戰(zhàn)創(chuàng)傷性尿道狹窄動物模型的建立

王忠新，洪寶發(fā)，譚海頌，李 鋼

（1.中國人民解放軍總醫(yī)院海南分院泌尿外科，海南 三亞 572014；2.中國人民解放軍總醫(yī)院泌尿外科，北京 100853；3.中國人民解放軍第309醫(yī)院泌尿外科，北京 100091）

·論 著·

戰(zhàn)創(chuàng)傷性尿道狹窄動物模型的建立

王忠新1，2，洪寶發(fā)2，譚海頌2，李 鋼3

（1.中國人民解放軍總醫(yī)院海南分院泌尿外科，海南 三亞 572014；2.中國人民解放軍總醫(yī)院泌尿外科，北京 100853；3.中國人民解放軍第309醫(yī)院泌尿外科，北京 100091）

目的 應用自行設計的爆炸裝置，建立戰(zhàn)創(chuàng)傷性兔尿道狹窄動物模型，為戰(zhàn)創(chuàng)傷性尿道狹窄的研究提供一種可靠、重復性強的動物模型。方法選取成年新西蘭雄兔25只。模型組20只，分離陰莖與肛門間膜狀皮膚連接，暴露球部尿道后，應用自行設計的定位爆炸裝置，將定位爆炸裝置前端圓孔對準并緊貼球部尿道。引爆裝置，造成球部尿道半壁缺損，清創(chuàng)后6-0可吸收線縱向間斷縫合尿道，逐層關閉切口。對照組5只，僅分離陰莖與肛門間皮膚連接。模型制作后第15天和第30天，實驗組和對照組分別行尿道鏡檢查、逆行尿道造影和組織學檢查評估模型構(gòu)建效果。結(jié)果模型組95%(19/20)術(shù)后15 d尿道鏡檢查和逆行尿道造影均證實成功建立尿道狹窄模型。組織學檢查提示狹窄段上皮細胞缺失，發(fā)生明顯纖維化，尿道連續(xù)性被破壞。術(shù)后30 d尿道鏡檢查見狹窄處黏膜蒼白、彈性消失，組織學檢查見纖維化程度較15 d時有所加重。結(jié)論自行設計的定位爆炸裝置，能有效建立戰(zhàn)創(chuàng)性尿道狹窄動物模型，為戰(zhàn)創(chuàng)傷性尿道狹窄救治研究奠定基礎。

尿道狹窄；戰(zhàn)創(chuàng)傷；動物模型

尿道狹窄是泌尿外科常見疾病，其可引起泌尿道感染、膀胱結(jié)石、敗血癥，最終甚至會導致腎功能衰竭，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。尿道狹窄相關的醫(yī)療花費非常龐大。2000年，美國男性尿道狹窄相關的醫(yī)療費用達1.91億美元[1]。尿道狹窄分為前尿道狹窄和后尿道狹窄，兩者不僅是狹窄的部位不同，其發(fā)病機制也不盡相同。一項單中心回顧性研究結(jié)果表明，大多數(shù)的尿道狹窄為前尿道狹窄，占92.2%，其中球部尿道狹窄占46.9%，陰莖部尿道占30.5%[2]。

目前治療尿道狹窄的手段有尿道擴張、尿道內(nèi)切開、尿道成形術(shù)等[3]。尿道內(nèi)切開術(shù)總體長期成功率為20%～30%。尿道成形術(shù)目前被認為是處理尿道狹窄的最有效方法，其成功率為85%～90%[4]，但其手術(shù)復雜，術(shù)后并發(fā)癥及費用均較高。狹窄復發(fā)是尿道狹窄治療面臨的主要問題，就尿道內(nèi)切開術(shù)而言，短于2 cm的狹窄術(shù)后1年復發(fā)率為40%，2～4 cm的狹窄術(shù)后1年復發(fā)率為50%，而長于4 cm的狹窄術(shù)后1年復發(fā)率高達80%[4]。因此，盡管尿道狹窄的治療手段一直在進步，但尿道狹窄的治療仍然是一個難題，因為目前缺乏一種有效的方法和修復材料來避免治療后遠期尿道狹窄的復發(fā)[5]。

