兔短陣室性心動(dòng)過(guò)速心肌病模型的建立

曾向輝，周小華，孫 翔，凌 靜，卿艷云，張 翼

(1.長(zhǎng)沙市中醫(yī)醫(yī)院(長(zhǎng)沙市第八醫(yī)院)心內(nèi)科，湖南 長(zhǎng)沙 410100；2.湖南師范大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，湖南 長(zhǎng)沙 410005)

兔短陣室性心動(dòng)過(guò)速心肌病模型的建立

曾向輝1，周小華1，孫 翔1，凌 靜1，卿艷云1，張 翼2

(1.長(zhǎng)沙市中醫(yī)醫(yī)院(長(zhǎng)沙市第八醫(yī)院)心內(nèi)科，湖南 長(zhǎng)沙 410100；2.湖南師范大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，湖南 長(zhǎng)沙 410005)

目的 探討建立兔短陣室性心動(dòng)過(guò)速心肌病模型方法。方法15只雄性新西蘭兔。在無(wú)X線、微創(chuàng)、靜脈下用標(biāo)測(cè)電極行短陣室速刺激右心室建立心動(dòng)過(guò)速性心肌病動(dòng)物模型。用10極冠狀竇電極，經(jīng)改良5F橈動(dòng)脈鞘，經(jīng)右側(cè)前腔靜脈送至右心室，連接程序刺激儀，起搏右心室。結(jié)果起搏1周后心臟彩超檢查證實(shí)左心室舒張末內(nèi)徑擴(kuò)大，左心室射血分?jǐn)?shù)降低，血清B型腦利鈉肽(BNP)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)升高、金屬蛋白酶抑制劑1(TIMP-1)下降。HE染色顯示心肌結(jié)構(gòu)排列紊亂，細(xì)胞間質(zhì)炎性浸潤(rùn)。電鏡下顯示線粒體腫脹，甚至溶解、破壞，Z線模糊，閏盤結(jié)構(gòu)顯示不清。3周后再?gòu)?fù)查心臟彩超、血清BNP、MMP-9、TIMP-1，心臟射血分?jǐn)?shù)(EF)、短軸縮短率(FS)均大致恢復(fù)起搏前水平。結(jié)論無(wú)X線、微創(chuàng)靜脈下用標(biāo)測(cè)電極行短陣室速刺激右心室建立心動(dòng)過(guò)速性心肌病動(dòng)物模型簡(jiǎn)單可行。

心動(dòng)過(guò)速性心肌?。欢剃囀倚孕膭?dòng)過(guò)速；B型腦鈉肽；兔；模型

為了更好地進(jìn)行心動(dòng)過(guò)速性心肌病(Tachycardia-induced cardiomyopathy，TIC)的基礎(chǔ)和臨床研究，需要有簡(jiǎn)單易行且時(shí)間較短的動(dòng)物模型的制作方法。早期的心動(dòng)過(guò)速性心肌病模型制作局限于大動(dòng)物，需在X線下操作、開胸手術(shù)、需要呼吸機(jī)輔助通氣等，均為持續(xù)性室速的大動(dòng)物模型，需植入起搏電極及脈沖發(fā)生器，不僅費(fèi)用昂貴，操作復(fù)雜，而且使實(shí)驗(yàn)者過(guò)多的暴露在X線下，對(duì)實(shí)驗(yàn)者身體不利，造成不必要的損害，浪費(fèi)大量的人力、物力、財(cái)力等資源，對(duì)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)展造成極大的不利影響[1-2]。目前對(duì)短陣室速能否成功制作TIC小動(dòng)物模型，尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究首次通過(guò)無(wú)X線、非開胸靜脈下用標(biāo)測(cè)電極行程序刺激右心室建立短陣室速性心肌病動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 從長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司購(gòu)15只新西蘭兔，普通級(jí)，均為雄性，體重(2.5±0.2)kg，SCXK號(hào)碼(湘2009-0012)，SYXK號(hào)碼(湘2010-0013)，于湖南省人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室開展實(shí)驗(yàn)。將其按隨機(jī)數(shù)字表劃分為三組，第一組：5只，損傷未起搏組；第二組：5只，起搏1周后處死；第三組：5只，起搏1周觀察2周組。各組在月齡、體重上均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，具有可比性。

