VASH1在口腔鱗狀細(xì)胞癌、口腔白斑及口腔扁平苔蘚中的表達(dá)及意義

孫 鑫，魏秀峰，呂珊珊，劉 桐，安歡歡，李 娜，谷 楠

(吉林大學(xué)口腔醫(yī)院口腔黏膜病科，吉林 長春 130021）

·臨床病理·

VASH1在口腔鱗狀細(xì)胞癌、口腔白斑及口腔扁平苔蘚中的表達(dá)及意義

孫 鑫，魏秀峰，呂珊珊，劉 桐，安歡歡，李 娜，谷 楠

(吉林大學(xué)口腔醫(yī)院口腔黏膜病科，吉林 長春 130021）

目的 探討血管生成抑制蛋白1(VASH1)在口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)、口腔白斑(OLK)和口腔扁平苔蘚(OLP)中的表達(dá)及意義。方法免疫組織化學(xué)染色SP法檢測60例OSCC、20例OLK、20例OLP及20例正?？谇火つ?NOM)中VASH1的表達(dá)情況，采用SPSS19.0軟件對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果(1)VASH1蛋白在OSCC組織中的陽性表達(dá)率和染色強(qiáng)度隨組織分化程度的降低而呈增高趨勢(P＜0.05)，并且在中、低分化的鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)明顯高于白斑，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；(2)VASH1在白斑中的表達(dá)明顯高于正常組織和扁平苔蘚，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；(3)VASH1在扁平苔蘚與正常組織的表達(dá)情況差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；(4)口腔鱗癌組中VASH1在有淋巴轉(zhuǎn)移組的表達(dá)明顯高于無淋巴轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論VASH1蛋白可能與口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移有關(guān)。

血管生成抑制蛋白1；口腔鱗狀細(xì)胞癌；口腔白斑

口腔鱗狀細(xì)胞癌(Oral squamous cell carcinoma，OSCC)是發(fā)生在口腔黏膜中最常見的惡性腫瘤?？谇击[癌常向區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，晚期可發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其分化程度越低，惡性程度越高?？谇话装?Oral leukoplakia，OLK)是最常見的口腔癌前病變，有3%～5%的口腔白斑會轉(zhuǎn)變?yōu)榭谇击[狀細(xì)胞癌?？谇槐馄教μ\(Oral lichen planus，OLP)是較常見的口腔黏膜斑紋類疾病，目前多認(rèn)為口腔扁平苔蘚是一種癌前狀態(tài)[1]。血管生成抑制因子(Vasohibin-1，VASH1)作為新近發(fā)現(xiàn)的蛋白因子，其具有負(fù)反饋調(diào)節(jié)血管生成的作用，是由血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)、成纖維生長因子2 (Fibroblast growth factor-2，F(xiàn)GF2)等誘導(dǎo)產(chǎn)生，在乳腺癌[2]、食管鱗狀細(xì)胞癌[3]、尿路上皮癌等腫瘤[4]中不僅可以抑制腫瘤的血管生成，而且對于腫瘤淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移也有強(qiáng)大的抑制作用[5]，目前關(guān)于VASH1在口腔中的表達(dá)情況尚未見報(bào)道。本研究采用免疫組化SP法檢測OSCC、OLK、OLP和NOM中VASH1蛋白的表達(dá)，并探討其表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取吉林大學(xué)口腔醫(yī)院病理教研室保存的60例口腔鱗狀細(xì)胞癌(高分化、中分化和低分化鱗癌各20例)石蠟標(biāo)本，20例口腔白斑和20例口腔扁平苔蘚石蠟標(biāo)本；選取20例正?？谇火つ?Normal oral mucosa，NOM)作為對照。60例OSCC患者中男性40例，女性20例；年齡34～74歲，平均56.18歲；按照國際抗癌聯(lián)盟UICC2002年修訂的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，其中Ⅰ期21例，Ⅱ期16例，Ⅲ期22例，Ⅳ期1例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36例。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 兔抗人VASH1抗體購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；SP試劑盒及DAB顯色試劑盒購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，陽離子防脫玻片購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)，0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH6.0)。

1.3 免疫組化染色 標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋，切片厚2 μm，具體染色步驟如下：蠟切片脫蠟和水化后，置煮沸的0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH6.0)中抗原修復(fù)15 min后，冷卻至室溫，PBS沖洗，內(nèi)源性過氧化酶阻斷劑(試劑A)室溫孵育10 min，PBS沖洗，非免疫羊血清(試劑B)室溫孵育10 min，試凈勿洗，加入一抗VASH1(兔抗人，稀釋比例為1:400)4℃冰箱孵育過夜，復(fù)溫，PBS沖洗，滴加生物素標(biāo)記的羊抗鼠/兔IgG (試劑C)室溫孵育10 min，PBS沖洗，滴加鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶(試劑D)室溫孵育10 min，PBS沖洗。用新鮮配制的DAB染色，而后自來水充分沖洗，蘇木素復(fù)染，分化，返藍(lán)，脫水透明，封片。以PBS代替第一抗體為陰性對照。