如何成功構(gòu)建一種具備戰(zhàn)創(chuàng)傷性尿道狹窄特征性的動物模型，是進一步開展尿道狹窄治療相關研究的前提。目前有關尿道狹窄動物模型建立及修復研究大多是基于內(nèi)腔鏡下建立尿道狹窄模型，未能有效模擬戰(zhàn)創(chuàng)性尿道損傷的實際受傷機理，且模型構(gòu)建成功率均較低。因此，本研究嘗試探討一種簡單有效的構(gòu)建尿道狹窄模型的方法，并通過影像學和組織學方法評估模型建立的有效性，期望為尿道狹窄的進一步研究提供一種標準化的動物模型。

1 材料與方法

1.1 模型動物選擇 25只新西蘭雄兔(體重3.5～4.0 kg)被隨機分為模型組和正常對照組。動物麻醉采用肌肉注射鹽酸氯胺酮(0.3 ml/kg)誘導，麻醉維持采用靜脈給予戊巴比妥鈉(0.3 ml/kg)。實驗動物麻醉成功后，妥善固定四肢。會陰部皮膚備皮后，10%碘伏溶液消毒兩遍。本研究所有動物實驗程序均經(jīng)解放軍總醫(yī)院海南分院動物倫理委員會論證通過。

1.2 自行設計定位爆炸裝置模具 定位爆炸裝置結(jié)構(gòu)見圖1。裝置主要由一頭端為一直徑為6 mm左右圓形開口，尾端中心留有細孔的金屬保護殼構(gòu)成，其中頭端圓形開口供放入爆炸物(炸藥為普通鞭炮)，主體頭端圓形窗孔為爆炸后能量定向釋放孔，并限定爆炸后尿道損傷部位和范圍，尾端細孔供引線引出。

圖1 爆炸裝置實物圖

1.3 動物模型制作過程 模型組20只新西蘭雄兔，術(shù)前常規(guī)留置F8尿管，仔細分離陰莖與肛門間膜狀組織結(jié)構(gòu)，游離暴露球部尿道。將定位爆炸裝置前端圓孔對準并緊貼球部尿道。引爆裝置，造成球部尿道爆震傷，損傷區(qū)范圍為直徑5～10 mm的局限性半壁缺損，清理爆炸物遺留殘渣，清除明顯毀損尿道組織后以6-0可吸收線縱向間斷縫合尿道，逐層關閉切口后，局部切口再次碘伏消毒，拔除尿管。術(shù)后1周內(nèi)局部切口隔日給予碘伏沖洗消毒，預防切口感染。對照組僅切開肛門與陰莖間膜狀組織結(jié)構(gòu)，同法關閉切口及預防切口感染。

1.4 動物模型影像學評估 術(shù)后15 d和30 d分別進行影像學評估，包括尿道鏡(Wolf.13F，5°)直視下觀察受損處尿道情況和逆行尿道造影明確有無狹窄形成及狹窄的程度。逆行尿道造影過程如下：經(jīng)尿道外口插入F8尿管，置管深度1 cm左右，推入造影劑(200 g/L泛影葡胺)行逆行尿道造影，顯示尿道管腔情況。