1.2 研究方法

1.2.1 術(shù)前準(zhǔn)備 所有動(dòng)物術(shù)前禁食12 h，禁飲4 h，稱重，10%的水合氯醛(湖南省兒童醫(yī)院制劑室生產(chǎn))以4ml/kg腹腔內(nèi)注射，5～10min后刺激角膜，角膜反射消失后在右頸部常規(guī)備皮、消毒鋪巾。相關(guān)器械、器材絡(luò)合碘浸泡消毒1 h以上。

1.2.2 手術(shù)過(guò)程 嚴(yán)格按外科無(wú)菌操作原則在右頸部做一長(zhǎng)約3cm切口，從右側(cè)前腔靜脈植入5F自制橈動(dòng)脈鞘，結(jié)扎右側(cè)前腔靜脈近端和遠(yuǎn)端，分層縫合，絡(luò)合碘消毒，無(wú)菌敷料覆蓋。為防止動(dòng)物麻醉醒后四肢抓脫敷料及橈動(dòng)脈鞘：無(wú)菌敷料外加寬透明膠帶再次包扎，松緊度適宜，以防導(dǎo)致動(dòng)物窒息死亡；用寬膠帶對(duì)后肢捆綁，放回籠中飼養(yǎng)。起搏各組按上述步驟植入鞘管后，用500ml配肝素注射液1.25萬(wàn)U的肝素水沖鞘管預(yù)防血栓栓塞，常規(guī)青霉素80萬(wàn)U肌肉注射抗感染，2次/d。

1.2.3 刺激方法 用10極冠狀竇電極(圣猶達(dá)公司)經(jīng)植入橈動(dòng)脈鞘送至右心室(判斷在右心室標(biāo)準(zhǔn)：心電監(jiān)護(hù)上可見室性早搏；拇指和食指觸及電極隨心臟搏動(dòng)；有跟頻現(xiàn)象)，連接程序刺激儀(蘇州工業(yè)園區(qū)東方電子儀器廠，型號(hào)：XD-5A)，將感知調(diào)至最低，電壓(3.0±0.5)V；起搏頻率為400次/min(正常時(shí)260～280次/min，因之前預(yù)實(shí)驗(yàn)已完成300次/min及500次/min的頻率實(shí)驗(yàn)，其中前者造模成功時(shí)間較長(zhǎng)，不利于整個(gè)實(shí)驗(yàn)時(shí)間控制；后者起搏頻率太快，死亡率高)，起搏右心室，30陣/min，每陣持續(xù)10～12個(gè)室性早搏，24 h持續(xù)約90min。每次刺激完畢將電極退出右心室，但未撤出體外，再次刺激時(shí)在清醒狀態(tài)下重新插入，避免冠狀竇電極留置心腔對(duì)血流動(dòng)力學(xué)產(chǎn)生影響。整個(gè)刺激過(guò)程給予持續(xù)心電監(jiān)護(hù)(連接心電圖機(jī)，型號(hào)為日本光電工業(yè)株式會(huì)社ECC-9130型記錄儀，用自制的針頭插入動(dòng)物四肢獲得心電圖形，起搏信號(hào)后緊跟寬大畸形的QRS波群，Ⅱ、Ⅲ、aVF導(dǎo)聯(lián)主波向下即認(rèn)為有效起搏)。每次刺激后用絡(luò)合碘消毒切口預(yù)防感染。刺激完畢后無(wú)菌敷料覆蓋，外加寬透明膠帶包扎，松緊度適宜，以防導(dǎo)致動(dòng)物窒息死亡；用寬膠帶對(duì)后肢捆綁，放回籠中飼養(yǎng)。

