浸潤(rùn)性乳腺癌、乳腺良性病變及正常乳腺組織中骨橋蛋白及相關(guān)因子的表達(dá)差異及相關(guān)性研究

杜正文，高迎飛，王玉明，李新秋，楊 梁

（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院甲狀腺乳腺血管外科，湖北 十堰 442000）

浸潤(rùn)性乳腺癌、乳腺良性病變及正常乳腺組織中骨橋蛋白及相關(guān)因子的表達(dá)差異及相關(guān)性研究

杜正文，高迎飛，王玉明，李新秋，楊 梁

（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院甲狀腺乳腺血管外科，湖北 十堰 442000）

目的 檢測(cè)不同性質(zhì)乳腺組織中骨橋蛋白(OPN)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-C(VEGF-C)和乳腺腫瘤激酶(Brk)表達(dá)量的差異并探討其臨床意義。方法采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)92例浸潤(rùn)性乳腺癌組織、60例乳腺良性病變組織和35例正常乳腺組織中OPN、VEGF-C和Brk的表達(dá)情況，比較分析其與臨床病理學(xué)因素之間的相關(guān)性。結(jié)果三種蛋白OPN、VEGF-C和Brk在浸潤(rùn)性乳腺癌組織中均呈現(xiàn)出較高的表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率分別為66.3%、56.5%和70.7%，與乳腺良性病變以及正常乳腺組織比較差異均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。OPN、Brk表達(dá)與患者年齡、腫瘤直徑以及組織病理學(xué)分級(jí)無(wú)關(guān)(P＞0.05)，而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)(P＜0.05)；而VEGF-C表達(dá)與患者年齡、腫瘤直徑無(wú)關(guān)(P＞0.05)，與組織病理學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)(P＜0.05)。乳腺癌組織中的OPN、VEGF-C和Brk表達(dá)兩兩之間呈正相關(guān)性(P＜0.05)，而在正常乳腺組織和良性病變組織中三者之間無(wú)明顯相關(guān)性(P＞0.05)。結(jié)論在正常乳腺組織、良性病變組織和乳腺癌組織中，OPN、Brk與VEGF-C的表達(dá)量均依次升高。OPN可能通過(guò)介導(dǎo)VEGF-C蛋白刺激內(nèi)皮細(xì)胞黏附和遷移而加速血管形成，通過(guò)參與新血管生成和腫瘤的侵襲進(jìn)而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，三者的表達(dá)量均與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理因素有不同程度的相關(guān)。

乳腺腫瘤；骨橋蛋白；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C；免疫組織化學(xué)

乳腺癌(Mammary cancer)是女性中最常見(jiàn)的高發(fā)性惡性腫瘤，通常發(fā)生于乳房腺上皮組織右上象限，其發(fā)病率約占各種惡性腫瘤的10%，已成為威脅婦女健康的主要病因，受到全球醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注。骨橋蛋白(Osteopontin，OPN)是一種與惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)的蛋白，最早發(fā)現(xiàn)于牙齒和骨基質(zhì)中，是細(xì)胞在骨基質(zhì)中的產(chǎn)物，具有骨特異性，因其是細(xì)胞在骨基質(zhì)中的產(chǎn)物，并能在骨組織細(xì)胞與基質(zhì)中的礦質(zhì)形成一種橋連，人們將其命名為OPN[2-3]。乳腺腫瘤血管生成一直被認(rèn)為在腫瘤生長(zhǎng)，存活以及轉(zhuǎn)移的過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用。大量研究證明，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C(Vascular endothelial growth factor C，VEGF-C)是最為典型的促血管生成影響因素。研究發(fā)現(xiàn)，OPN可能通過(guò)乳腺腫瘤激酶(Breast tumor kinase，Brk)、VEGF-C蛋白刺激內(nèi)皮細(xì)胞附著和遷移而作用于腫瘤血管生成，并與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)。本研究采用免疫組化SP方法，對(duì)OPN、Brk和VEGF-C三種腫瘤相關(guān)蛋白分別在乳腺癌、良性病變及正常乳腺組織中表達(dá)量的差異情況進(jìn)行對(duì)比研究并分析這些蛋白與臨床病理學(xué)因素之間是否存在相關(guān)性，進(jìn)而探討OPN、Brk和VEGF-C三種蛋白在浸潤(rùn)性乳腺癌發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中所起的作用[4]。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集我院乳腺外科2011年1月至2013年12月92例浸潤(rùn)性乳腺癌手術(shù)切除組織，60例良性病變組織和35例正常乳腺組織。乳腺癌患者包括浸潤(rùn)性小葉癌19例，浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌73例；年齡25～71歲，平均46歲。所有患者術(shù)前均無(wú)化療或放療史及其他手術(shù)史。