1.5 組織學觀察 術(shù)后15 d和30 d分別處死10只實驗動物，完整取出狹窄段尿道組織以10%的甲醛液固定，梯度酒精脫水，在將透明后的組織塊浸蠟包埋，切片后蘇木精/伊紅(HE)染色，行組織學評估。對照組實驗動物在局麻下僅切開肛門與生殖器間皮膚，5-0可吸收線關閉傷口。在相同時間點行影像學評估，并取相應的球部尿道組織實施組織學檢查。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 動物模型制作過程平均用時9.8 min(8～12 min)。模型組實驗動物均成功造成球部尿道范圍0.5～1 cm毀損區(qū)，創(chuàng)面中心組織完全毀損，組織污濁，損傷區(qū)域邊緣組織出現(xiàn)水腫及少量滲血(圖2b)。尿道腔對側(cè)尿道黏膜糜爛紅腫。隨訪期間，未發(fā)生動物非預期死亡。所有模型動物建模后均自行排尿，未做任何形式尿液引流。模型組動物生殖器術(shù)后均明顯紅腫(圖3a)，模型動物的排尿狀況均受到一定影響，起初排尿表現(xiàn)為尿滴瀝，其中有12只模型動物伴有血尿，但隨后均自行消失。1周后實驗動物生殖器水腫基本消失，排尿狀況較前有所改善(圖3b)，所有實驗動物均未出現(xiàn)尿潴留征象，尿道損傷處未出現(xiàn)尿瘺。

2.2 動物模型影像學評估結(jié)果 對照組在術(shù)后15 d和30 d影像學檢查均顯示尿道黏膜光滑，管腔正常(圖4a)。模型組19只實驗動物(95%)在術(shù)后15 d尿道鏡檢查顯示損傷處尿道內(nèi)腔明顯縮小，周徑縮窄達50%以上，尿道腔內(nèi)殘存一些粗糙的點片狀黏膜，散在細小出血點及壞死組織。逆行尿道造影顯示損傷處尿道出現(xiàn)0.5～1 cm的狹窄段，管腔直徑縮小50%以上(圖4b)。所有模型動物均未見完全尿道閉塞。模型組動物按計劃取材后其余動物術(shù)后30 d再次行影像學評估。尿道鏡下可見剩余9只模型動物的球部尿道損傷區(qū)可見狹窄環(huán)，狹窄處尿道黏膜蒼白、結(jié)構(gòu)僵硬、彈性消失。其中模型組有1例動物隨訪期間一直未出現(xiàn)明顯狹窄征象。

圖2 模型制作過程

圖3 術(shù)后觀察

圖4 逆行尿道造影

2.3 動物模型組織學評估結(jié)果 術(shù)后30 d，正常對照組5只實驗動物HE染色均表現(xiàn)為尿道結(jié)構(gòu)正常，尿路上皮細胞排列規(guī)則，平滑肌纖維分布規(guī)律(圖5a)。術(shù)后15 d模型成功構(gòu)建組，實驗動物切片顯示受損處尿道黏膜充血糜爛，局部黏膜脫落，未見正常尿路上皮細胞，增生的膠原纖維、結(jié)締組織及炎癥細胞浸潤相當明顯，偶可見少量凌亂的平滑肌細胞(圖5b)。鏡下還可見少許黑色顆粒樣物質(zhì)，可能為殘留火藥顆粒。模型失敗組，實驗動物切片顯示損傷處尿道組織充血及炎癥細胞浸潤明顯，但纖維化程度明顯較輕，且范圍局限。術(shù)后30 d，模型組明顯狹窄者尿道組織學結(jié)果與前比較，出現(xiàn)明顯的纖維化，正常尿道黏膜結(jié)構(gòu)幾乎完全消失，可見散在的淋巴細胞和異物巨噬細胞浸潤(圖5c、5d)。

圖5 尿道組織切片（HE×40）

3 討論

尿道狹窄依據(jù)致病原因不同分為很多種，包括外傷性尿道狹窄，如騎跨傷或骨盆骨折；醫(yī)源性尿道狹窄，例如導尿、腔內(nèi)操作及尿道下裂手術(shù)等；感染或炎癥性尿道狹窄，如淋??；先天性或自發(fā)性尿道狹窄[6]。醫(yī)源性因素導致的尿道狹窄占自發(fā)性尿道狹窄的50%，占總尿道狹窄的30%[7]。就球部尿道狹窄而言，40%為自發(fā)性，35%為醫(yī)源性，10%為炎癥性，15%為外傷性[6]。