1.3 觀察指標(biāo) 分別于術(shù)前、術(shù)后1周、術(shù)后3周觀察各組動(dòng)物心動(dòng)過(guò)速性心肌病發(fā)病過(guò)程中不同時(shí)期的表現(xiàn)，有無(wú)術(shù)后感染，比較各時(shí)期的B型腦利鈉肽(BNP)水平的高低，血清中基質(zhì)金屬蛋白酶9 (MMP-9)、金屬蛋白酶組織抑制劑1(TIMP-1)的濃度變化，心臟彩色多普勒超聲中血液動(dòng)力學(xué)變化及左心室的大小及射血分?jǐn)?shù)的大小的變化，并進(jìn)行自身對(duì)照，利用HE染色方法、電鏡分別觀察心肌纖維的排列、結(jié)構(gòu)形態(tài)變化及心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的形態(tài)變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0分析軟件，所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，計(jì)量資料術(shù)前、術(shù)后自身比較用成對(duì)t檢驗(yàn)，各組間比較用成組t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兔心動(dòng)過(guò)速性心肌病模型建立 三組動(dòng)物均存活，術(shù)后均無(wú)明顯感染。在起搏4 d后均出現(xiàn)疲倦、乏力、食欲不振(剩下2/3食物)、反應(yīng)下降(較術(shù)前同樣刺激反應(yīng)遲鈍)、目光呆滯。起搏1周后所有動(dòng)物出現(xiàn)有氣促，超聲顯示胸、腹水。但經(jīng)過(guò)2周的觀察，上述癥狀消失，復(fù)查心臟彩超示胸腹水消失。

2.2 各組血清學(xué)指標(biāo)比較 所提供的ELISA Kit是典型的夾心法酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(ELISA)。所使用同一批次試劑不需定標(biāo)，使用不同批次試劑盒測(cè)定時(shí)均重新定標(biāo)，見表1。

表1 不同時(shí)期的血清學(xué)指標(biāo)自身比較(±s)

表1 不同時(shí)期的血清學(xué)指標(biāo)自身比較(±s)

注：與術(shù)后1、2周比較，aP＜0.05；與術(shù)后2周比較，bP＜0.05；與術(shù)前比較，cP＞0.05。

項(xiàng)目 術(shù)前 術(shù)后1周 術(shù)后2周 術(shù)后3周BNP(pg/ml) MMP-9(ng/ml) TIMP-1(ng/ml)246.0±20.1a1.20±0.02a1.98±0.07a344.5±5.81.67±0.01b1.70±0.01b322.2±5.8 .46±0.021.25±0.03244.0±10.1c1.18±0.01c1.95±0.04c

2.3 心臟彩色多普勒超聲 分別于術(shù)前、術(shù)后1周、術(shù)后2周行心臟彩色多普勒超聲檢查。檢查前在心前區(qū)備皮，脫毛，清醒狀態(tài)，左側(cè)臥位，固定四肢。采用的心臟超聲儀為日本東芝ALOKa-10型彩色多普勒測(cè)繪二維實(shí)時(shí)超聲顯像儀，探頭發(fā)射頻率2.5 MHz。取標(biāo)準(zhǔn)胸骨旁左心室長(zhǎng)軸切面、心尖五腔觀及標(biāo)準(zhǔn)心尖四腔觀觀察，測(cè)量左心室收縮期內(nèi)徑(LviDs)、左心室舒張末內(nèi)徑(LviDd)、左心室收縮末容積(ESV)、左心室舒張末容積(EDV)、短軸縮短率(FS)、E峰、A峰值等參數(shù)，連續(xù)測(cè)3個(gè)心動(dòng)周期取平均值。觀察有無(wú)心包積液、瓣膜返流、胸水、腹水。操作均由湖南省人民醫(yī)院彩超室專人在同一臺(tái)儀器上完成，見表2。

表2 心臟彩色多普勒超聲不同時(shí)期自身比較(±s)

表2 心臟彩色多普勒超聲不同時(shí)期自身比較(±s)