1.2 試劑 小鼠抗人OPN單克隆抗體、小鼠抗人VEGF-C單克隆抗體、兔抗人Brk多克隆抗體(均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司)；SP免疫組織化學(xué)試劑盒(購(gòu)自中國(guó)福州邁新公司)。

1.3 方法 采用免疫組織化學(xué)SP(Streptavidin-peroxidase)法檢測(cè)，切除的組織標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片4片行免疫組化染色(OPN與VEGF-C蛋白各兩片)。步驟如下，二甲苯脫蠟、乙醇梯度脫水，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次×5 min；3%H2O2(80%甲醇)室溫處理切片15 min，PBS洗3次×5 min；抗原修復(fù)，PBS洗3次×5 min；10%山羊血清封閉液室溫封閉孵育30 min；棄封閉液后抗體孵育：按工作濃度加相應(yīng)一抗工作液，37℃孵育60 min，PBS洗3次×5 min；滴加SP復(fù)合物，在37℃恒溫箱孵育30 min，PBS洗3次×5 min；新鮮配制的DAB-H2O2顯色液孵育5～10 min，在顯微鏡下觀察判斷好染色程度；自來(lái)水沖洗5 min后用蘇木精復(fù)染2 min，鹽酸酒精分化，自來(lái)水再?zèng)_洗5～10 min，脫水，透明，封片，顯微鏡下觀察。

1.4 結(jié)果判定 OPN、Brk和VEGF-C蛋白陽(yáng)性表達(dá)均定位于細(xì)胞漿呈淡黃或棕黃色彌散性染色，每張組織標(biāo)本切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡下視野(×400)，分別計(jì)算各自的陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞百分比，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜10%者計(jì)為陰性結(jié)果，≥10%者計(jì)為陽(yáng)性結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。陽(yáng)性表達(dá)率各組間的比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性檢測(cè)用Spearman相關(guān)檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OPN、Brk和VEGF-C蛋白在良、惡性及正常乳腺組織中的表達(dá)情況 OPN、Brk和VEGF-C蛋白陽(yáng)性表達(dá)均為彌散性細(xì)胞漿染色。乳腺癌組織、乳腺良性病變組織及正常乳腺組織中OPN、Brk和VEGF-C蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率均呈依次降低，各蛋白三組間同時(shí)比較，差異均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見(jiàn)表1。

表1 OPN、Brk和VEGF-C蛋白在不同乳腺(病變)組織中的表達(dá)

2.2 浸潤(rùn)性乳腺癌組織中的OPN、Brk和VEGF-C表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系 在乳腺癌組織中，OPN和Brk的表達(dá)量與患者的年齡、腫瘤直徑大小及組織學(xué)分級(jí)無(wú)關(guān)(P＞0.05)，僅與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)(P＜0.05)，并且表達(dá)水平與TNM分期呈正相關(guān)，即表達(dá)水平越高，TNM分期越晚；而VEGF-C蛋白表達(dá)與患者的年齡及腫瘤直徑大小無(wú)關(guān)(P＞0.05)，與組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期相關(guān)(P＜0.05)，見(jiàn)表2。

2.3 OPN、Brk和VEGF-C蛋白在不同組織中表達(dá)的相關(guān)性分析 OPN、Brk和VEGF-C蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)兩兩呈正相關(guān)(P＜0.05)，而在乳腺良性病變組織和正常乳腺組織中的表達(dá)則無(wú)明顯相關(guān)性(P＞0.05)，見(jiàn)表3。

