殼寡糖及其衍生物抗煙草花葉病毒機(jī)理的初步研究

孫翠紅，徐翠蓮，趙銘欽*，王　瑩，付培培，陳發(fā)元

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，國(guó)家煙草栽培生理生化研究基地，鄭州450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，鄭州450002）

殼寡糖及其衍生物抗煙草花葉病毒機(jī)理的初步研究

孫翠紅1，徐翠蓮2*，趙銘欽1*，王瑩1，付培培1，陳發(fā)元1

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，國(guó)家煙草栽培生理生化研究基地，鄭州450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，鄭州450002）

摘要：為了開發(fā)一種低毒高效的新型抗煙草花葉病毒抑制劑，利用合成的新型寡糖希夫堿衍生物進(jìn)行了抗煙草花葉病毒的藥效研究。結(jié)果表明：（1）在珊西煙上，采用枯斑寄主半葉法進(jìn)行抗煙草花葉病毒的藥劑篩選，殼寡糖及其衍生物都能有效減少葉片感染煙草花葉病毒的枯斑數(shù)，以枯斑抑制率為66.39%的水楊醛席夫堿的預(yù)防效果最好；（2）在普通煙K326上，殼寡糖及其衍生物可降低侵染病毒煙草中的葉綠素下降幅度，還可以提高葉片中的防御酶超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性，脯氨酸的含量也得到了積累。

關(guān)鍵詞：煙草花葉病毒；殼寡糖；殼寡糖席夫堿；防御酶；脯氨酸

殼寡糖（CS）是一種聚合度在3～10之間，交聯(lián)度低于5%的低聚β-（1，4）-2-脫氧-2-氨基葡萄糖［1］，它是一種誘導(dǎo)植物產(chǎn)生防御反應(yīng)的潛在信號(hào)［2］。Ryan［3］研究發(fā)現(xiàn)，寡糖、殼寡糖等功能糖具有激活植物自身免疫、提高植物抗病性的功能。國(guó)內(nèi)外報(bào)道用功能糖處理小麥、煙草和水稻等不同植物，可誘導(dǎo)POD、CAT和PAL等防御酶活性提高［4-5］，SOD、POD和PAL在活性氧的清除等主動(dòng)防御反應(yīng)中起著重要的作用［5］。對(duì)植物或者接種過病毒的葉片噴施CS，可以保護(hù)煙草花葉病毒（TMV）、黃瓜花葉病毒（CMC）和馬鈴薯X病毒（PVX）引起的植物局部或全身感染［6-7］。

煙草花葉病是煙草的主要病害之一，嚴(yán)重影響煙草的生長(zhǎng)，煙草感染TMV后，品質(zhì)變差，等級(jí)下降，Genger等［8］研究表明，TMV侵染煙草等寄主后，葉片不均勻褪綠黃化。目前，已經(jīng)推出的主成分為殼寡糖的多種抗病毒劑，對(duì)煙草花葉病的防治效果可達(dá)到20%～40%［9］，國(guó)內(nèi)外又相繼合成了殼寡糖的席夫堿、烷基化和磺?；苌铮l(fā)現(xiàn)其抗病效果明顯提高［10-12］。本研究通過殼寡糖及其衍生物對(duì)TMV防治效果試驗(yàn)，分析了不同供試藥劑對(duì)TMV的影響，并通過對(duì)相關(guān)生理生化指標(biāo)的測(cè)定，初步了解其抗病性機(jī)理，為開發(fā)高效、環(huán)保型抗病毒藥劑提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1供試植物與供試病毒珊西煙（Xanthi-NN），

TMV的枯斑寄主；普通煙（Nicotiana tabacum）K326，TMV的系統(tǒng)侵染寄主。煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus, TMV）由貴州大學(xué)提供，供試病毒TMV采用常規(guī)汁液摩擦接種的方法保存在普通煙K326上。

1.1.2供試藥劑市售寧南霉素、殼寡糖、水楊醛席夫堿、殼寡糖季銨鹽席夫堿。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1藥劑篩選試驗(yàn)采用篩選體外病毒抑制物常用的方法枯斑寄主半葉法［13］，在珊西煙上對(duì)供試藥劑進(jìn)行篩選試驗(yàn)，試驗(yàn)采用大田盆栽形式，6—7月在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田進(jìn)行。

預(yù)防試驗(yàn)：選取長(zhǎng)勢(shì)一致，具4～5片真葉的盆栽珊西煙，噴藥24h后，采用常規(guī)汁液摩擦接種法接種，以清水噴灑后接種為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次，觀察發(fā)病情況，計(jì)算枯斑抑制率。

治療試驗(yàn)：選取長(zhǎng)勢(shì)一致，具4～5片真葉的盆栽珊西煙，采用常規(guī)汁液摩擦接種法接種12h后噴藥，以接種后噴灑清水為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次，觀察發(fā)病情況，計(jì)算枯斑抑制率。

