播疾病。其特點(diǎn)為病程長(zhǎng)，病變可以侵蝕皮膚黏膜及全身各個(gè)組織器官，臨床表現(xiàn)多種多樣，婦女感染后如不治療可垂直傳染給下一代[1]。近年來，梅毒發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。根據(jù)中國(guó)疾病預(yù)防控制中心發(fā)布的《2012年度全國(guó)法定傳染病疫情概況》的數(shù)據(jù)，2012年我國(guó)梅毒發(fā)病人數(shù)逾40萬，居乙類傳染病第3位。梅毒已是臨床輸血前、術(shù)前及孕前等篩查的基本項(xiàng)目之一。傳統(tǒng)的梅毒螺旋體檢測(cè)方法有快速血漿反應(yīng)素試驗(yàn)(syphilis rapid plasma reagin，RPR)、甲苯胺紅不加熱血清反應(yīng)素試驗(yàn)(tolulized red unheated serum test，TRUST)、熒光密螺旋體抗體吸收試驗(yàn)(fluorescentTreponemalantibody absorption，F(xiàn)TA－ABS)、梅毒螺旋體明膠凝集試驗(yàn)(Treponema pallidum particle agglutination，TPPA)、梅毒螺旋體血凝試驗(yàn)(treponema pallidum hemagglutination assay，TPHA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA)和膠體金法等，這些方法由于沒有實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化、操作繁瑣，已不能滿足臨床實(shí)驗(yàn)室快速、準(zhǔn)確檢測(cè)的要求。近年來，以化學(xué)發(fā)光為原理的梅毒螺旋體抗體檢測(cè)方法正逐步應(yīng)用于臨床，但需配套設(shè)備，只能在有條件的實(shí)驗(yàn)室開展。

乳膠顆粒凝集法梅毒螺旋體特異性抗體檢測(cè)試劑(mediace triponema pallidum latex agglutination，Mediace TPLA)是一種較新的、可開放用于不同檢測(cè)系統(tǒng)的梅毒血清學(xué)檢測(cè)試劑。為了評(píng)估該試劑的臨床適用性，我們參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)EP系列文件，對(duì)其進(jìn)行性能評(píng)估，并與化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析法(chemiluminescent microparticle immunoassay，CMIA)進(jìn)行比較，為臨床實(shí)驗(yàn)室選擇梅毒自動(dòng)化檢測(cè)方法提供參考。

材料和方法

一、材料

收集上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院、瑞金醫(yī)院北院檢驗(yàn)科2012年12月至2013年9月的梅毒陽性血清111例、陰性血清78例，排除梅毒感染的ANA陽性患者血清30例、肝炎患者血清10例及妊娠期婦女血清10例。梅毒的診斷主要依靠實(shí)驗(yàn)室血清學(xué)檢查，本研究中梅毒陽性血清的判斷標(biāo)準(zhǔn)為TPPA及CMIA檢測(cè)結(jié)果同時(shí)陽性，梅毒陰性或排除梅毒感染血清的判斷標(biāo)準(zhǔn)為RPR、TRUST、TPPA及CMIA檢測(cè)結(jié)果均為陰性。所有對(duì)象采用真空管采集靜脈血，2 100×g離心5 min，分離血清后于－20℃保存待用。

二、方法

1.Mediace TPLA采用乳膠顆粒凝集法進(jìn)行檢測(cè)，試劑及配套定標(biāo)品、質(zhì)控品由日本積水醫(yī)療株式會(huì)社生產(chǎn)，儀器為BECKMAN－COULTER AU5800全自動(dòng)生化分析儀。按試劑說明書設(shè)置該項(xiàng)目的參數(shù)，血清9 μL、第1試劑(R1)105 μL、第2試劑(R2)15 μL、測(cè)定波長(zhǎng)700 nm。

2.梅毒抗體(TP－Ab)的檢測(cè)采用CMIA測(cè)定血清中的梅毒螺旋體特異性抗體，試劑及標(biāo)準(zhǔn)品為美國(guó)雅培公司產(chǎn)品，使用上海市臨床檢驗(yàn)中心梅毒特異性抗體質(zhì)控品，儀器為雅培Architect i2000化學(xué)發(fā)光分析儀。嚴(yán)格按試劑說明書及儀器操作手冊(cè)進(jìn)行試驗(yàn)。