表2 浸潤(rùn)性乳腺癌組織中OPN、VEGF-C及Brk陽(yáng)性表達(dá)與臨床病理學(xué)因素的相關(guān)性

表3 乳腺癌組織中VEGF-C表達(dá)和臨床病理因素間的相關(guān)性

3 討論

腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散與轉(zhuǎn)移是引起乳腺癌死亡的主要原因，乳腺癌一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，則會(huì)導(dǎo)致患者的生存機(jī)率明顯降低。因此，提高浸潤(rùn)性乳腺癌患者治愈率和生存率的主要路徑就是減少腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散與轉(zhuǎn)移。相關(guān)研究表明，OPN蛋白具備明顯促進(jìn)腫瘤惡化傾向的能力，在一些領(lǐng)域內(nèi)被認(rèn)定為惡性腫瘤生長(zhǎng)的標(biāo)志。OPN蛋白在組織中不同水平的表達(dá)與機(jī)體的反應(yīng)顯著相關(guān)，尤其對(duì)于感染和創(chuàng)傷的反應(yīng)方面，在長(zhǎng)期的臨場(chǎng)實(shí)踐中也證實(shí)了OPN與胃癌、前列腺癌、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成等病理過(guò)程密切相關(guān)。值得注意的是，OPN蛋白甚至可以全程參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展的過(guò)程，在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著不可替代的作用，OPN在機(jī)體中的陽(yáng)性表達(dá)已經(jīng)成為確定腫瘤轉(zhuǎn)移的一個(gè)“金標(biāo)準(zhǔn)”，腫瘤轉(zhuǎn)移患者血清中通?？蓹z出OPN蛋白水平明顯增高[5]。與前人的研究結(jié)果一致，我們的研究結(jié)果揭示了OPN在不同組織間表達(dá)相差較大：在浸潤(rùn)性乳腺癌組織中表達(dá)較高，而在乳腺良性病變組織以及正常乳腺組織細(xì)胞中表達(dá)較少，提示OPN蛋白參與到了浸潤(rùn)性乳腺癌淋巴管生成以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的過(guò)程。

淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移是乳腺癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移方式。OPN、VEGF、Brk三種蛋白在腫瘤組織發(fā)生發(fā)展中所扮演的角色尚不確切，近期研究表明，OPN主要參與腫瘤組織微小血管的生成過(guò)程，可能借助VEGF、Brk的生理作用刺激內(nèi)皮細(xì)胞粘附和轉(zhuǎn)移而加速新血管形成，從而促進(jìn)腫瘤組織隨著新生血管侵襲和轉(zhuǎn)移。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的VEGF-C蛋白，作為VEGF基因家族的“明星”蛋白，更多的研究者在關(guān)注VEGF-C蛋白，因?yàn)槠湓谀[瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程發(fā)揮關(guān)鍵性作用，可促進(jìn)新的血管和淋巴管生成，極大改變淋巴管管壁的通透性，為腫瘤組織侵襲提供了有利的微環(huán)境，因此VEGF-C在乳腺癌淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[6]。我們的研究結(jié)果表明VEGF-C僅在浸潤(rùn)性乳腺癌組織中表達(dá)較高，而在乳腺良性病變組織以及正常乳腺組織細(xì)胞中僅少量表達(dá)甚至幾乎不表達(dá)，這說(shuō)明VEGF-C蛋白在浸潤(rùn)性乳癌的形成中發(fā)揮了不可忽視的作用。值得一提的是，國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究與我們的結(jié)果也相符，洪勇等[7]檢測(cè)三陰性和非三陰性乳腺癌組織中VEGF-C的表達(dá)量情況，發(fā)現(xiàn)VEGF-C在這兩種乳腺癌中均呈陽(yáng)性表達(dá)，其表達(dá)率均顯著高于良性乳腺病變組織和正常乳腺組織，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Kinoshita等[8]發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中VEGF-C蛋白陽(yáng)性表達(dá)與癌組織淋巴管浸潤(rùn)顯著相關(guān)，且檢出VEGF-C陽(yáng)性患者5年RFS指標(biāo)均低于VEFG-C蛋白表達(dá)陰性的患者；Nakamura等[9]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，VEGF-C蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)與淋巴管密度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目有相關(guān)性。而沉默VEGF-C基因的表達(dá)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移具有消極作用，會(huì)導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力、腫瘤的生長(zhǎng)速度、淋巴管生成及淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移率等不同程度的降低[10]。研究表明，VEGF-C蛋白的表達(dá)水平與行新輔助化療患者的預(yù)后密切相關(guān)，可作為晚期乳腺癌患者行新輔助化療后的愈后預(yù)測(cè)因素[11-12]。Garmy-Susini等[13]發(fā)現(xiàn)VEGF-C可以通過(guò)整合素α4β1激活淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞或其受體來(lái)促進(jìn)腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，但其具體的作用機(jī)制尚不明確。近年研究發(fā)現(xiàn)生存素及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白1(ECM1)與VEGF-C在乳腺癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)，共同表達(dá)于乳腺癌組織[14-15]。VEGF-C的表達(dá)和分泌受多種因素，比如炎性因子的調(diào)節(jié)，但是這些因素對(duì)VEGF-C的表達(dá)和分泌的機(jī)制尚不明了，在將來(lái)的研究中，筆者將從炎性細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)和VEGF-C、OPN以及Brk之間相互作用方面來(lái)探討乳腺癌發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制。此外，基于VEGF-C、OPN以及Brk蛋白，利用rRNA干擾技術(shù)或基因敲除技術(shù)做進(jìn)一步的研究和炎癥，將對(duì)揭示乳腺癌組織浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移提供重要的科研證據(jù)。因?yàn)檠芯可鲜鲆蜃又g的調(diào)控機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)，研究新的治療方法，積極預(yù)防乳腺癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，對(duì)乳腺癌患者的治療及延長(zhǎng)患者壽命都具有重要的意義。