1.2.2 藥劑在感染TMV的普通煙上的抗性研究試驗(yàn)采用大田盆栽的形式在6月進(jìn)行。選用長(zhǎng)勢(shì)一致，具7～8片真葉的盆栽K326，采用常規(guī)汁液摩擦接種法接種TMV，進(jìn)行抗性試驗(yàn)。試驗(yàn)方法是先對(duì)K326噴施藥劑或清水（對(duì)照）24h后接種TMV（TMV濃度為3.33 μg/mL），試驗(yàn)設(shè)有：CK（噴施清水后不接種TMV），T1（噴施500μg/mL的殼寡糖季銨鹽衍生物后接種TMV），T2（噴施1mg/mL的水楊醛席夫堿后接種TMV），T3（噴施1mg/mL殼寡糖后接種TMV），T4（噴施稀釋260倍的2%的寧南霉素后接種TMV）。在接種后1、4、7、10、13、16d分別取樣裝入錫箔紙袋中，做好標(biāo)記，置于-80℃冰箱中保存用于檢測(cè)各處理的葉綠素、SOD、POD、CAT、PAL和脯氨酸。

葉綠素的測(cè)定采用李虎林等［14］的乙醇提取法；SOD采用NBT（氮藍(lán)四唑）顯色法［15］；POD、CAT和PAL參照文獻(xiàn)［16］的方法，略有修改；脯氨酸采用鄒琦［17］的方法。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和差異性分析。

2　 結(jié)果

2.1最優(yōu)藥劑的篩選

對(duì)5個(gè)處理的枯斑預(yù)防效果及治療效果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如表1所示，從預(yù)防效果來(lái)看，水楊醛席夫堿的枯斑抑制率高達(dá)66.39%，比市售藥劑寧南霉素高出3.53%；殼寡糖季銨鹽席夫堿的預(yù)防效果最差，抑制率為55.83%。其余藥劑預(yù)防效果為：寧南霉素＞殼寡糖；水楊醛席夫堿處理、殼寡糖處理與2%的寧南霉素處理之間差異性不明顯，殼寡糖季銨鹽席夫堿處理與殼寡糖處理、寧南霉素處理之間差異性較明顯，殼寡糖季銨鹽席夫堿處理與水楊醛席夫堿處理之間差異性顯著。從治療效果來(lái)看，依舊是水楊醛席夫堿治療效果最好，為30.11%，其次為市售藥劑寧南霉素，最差的是殼寡糖溶液；各個(gè)處理之間差異性不明顯。從綜合預(yù)防與治療效果來(lái)看，殼寡糖及其衍生物對(duì)TMV有一定的效果（圖1、圖2所示）。

2.2葉綠素含量的動(dòng)態(tài)變化

葉綠素主要包括葉綠素a和葉綠素b，本試驗(yàn)對(duì)不同處理煙葉葉綠素總量的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了研究，結(jié)果如圖3所示。噴施殼寡糖及其衍生物對(duì)煙草葉片的葉綠素含量均有影響，且曲線變化趨勢(shì)與對(duì)照CK不同。CK處理下，葉綠素含量整體處于穩(wěn)定狀態(tài)，變化不大；T1處理的第1天和第4天葉理PAL活性均低于對(duì)照，T1和T2處理酶活性曲線幾乎重疊且變化較穩(wěn)定，T3處理的酶活在4～7 d較高且接近于對(duì)照；4個(gè)處理與對(duì)照相比存在明顯差異。由此可知，殼寡糖衍生物在一定程度上可有效的增加防御酶的活性。

測(cè)定了不同藥劑處理后葉片中游離脯氨酸的含量變化，結(jié)果如圖8所示，噴施殼寡糖及其衍生物對(duì)煙草葉片游離脯氨酸含量均有影響，且曲線變化趨勢(shì)與對(duì)照CK相似。5個(gè)處理的游離脯氨酸含量整體表現(xiàn)為升高-降低-升高的趨勢(shì)，且除了對(duì)照在第10天達(dá)到最大值外，其他處理均在第7天達(dá)到最大值。除了T4處理和對(duì)照之間存在顯著性差異外，其他各個(gè)處理之間均存在較顯著差異。由此可見，殼寡糖衍生物可有效增加被TMV侵染的煙葉中脯氨酸的含量。

圖4　不同藥劑處理下SOD酶的活性變化Fig.4　The changes of the SOD activity

圖5　不同藥劑處理下CAT酶的活性變化Fig. 5　The changes of the CAT activity

圖6　不同藥劑處理下POD酶的活性變化Fig.6　The changes of the POD activity

圖7　不同藥劑處理下PAL酶的活性變化Fig.7　The changes of the PAL activity

圖8　不同藥劑處理下脯氨酸的含量變化Fig.8　The changes of proline content

3　討論

3.1 非系統(tǒng)侵染-在珊西煙上的枯斑抑制效果

采用枯斑寄主半葉法對(duì)殼寡糖以及其衍生物在珊西煙上進(jìn)行抗TMV藥效試驗(yàn)。結(jié)果表明，在以殼寡糖為原料的基礎(chǔ)上，不同的取代基具有不同的防治效果，尤其以水楊醛席夫堿的防治效果較好，其預(yù)防效果可以達(dá)到66.39%，較市售藥劑寧南霉素提高了3.53%。所有參試藥劑的治療效果均不太理想，以枯斑抑制率為30.11%的水楊醛席夫堿較好，因此對(duì)于TMV要采取預(yù)防為主的措施；葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的重要色素，通過在普通煙株上進(jìn)一步研究煙草葉片中葉綠素、脯氨酸含量以及防御酶活性的變化得出，殼寡糖以及其衍生物具有一定的抗病效果。