所有類型尿道狹窄的形成都是由于尿道上皮或尿道海綿體的損傷導致，前者的損傷最終會導致愈合過程中纖維化的發(fā)生。尿道狹窄的病理變化為正常的假復層柱狀上皮被鱗狀化生取代[8]。這種化生的組織容易被撕裂，從而引起尿外滲，進而導致海綿體的纖維化反應[9]。在組織剛損傷時，這種纖維化可能是無癥狀的，但隨著時間的推移，這種纖維化過程會進一步縮窄尿道腔，從而導致梗阻性排尿癥狀。多數(shù)尿道狹窄傷者需要進一步外科治療，但目前缺乏一種完全有效的治療手段，嚴重影響了患者的生活質(zhì)量。近年來應用組織工程技術(shù)修復重建尿道狹窄已成為研究的熱點[10-11]。因此，本研究嘗試應用自制的定位爆炸裝置建立戰(zhàn)創(chuàng)傷性尿道狹窄動物模型，為進行進一步的修復重建研究提供一種簡單實用的動物模型。

球部尿道是發(fā)生前尿道狹窄最常見部位，占尿道狹窄患者近一半左右病例。因而本研究描述了一種通過在球部尿道處定位爆炸造成球部尿道狹窄的兔動物模型構(gòu)建方法。實驗結(jié)果表明，實驗組術(shù)后有19只(95%)實驗動物影像學檢查可見典型尿道狹窄征象，逆行尿道造影可見長0.5～1.0 cm尿道狹窄段，尿道鏡直視下可見狹窄處尿道腔縮小50%以上。Meria等[12]曾報道了一種在球部尿道通過環(huán)狀電凝來建立兔尿道狹窄模型的方法，但只有50%的實驗動物在術(shù)后1個月時形成尿道狹窄。既往研究表明，兔尿道具有很強的自我修復能力，這都得益于其尿道海綿體具有豐富的血供，從而導致兔尿道狹窄動物模型不易構(gòu)建[13]。因為豐富的血流有利于將更多的組織創(chuàng)傷修復所需的生長因子運輸?shù)綋p傷局部，從而有利于自行修復[14]。本實驗中爆炸裝置對毀損區(qū)域尿道組織造成了包括熱灼傷和氣流沖擊傷等復合損傷。既往研究經(jīng)驗也表明，電凝或小范圍的銳性切割往往不能導致尿道狹窄形成。動物模型建立的最終目的是為了用于評價新的尿道狹窄的治療方法，因此保證模型成功率是動物模型構(gòu)建的首要目標。本研究中所采用的定位爆炸裝置構(gòu)建尿道狹窄動物模型，通過逆行尿道造影等影像學與組織學評估均證實了這種方法的有效性，模型構(gòu)建成功率達95%。逆行尿道造影是公認的用于診斷尿道狹窄的手段，它可以明確尿道狹窄的部位、狹窄的長度和程度。