本文研究結(jié)果表明，在浸潤(rùn)性乳腺癌組織中OPN、Brk和VEGF-C蛋白表達(dá)之間存在兩兩相關(guān)性(P＜0.05)，說(shuō)明OPN可能作為上游基因通過(guò)影響B(tài)rk和VEGF-C等或其受體參與腫瘤，尤其是乳腺腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，而在良性乳腺病變組織和正常乳腺組織中OPN、Brk和VEGF-C表達(dá)之間則沒(méi)有體現(xiàn)出相關(guān)性(P＞0.05)，也從側(cè)面說(shuō)明了OPN對(duì)于腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移的具體涵義，但具體的機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。此外我們發(fā)現(xiàn)，三者在乳腺癌組織、乳腺良性病變組織和正常乳腺組織中表達(dá)陽(yáng)性率的逐級(jí)遞減的規(guī)律，即在癌組織中高表達(dá)，在正常組織幾乎不表達(dá)，這種變化趨勢(shì)也證實(shí)了這些因素在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中起到了至關(guān)重要的作用，且與浸潤(rùn)性乳腺癌的侵襲性呈正相關(guān)，以此可探索新的診斷乳腺癌，尤其是乳腺癌是否有淋巴管轉(zhuǎn)移的重要標(biāo)準(zhǔn)，也可作為判斷乳腺癌預(yù)后的重要指標(biāo)。

[1]Siegel R,Naishadham D,Jemal A.Cancer statistics for Hispanics/ Latinos,2012[J].CACancer J Clin,2012,62(1):10-29.

[2]Lin F,Li Y,Cao J,et al.Overexpression of osteopontin in hepatocellular carcinoma and its relationships with metastasis,invasion of tumor cells[J].Mol Biol Rep,2011,38(8):5205-5210.

[3]Mi Z,Bhattacharga SD,Kin VM,et al.Osteopontin promotes CCL5-mesenchymal stromal cell-mediated breast cancer metastasis [J].Carcinogenesis,2011,32(4):477-487.

[4]谷 明,鄭新宇.骨橋蛋白及其相關(guān)因子在乳腺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義[J].中國(guó)普外基礎(chǔ)與臨床雜志,2013,20(8):890-895.

[5]楊 莉,魏 玲,左文述.骨橋蛋白與乳腺癌的研究現(xiàn)狀[J].中華腫瘤防治雜志,2011,18(14):1133-1137.

[6]王 征,王永霞.骨橋蛋白和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-C蛋白在浸潤(rùn)性乳腺癌組織中的表達(dá)及意義 [J].廣東醫(yī)學(xué),2013,34(12): 1901-1903.

[7]洪 勇,范 平,邱超學(xué),等.三陰性、非三陰性乳腺癌中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-C的表達(dá)及臨床意義[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2012,28(14): 2306-2308.