注：與術(shù)前比較，aP＜0.05；與術(shù)后2周比較，bP＜0.05；與術(shù)前比較，cP＞0.05。

項(xiàng)目術(shù)后3周術(shù)前 術(shù)后1周 術(shù)后2周12.8±1.8c3.7±0.4c8.2±0.5c1.7±0.5c70.3±1.9c36.1±2.2c1.58±0.02 LviDd(mm) EDV(ml) LviDs(mm) ESV(ml) EF(%) FS(%) E/A值12.3±0.8a3.4±0.2a7.8±0.1a1.4±0.3a74.3±2.9a39.5±2.9a1.65±0.04a17.0±0.8b7.0±0.2b12.2±1.1b3.2±0.2b58.7±7.5b28.7±5.1b1.05±0.03b13.7±1.95.0±0.710.7±1.02.6±0.365.3±2.233.2±4.71.39±0.01

2.4 組織學(xué)改變(HE染色) 損傷未起搏組心肌排列規(guī)整，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及心肌纖維斷裂、溶解；起搏1周后停止起搏未加處理因素，心肌排列較前紊亂，有灶性炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)纖維少量增生；起搏1周后觀察1周心肌排列稍紊亂，可見少量心肌纖維有斷裂，有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，見圖1。

2.5 電鏡觀察 損傷未起搏組右心室心尖部心肌電鏡下線粒體飽滿，界嵴明顯；Z線、M線結(jié)構(gòu)清晰可見，細(xì)胞核形態(tài)正常，肌絲排列整齊有序；細(xì)胞間質(zhì)正常。起搏1周后右心室心尖部心肌顯示線粒體腫脹、空泡樣變性，肌絲排列紊亂，Z、M線模糊。起搏1周觀察1周。可見Z線、M線較清晰，線粒體體積小，可見空泡樣變性，胞漿有水腫，見圖2。

圖1 HE染色后在光學(xué)鏡下1∶100倍觀察

圖2 電鏡觀察(1∶10000)

3 討 論

3.1 起搏右心室制備心力衰竭模型的優(yōu)點(diǎn) 心力衰竭動(dòng)物模型傳統(tǒng)的制作方法有：(1)藥物注射法：此種方法具有代表性有阿霉素，但動(dòng)物死亡率高，模型成功周期長(zhǎng)，一般需要8～10周；(2)冠脈結(jié)扎法：該方法操作較復(fù)雜，結(jié)扎部位過(guò)高容易導(dǎo)致死亡，過(guò)低易導(dǎo)致模型失敗，且剖胸后動(dòng)物死亡率高，耗時(shí)較長(zhǎng)，費(fèi)用相對(duì)偏高。目前心動(dòng)過(guò)速性心肌病的動(dòng)物模型制作局限在大動(dòng)物，需在X線下操作、開胸手術(shù)、需要呼吸機(jī)輔助通氣。而TIC在進(jìn)展為不可逆性心力衰竭之前，終止導(dǎo)致心動(dòng)過(guò)速的病因后在一定時(shí)間內(nèi)則可有心肌結(jié)構(gòu)和功能部分恢復(fù)甚至全部逆轉(zhuǎn)[3]。因此及時(shí)發(fā)現(xiàn)和終止心動(dòng)過(guò)速病因至關(guān)重要。而本實(shí)驗(yàn)通過(guò)無(wú)X線、非開胸靜脈下用標(biāo)測(cè)電極行程序刺激右心室建立短陣室速性心肌病動(dòng)物模型周期短，避免實(shí)驗(yàn)人員X線照射，且無(wú)需開胸手術(shù)及呼吸機(jī)輔助通氣，故簡(jiǎn)便易行。

3.2 成功制作TIC動(dòng)物模型 目前臨床上TIC尚無(wú)統(tǒng)一診斷標(biāo)準(zhǔn)，一般符合以下幾點(diǎn)可考慮為TIC：(1)在心動(dòng)過(guò)速發(fā)生前左心室功能正常；(2)頻繁或者持續(xù)心動(dòng)過(guò)速發(fā)作后左心室功能進(jìn)行性損害，并排除其他致病因素；(3)心律失?；蛐氖衣士刂坪笮氖夜δ艿玫礁纳芠4]。