3.精密度試驗(yàn)根據(jù)CLSI EP5－A2文件[2]，選擇低、中、高3個(gè)濃度水平的標(biāo)本，每天上、下午分2批實(shí)驗(yàn)，每批做雙份檢測(cè)，連續(xù)檢測(cè)20 d，一共有240個(gè)數(shù)據(jù)。計(jì)算出批內(nèi)不精密度的標(biāo)準(zhǔn)差(s批內(nèi))、批間不精密度的標(biāo)準(zhǔn)差(s批間)、天間不精密度的標(biāo)準(zhǔn)差(s天間)，最后按照方差和的方式將批內(nèi)、批間和天間標(biāo)準(zhǔn)差結(jié)合起來求出總標(biāo)準(zhǔn)差(s總)，計(jì)算出總變異系數(shù)(coefficient of variation，CV)。

4.干擾試驗(yàn)計(jì)算加入干擾物質(zhì)后的實(shí)測(cè)值，共重復(fù)檢測(cè)4次，取平均值，與預(yù)期值比較，得到回收率。

5.分析測(cè)量范圍根據(jù)CLSI EP6－A文件[3]，采用多項(xiàng)式回歸方案進(jìn)行線性評(píng)價(jià)試驗(yàn)。分別選取Mediace TPLA低值(0.5 T.U.)和高值(237.0 T.U.)血清，按比例進(jìn)行梯度稀釋。所有樣品充分混勻，隨機(jī)排列上機(jī)檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)4次。T.U.是參考世界衛(wèi)生組織(WHO)標(biāo)準(zhǔn)品[THE INTERNATIONAL STANDARD for SYPHILITIC HUMAN SERUM(1stinternational standard preparation，established in 1958)]設(shè)定的，1 T.U.相當(dāng)于2 mIU。

6.靈敏度與特異度以CMIA檢測(cè)結(jié)果為相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)，用Mediace TPLA檢測(cè)111例、78例TP－Ab陽性、陰性標(biāo)本，按說明書建議的Cut－off值(10 T.U.)計(jì)算其靈敏度與特異度。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用Excel 13.0計(jì)算均數(shù)(x－)、標(biāo)準(zhǔn)差(s)，并進(jìn)行相關(guān)性分析。

結(jié)果

一、精密度試驗(yàn)

精密度試驗(yàn)結(jié)果顯示，3個(gè)濃度水平的總變異系數(shù)(CV)均＜10%，見表1。

二、干擾試驗(yàn)

干擾試驗(yàn)的結(jié)果均在95%～105%之間，提示試劑的抗干擾能力較強(qiáng)，見表2。

排除梅毒感染的30例ANA陽性患者血清、10例妊娠期婦女血清及10例肝炎患者血清均未對(duì)Mediace TPLA檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生干擾。

三、分析測(cè)量范圍

線性試驗(yàn)結(jié)果顯示相關(guān)系數(shù)(r)為0.996;評(píng)價(jià)結(jié)果顯示Mediace TPLA在0～250 T.U.范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。見圖1。

四、靈敏度與特異度

以CMIA檢測(cè)結(jié)果為相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)，按說明書建議的Cut－off值，其靈敏度為99%、特異度為100%。見表3。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，CMIA定量檢測(cè)結(jié)果與Mediace TPLA定量檢測(cè)結(jié)果在各自線性檢測(cè)范圍內(nèi)無相關(guān)性，見圖2。

189例標(biāo)本中存在1例Mediace TPLA與CMIA結(jié)果不符的情況，Mediace TPLA結(jié)果為陰性，而化學(xué)發(fā)光結(jié)果為弱陽性。用RPR、TRUST及TPPA復(fù)檢該標(biāo)本，結(jié)果均為陰性。

討論

機(jī)體感染梅毒螺旋體后可產(chǎn)生非梅毒螺旋體類脂質(zhì)抗體[即反應(yīng)素(reagin)]和梅毒螺旋體特異性抗體(TP－Ab)。目前，臨床上常用TRUST、RPR等方法檢測(cè)其非特異性抗體，化學(xué)發(fā)光法、TPPA、TPHA、ELISA、FTA－ABS、膠體金等方法檢測(cè)其特異性抗體。上述試驗(yàn)多為手工方法，操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、人為影響因素較多[4]。CMIA的靈敏度與TPPA相當(dāng)，兼具快速、高通量等優(yōu)點(diǎn)，但不能開放用于其它儀器[5]。Mediace TPLA是能應(yīng)用于各種開放生化檢測(cè)平臺(tái)的梅毒螺旋體抗體檢測(cè)試劑，為了分析其臨床適用性，本研究對(duì)其進(jìn)行了性能評(píng)估。