[8]Kinoshita J,Kitamura K,Kabashima A,et al.Clinical significance of vascular endothelial growth factor-C(VEGF-C)in breast cancer [J].Breast Cancer Res Treat,2001,6(2):159-164.

[9]Nakamura Y,Yasuoka H,Tsujimoto M,et al.Lymph vessel density correlates with nodal status,VEGF-C expression,and prognosis in breast cancer[J].Breast Cancer Res Treat,2005,91(2):125-132.

[10]Guo B,Zhang Y,Lou G,et al.Lentivirus-mediated small interfering RNA targeting VEGF-C inhibited tumor lymphangiogenesis and growth in breast carcinoma[J].Anat Rec(Hoboken),2009,292(5): 633-639.

[11]Brito LG,Schiavon VF,Andrade JM,et al.Expression of Hypoxia-inducible factor 1-α and Vascular endothelial growth factor-C in locally advanced breast cancer patients[J].Clinics(Sao Paulo), 2011,66(8):1313-1320.

[12]Wang J,Guo Y,Wang B,et al.Lymphatic microvessel density and vascular endothelial growth factor-C and-D as prognostic factors in breast cancer:a systematic review and meta-analysis of the literature[J].Mol Biol Rep,2012,39(12):11153-11165.

[13]Garmy-Susini B,Avraamides CJ,Desqrosellier JS,et al.PI3Kα activates integrin α4β1 to establish a metastatic niche in lymph nodes [J].Proc NatlAcad Sci USA,2013,110(22):9042-9047.

[14]Cai X,Ma S,Gu M,et al.Survivin regulates the expression of VEGF-C in lymphatic metastasis of breast cancer[J].Diagn Pathol, 2012,7:52.

[15]Wu QW,She HQ,Liang J,et al.Expression and clinical significance of extracellular matrix protein 1 and vascular endothelial growth factor-C in lymphatic metastasis of human breast cancer[J]. BMC Cancer,2012,12:47.

Differential expression of osteopontin and related factors in invasive breast cancer,benign breast lesion, normal breast tissues and correlation analysis.

DU Zheng-wen,GAO Ying-fei,WANG Yu-ming,LI Xin-qiu,YANG Liang.
Department of Vascular,Thyroid,and Breast Surgery,the People's Hospital Affiliated to Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,Hubei,CHINA

ObjectiveTo detect the differential expression of osteopontin(OPN),vascular endothelial growth factor C(VEGF-C)and breast tumor kinase(Brk)in different breast tissue types,and to evaluate its clinical significance.MethodsImmunohistochemical staining was applied to detect the expression of OPN,VEGF-C and Brk in 92 cases of invasive breast cancer,60 cases of benign breast lesions and 35 cases of normal breast tissue. Their correlation with clinicopathological factors were compared and analyzed.ResultsOPN,VEGF-C and Brk proteins in invasive breast cancer all showed high positive expression rates of 66.3%,56.5%and 70.7%,respectively, which had statistically significant difference with those in benign breast lesions and normal breast tissue(P＜0.01). The expressions of OPN,Brk showed no correlation with age,tumor size and histological grade(P＞0.05),but were correlated with lymph node metastasis and TNM stage(P＜0.05).VEGF-C expression were correlated to histopathologic grade,lymph node metastasis and TNM stage(P＜0.05),but not with age,tumor size(P＞0.05).In breast cancer, there was positive correlation between the expression of OPN,VEGF-C and Brk(P＜0.05),no with no significant correlation in normal breast tissue and benign breast lesions(P＞0.05).ConclusionIn normal breast tissue,benign breast lesions and breast cancer,the expression levels of OPN,Brk and VEGF-C increase successively.OPN, through mediating VEGF-C,may stimulate endothelial cell adhesion and migration to accelerate angiogenesis.It is involved in angiogenesis and tumor invasion and thus correlated with lymph node metastasis.The expression levels of OPN,Brk and VEGF-C are correlated to clinical pathological factors of tumor stage,lymph node metastasis to different extents.

Breast cancer;Osteopontin;Vascular endothelial growth factor C;Immunohistochemistry

R737.9

A

1003—6350（2015）06—0806—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.06.0289

2014-08-19)

高迎飛。E-mail：2118wy@126.com