本研究結(jié)果顯示術(shù)前無(wú)左心室擴(kuò)大，心功能下降，經(jīng)短陣室速起搏1周后出現(xiàn)左心室擴(kuò)大、射血分?jǐn)?shù)下降、胸腹水等心功能不全表現(xiàn)。在停止起搏1周后，血清學(xué)及心臟彩色多普勒超聲各指標(biāo)均有所恢復(fù)，胸腹水消失，但較起搏前水平仍較差?？赡芘c致病因素去除時(shí)間較短，心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)有限相關(guān)；在停止起搏2周后，基本上恢復(fù)至起搏前的水平。因此，無(wú)論是從器官結(jié)構(gòu)、組織形態(tài)、細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)上，與心動(dòng)過(guò)速性心肌病的特點(diǎn)相符，符合心動(dòng)過(guò)速性心肌病的診斷標(biāo)準(zhǔn)，說(shuō)明創(chuàng)建兔心動(dòng)過(guò)速性心肌病的模型成功。既往制作TIC模型大多需要時(shí)間較長(zhǎng)(4～6周)，但本研究短陣室速刺激1周后即可制作成功，可能與一下兩點(diǎn)有關(guān)：(1)動(dòng)物心臟小，對(duì)外界的室速刺激耐受性低[5]；(2)在制作TIC模型時(shí)，右心室心尖部起搏，導(dǎo)致雙心室的矛盾運(yùn)動(dòng)有關(guān)[6]。相關(guān)機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

本研究通過(guò)對(duì)既往快速起搏右心室方法的改進(jìn)，運(yùn)用無(wú)X線、微創(chuàng)靜脈下用標(biāo)測(cè)電極行程序刺激右心室成功建立短陣室速心肌病動(dòng)物模型。不僅操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，而且可避免植入人工起搏器、實(shí)驗(yàn)者暴露在X線下，大大地節(jié)省了實(shí)驗(yàn)費(fèi)用，對(duì)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)程有很大的推動(dòng)作用。為今后的心動(dòng)過(guò)速性心肌病的基礎(chǔ)與臨床研究提供了有益的探索。

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Exploration of a method to establish rabbit models of nonsustained ventricular tachycardia cardiomyopathy.

ZENG Xiang-hui1,ZHOU Xiao-hua1,SUN Xiang1,LING Jing1,QING Yan-yun1,ZHANG Yi2.1.The Hospital of Traditional Chinese Medicine of Changsha(the Eighth Hospital of Changsha),Changsha410100,Hunan,CHINA;2. Department of Cardiology,the First Affiliated Hospital of Hunan Normal University,Changsha410005,Hunan,CHINA

ObjectiveTo explore a effective method to establish rabbit models of nonsustained ventricular tachycardia cardiomyopathy.MethodsFifteen New Zealand rabbits were used in this study.The right ventricle was stimulated with mapping electrode line to create nonsustained ventricular tachycardia byminimally invasive venous technique without X-ray radiation.A10 polar cap of sinus electrode was inserted through modified5F radial artery sheath and the right anterior vena cava to the right ventricle.Then the programming stimulator was connected to pace the right ventricle to create the tachycardia cardiomyopathy animal model.ResultsAfter one week of right ventricular pacing,cardiac ultrasound examination showed enlarged left ventricular end diastolic diameter,reduced left ventricular ejection fraction,increased serum B-type natriuretic peptide(BNP)and matrix metalloproteinase9(MMP-9),and decreased tissue inhibitor of metallopmteinase-1(TIMP-1).HE staining showed myocardial structural derangement andinterstitial inflammatory cell infiltration.Electron microscopy revealed mitochondrial swelling,dissolution,or even lysis and destruction,fuzzy Z line and unclear intercalated discs.Three weeks later,the heart color,serum BNP,MMP-9, TIMP-1,ejection fraction(EF),fraction shortening(FS)in the rabbits recovered to former levels.ConclusionIt is a simple and practical method to establish animal models of tachycardiomyopathy by stimulating animal’s right ventricle with mapping electrode line to create nonsustained ventricular tachycardia underminimally invasive,venous technique without X-ray radiation.

Tachycardiomyopathy;Nonsustained ventricular tachycardia;B-type natriuretic peptide(BNP); Rabbit;Model

R-332

A

1003—6350（2015）16—2347—04

2015-02-08)

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.16.0848

張 翼。E-mail：345665560@qq.com