3.2 對(duì)活性氧的清除效果

活性氧自由基的積累可導(dǎo)致膜脂過氧化以及影響膜的通透性。有研究表明，與活性氧清除有關(guān)的防御酶SOD、CAT、POD、PAL等起著很重要的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，殼寡糖處理過的感TMV的煙草葉片中防御酶活性提高［16，18-19］，本試驗(yàn)也得到了類似的結(jié)果；試驗(yàn)得出，在一定時(shí)間內(nèi)，殼寡糖及其衍生物可提高各種防御酶的活性，達(dá)到了有效清除活性氧的目的，這可能是殼寡糖衍生物與結(jié)構(gòu)未修飾的殼寡糖相比，其官能團(tuán)的增加對(duì)提高煙草的抗病性的有一定協(xié)同增效作用。

3.3 對(duì)游離脯氨酸的影響

作為細(xì)胞內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，脯氨酸具有調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透平衡、穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)和阻礙氧自由基產(chǎn)生的作用［20］，它與植物體內(nèi)膜脂過氧化作用的減輕和活性氧自由基的清除有著密切的關(guān)系［21］，作為植物體內(nèi)重要和有效的有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，幾乎所有的逆境都會(huì)造成植物體內(nèi)脯氨酸的積累［22］。20世紀(jì)50年代Kemple等［23］發(fā)現(xiàn)多年生黑麥草在逆境條件下，游離脯氨酸含量增加，而在正常條件下其含量較低，且脯氨酸含量的增加與逆境強(qiáng)弱以及植物抗逆性有關(guān)，因此，脯氨酸的含量高低可以反映逆境對(duì)植物的危害程度以及植物對(duì)逆境的抵抗能力［24］，本試驗(yàn)得出的結(jié)果也符合此規(guī)律。

總的來(lái)說(shuō)，殼寡糖衍生物有望開發(fā)成為一種新型、低毒的煙草花葉病毒病防治藥劑。

作為一種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，殼寡糖可有效的誘導(dǎo)植物防御酶活性的變化，也可誘導(dǎo)煙草對(duì)TMV的侵染產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性，近年來(lái)人們不再僅僅關(guān)注于殼寡糖的抗病性，殼寡糖衍生物也漸漸成為了行業(yè)研究的熱點(diǎn)。殼寡糖上連有不同的基團(tuán)可產(chǎn)生不同的抗病效果，其作為一種綠色藥劑，應(yīng)用前景十分廣闊。

藥劑防治可在玉米吐絲盛期進(jìn)行，重點(diǎn)噴灑果穗。每畝用25%粉銹寧可濕性粉劑100克兌水50-75公斤噴霧，一般連噴2次，間隔7－10天。

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中圖分類號(hào)：S435.72

文章編號(hào)：1007-5119（2015）02-0087-06

DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2015.02.016

基金項(xiàng)目：河南省煙草公司重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目（HYKJ201015、HYKJ201307）

作者簡(jiǎn)介：孫翠紅，女，碩士，主要從事煙草化學(xué)研究。E-mail：13838144121@163.com

*通信作者，E-mail：xucuilian666@126.com；E-mail：zhaomingqin@126.com

收稿日期：2014-10-26修回日期：2015-02-28

The Inhibitory Effects of Chitooligosaccharides and its Derivatives on Tobacco Mosaic Virus (TMV)

SUN Cuihong1， XU Cuilian2*， ZHAO Mingqin1*， WANG Ying1，F(xiàn)U Peipei1， CHENFayuan1
（1. National Tobacco Cultivation&Physiology&Biochemistry Research Center， College of Tobacco，Henan AgriculturalUniversity，Zhengzhou 450002，China； 2. College of Science，Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， China）

Abstract:In order to develop a kind of the new inhibitor of low toxicity and high efficiency against TMV， the inhibitive effect of the new oligosaccharide Schiff base derivatives against TMV was conducted.The results showed that： （1） on Xanthi-NN， chitosan and its derivatives could all reduce the number of the dry spots infected by TMV effectively by screening potions with the dry spot host half leaf method， and the best result was obtained for salicylaldehydechitosanSchiff base giving the inhibition rate of 66.39%； （2） on Nicotiana tabacum K326， chitosan and its derivatives can lower the decrease of chlorophyll content， and increase activities of superoxide dismutase （SOD）， peroxidase （POD）， catalase （CAT）， polyphenol oxidase （PPO） and phenylalanine ammonia-lyase （PAL）in inoculated leaves， at the same time the content of proline had also accumulated.

Keywords:TMV； chitooligosaccharides； oligosaccharide schiff base； defense enzymes； proline