本研究表明，Mediace TPLA具有良好的批內(nèi)、批間和天間精密度，分析測(cè)量范圍較寬，測(cè)定結(jié)果不受輕度溶血、脂血、生理濃度的膽紅素及類風(fēng)濕因子的影響，與現(xiàn)有的只能用于配套檢測(cè)系統(tǒng)的免疫分析試劑性能相當(dāng)。常見的易對(duì)梅毒檢測(cè)結(jié)果造成干擾的病理生理情況，如自身免疫性疾病、妊娠、肝炎等也均未對(duì)Mediace TPLA的檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生干擾。本研究結(jié)果顯示CMIA定量檢測(cè)結(jié)果與Mediace TPLA定量檢測(cè)結(jié)果之間在各自線性范圍內(nèi)無相關(guān)性，這與WATANABE等[9]的研究結(jié)束一致，推測(cè)可能是由于不同檢測(cè)方法所包被的抗原不同所引起，故在進(jìn)行方法學(xué)替代階段應(yīng)及時(shí)向臨床說明。

本研究同時(shí)用Mediace TPLA及CMIA檢測(cè)189例梅毒陰陽性血清，以CMIA結(jié)果為相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)Mediace TPLA的靈敏度及特異度均較高。189例結(jié)果中存在1例不符的情況，該例標(biāo)本Mediace TPLA檢測(cè)結(jié)果為陰性(－1.1 T.U.，Cut－off值為＜10 T.U.)，而CMIA檢測(cè)結(jié)果為弱陽性(1.17 S/CO，Cut－off值為＜1 S/CO)。用RPR、TRUST及TPPA復(fù)檢，結(jié)果均為陰性。結(jié)合該患者的病史、癥狀、體征，可基本排除梅毒既往及現(xiàn)癥感染。在臨床工作中，CMIA出現(xiàn)假陽性的情況也會(huì)出現(xiàn)。有研究者已對(duì)化學(xué)發(fā)光法假陽性的原因進(jìn)行了分析，試劑方面的可能原因包括合成的基因重組多肽抗原過長(zhǎng)、抗原數(shù)量有限、抗原不純、以血清白蛋白作為橋聯(lián)等使非特異性反應(yīng)增高[6－8]。故在梅毒診治過程中應(yīng)結(jié)合病史、癥狀、體征及多種血清學(xué)檢測(cè)方法進(jìn)行綜合判斷。同時(shí)，對(duì)CMIA結(jié)果應(yīng)制定相應(yīng)的復(fù)檢規(guī)則。

總之，采用Mediace TPLA快速檢測(cè)梅毒螺旋體性抗體，具有常規(guī)手工方法的基本性能，可排除人為操作和判斷結(jié)果的誤差。同時(shí)，因能開放應(yīng)用于自動(dòng)生化分析儀，可快速檢測(cè)大量標(biāo)本，提高工作效率，在獻(xiàn)血員篩查、健康人群查體及臨床應(yīng)用中都具有一定的優(yōu)勢(shì)[10]。

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Evaluation on the performance of a latex agglutination assay for treponemal specific antibody

HU Liang1，CHEN Yi1，CHEN Changqiang1，QU Chenyun1，GU Zhidong2，F(xiàn)AN Qishi1.(1.Department of Clinical Laboratory，Ruijin Hospital(North)，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 201801，China;2.Department of Clinical Laboratory，Ruijin Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200025，China)

ObjectiveTo evaluate the analytic performance of a latex agglutination assay for treponemal specific antibody(Mediace TPLA).MethodsThe EP documents established by Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)were referred to evaluate the analytic performance.A total of 110 syphilitic positive and 78 syphilitic negative sera were detected by Mediace TPLA，and the results were compared with those of chemiluminescence microparticle immunoassay(CMIA).ResultsThe total coefficients of variation(CV)were 8.77%，3.94%and 6.57% respectively at the concentration levels of 8.0，28.6 and 166.0T.U..The linear range was from 0 to 250 T.U.，and the total recovery rate was 95.31%.The results were not significantly affected by hemolysis(hemoglobin＜4.8 g/L)，lipidemia(triglyceride＜8 mmol/L)，jaundice(bilirubin＜20 μmol/L)and rheumatoid factor(＜450 IU/mL).The results of 30 antinuclear antibody(ANA)positive patients，10 hepatitis patients and 10 pregnant women were all negative.When the results of CMIA were defined as the reference standard，the sensitivity of Mediace TPLA was 99%，the specificity was 100%，and the cut－off value was 10 T.U..ConclusionsMediace TPLA has excellent antiinterference ability，repeatability，high accuracy，wide linear range and specificity.It can also be used in automated biochemical analyzers.

Syphilis;Latex agglutinaion assay;Serological detection

1673－8640(2015)03－0250－04

R446.1

A

10.3969/j.issn.1673－8640.2015.03.012

2014－06－18)

(本文編輯:龔曉霖)

上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)科研計(jì)劃項(xiàng)目(14411964500);上海申康醫(yī)院發(fā)展中心資助項(xiàng)目(SHDC12010215)

胡亮，男，1987年生，學(xué)士，技師，主要從事臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)工作。

顧志冬，聯(lián)系電話:021－67888237。