既往研究通過對比正常尿道組織和狹窄段尿道組織發(fā)現(xiàn)，尿道狹窄的主要病理變化特征發(fā)生在尿道海綿體組織的細胞外基質(zhì)。正常的結(jié)締組織被稠密的纖維及散在的成纖維細胞取代，Ⅲ型膠原和Ⅰ型膠原的比例下降[15]。同時，平滑肌細胞與膠原的比例也出現(xiàn)下降。這個現(xiàn)象在狹窄部位比狹窄段周圍更加明顯。前尿道狹窄通常繼發(fā)于外傷或感染導致的海綿體纖維化。海綿體纖維化可能與一氧化氮合酶攜帶神經(jīng)損傷或纖維結(jié)締組織生長因子過表達有關[16]。在這個過程中，尿道海綿體發(fā)生纖維化，從而縮窄了尿道腔。如果纖維化程度更廣泛，它也會影響到尿道海綿體外的組織。后尿道狹窄通暢由閉塞過程導致的后尿道纖維化過程引起，例如盆腔放射治療導致的醫(yī)源性損傷，或骨盆骨折導致的牽拉撕裂傷。這種后尿道狹窄更確切的應該是尿道的攣縮或閉塞，而不是真正的狹窄。本研究中組織學觀察發(fā)現(xiàn)，模型動物受損處尿道組織出現(xiàn)了廣泛纖維化，正常尿道壁組織被破壞，且這種組織學變化在模型建立1個月后并沒有消失，這在組織學上與尿道狹窄組織學特征相似。很多因素會導致這種反應性纖維化，熱損傷已被實驗證實是導致泌尿道纖維化的主要因素[17]。本實驗結(jié)果表明，爆炸毀損區(qū)域組織的熱損傷等復合損傷，會造成局部尿道黏膜組織出現(xiàn)不同形式和程度的損傷，從而導致泌尿道屏障的不同程度的破壞，進而出現(xiàn)尿外滲，尿液滲入到損傷區(qū)域組織，進一步刺激尿道組織在修復過程中纖維化的發(fā)生。既往的實驗研究已經(jīng)證實尿外滲引起的創(chuàng)傷后尿道周圍炎癥反應是引起纖維化的重要因素。

既往報道的尿道狹窄動物模型構(gòu)建方法都是通過經(jīng)尿道途徑，我們所描述的方法是基于尿道外損傷途徑，這樣更有效的模擬了創(chuàng)傷造成人尿道狹窄的受傷機理。本研究采用的定位爆炸法建立尿道狹窄的動物模型，經(jīng)公認的標準方法包括尿道鏡、逆行尿道造影影像學手段和組織學評估證實模型的成功構(gòu)建，并且通過1個月的隨訪，證實模型的穩(wěn)定性，有望為尿道狹窄的進一步研究提供一個可重復的標準化動物模型。

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Construction of a traumatic urethral stricture animal model by self-designed bombing device.

WANG Zhong-xin1,2, HONG Bao-fa2,TAN Hai-song2,LI Gang3.
1.Department of Urology,Hainan Branch of Chinese PLA General Hospital, Sanya 572014,Hainan,CHINA;2.Department of Urology,Chinese PLA General Hospital,Beijing 100853,CHINA;3. Department of Urology,the 309thHospital of Chinese PLA,Beijing 100091,CHINA

ObjectiveTo establish a rabbit model of traumatic urethral stricture using a self-designed device,in order to provide a reliable and reproducible animal model for the study of traumatic urethral stricture.MethodsTwenty-five New Zealand male rabbits were used,which were divided into experiment group and control group.Of 20 rabbits in the experiment group,the skin between penis and anus was incised and the bulbar urethra was exposured.Then,half-circumferential defect of the bulbar urethral ventro-wall was made by the self-designed bombing device.Of 5 rabbits in the control group,only the skin between penis and anus was incised.Urethroscopy,retrograde urethrography and histological analysis were performed to evaluate the effect of the animal model made at 15 and 30 days in all groups.ResultsIn the experiment group,urethral stricture were confirmed by urethroscopy and retrograde urethrography in 95%(19/20)of the samples 15 days after surgery.Histological examinations showed the absence of epithelial cell in the stenosis segment,with obvious fibrosis.30 days after surgery,the urethroscopy showed the mucous membrane of the stenosis segment became pale,inelasticity.Histological examinations also showed more severe fibrosis.ConclusionAn animal model of traumatic urethral stricture can be successfully established by the self-designed device,which may provide some basis for the study of the treatment of traumatic urethral stricture.

Urethral stricture;Trauma;Animal model

R-332

A

1003—6350（2015）06—0781—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.06.0281

2014-10-23)

軍隊臨床高新技術(shù)重點項目（編號：413DG63J）

王忠新。E-mail：wangzx301@163.com