1.4 結(jié)果判定 根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[1，3]判定標(biāo)準(zhǔn)，VASH1的陽性表達(dá)以細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞膜呈淡黃色至棕褐色顆粒狀著色為陽性細(xì)胞。每張切片選取8個(gè)200倍視野觀察，采用雙盲法判定結(jié)果，同時(shí)由兩位資深病理科醫(yī)師獨(dú)立評分。染色強(qiáng)度：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細(xì)胞百分比：0為0分，1%～10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。以兩項(xiàng)得分的乘積作為總分，總分≥4分為陽性?？偡譃?～6分為弱陽性，記為(+)；6～8分為中度陽性，記為(++)；＞8分為強(qiáng)陽性，記為(+++)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，樣本率的比較采用χ2檢驗(yàn)，以α=0.05作為顯著性檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)，以雙側(cè)P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 VASH1在口腔鱗癌、口腔白斑、口腔扁平苔癬及正?？谇火つぶ械谋磉_(dá)情況 VASH1在正?？谇火つず涂谇槐馄教μ\中多為陰性或弱陽性表達(dá)，在口腔扁平苔蘚中70.00%為陰性表達(dá)，25.00%為弱陽性表達(dá)，僅有5.00%為中度陽性表達(dá)；在正?？谇火つぶ?5.00%為陰性表達(dá)，15.00%為弱陽性表達(dá)；在口腔白斑中30.00%為陰性表達(dá)，30.00%為弱陽性表達(dá)，30.00%為中度陽性表達(dá)，10.00%為強(qiáng)陽性表達(dá)；在口腔鱗癌中20.00%為陰性表達(dá)，18.33%為弱陽性表達(dá)，30.00%為中度陽性表達(dá)，31.67%為強(qiáng)陽性表達(dá)，見圖1～圖6及表1。

圖1 正?？谇火つぃā?00）

圖2 扁平苔蘚（×200）

圖3 口腔白斑(×200)

圖4 高分化鱗狀細(xì)胞癌(×200)

圖5 中分化鱗狀細(xì)胞癌(×200)

圖6 低分化鱗狀細(xì)胞癌(×200)

表1 VASH1在OSCC、OLK、OLP及NOM中的表達(dá)情況(例)

2.2 VASH1在口腔鱗癌中的表達(dá)情況與臨床病理特點(diǎn)的相關(guān)性 VASH1在口腔鱗癌中的表達(dá)明顯高于口腔扁平苔蘚和正?？谇唤M織，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；VASH1在口腔白斑中的表達(dá)也明顯高于口腔扁平苔蘚和正?？谇火つそM織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；VASH1在口腔鱗癌中的表達(dá)隨著分化程度的降低而逐漸增強(qiáng)，且VASH1表達(dá)與腫瘤分化程度、TNM分期及有無淋巴轉(zhuǎn)移差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但與患者的性別、年齡無關(guān)(P＞0.05)，見表2。

表2 OSCC組織中VASH1蛋白表達(dá)與各臨床參數(shù)的關(guān)系[例(%)]

3 討 論

VASH是由VEGF和FGF2誘導(dǎo)的具有抑制血管生成的基因，由研究者通過DNA微陣列分析在血管內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的[6]。VASH有兩個(gè)同系物，即VASH1及VASH2[7]，VASH1被認(rèn)為是一種來源于內(nèi)皮細(xì)胞的負(fù)性調(diào)節(jié)血管新生的蛋白[8]，而VASH2則是一種不依賴于VEGF的且非內(nèi)皮細(xì)胞所固有的促血管生成因子[9]。VASH1具有抑制血管生成的作用，并表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞、心肌及橫紋肌[10]等，在血管發(fā)芽之前終止血管生成，還能夠抑制腫瘤的發(fā)展和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[11]。

近年的研究發(fā)現(xiàn)VASH1在多種惡性腫瘤中存在高表達(dá)。本研究對NOM、OLP、OLK和OSCC中VASH1的表達(dá)進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示：VASH1在NOM中低表達(dá)，與Yoshinaga等[12-13]的結(jié)論相近；在OSCC發(fā)展的過程中，VASH1的表達(dá)強(qiáng)度隨病理分級的升高而增強(qiáng)，這與郭曉峰等[3]對VASH1在食管鱗狀細(xì)胞癌中的研究結(jié)論相同；VASH1在OSCC中的表達(dá)明顯高于NOM，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示OSCC的發(fā)病可能與VASH1的表達(dá)存在著內(nèi)在聯(lián)系；VASH1在OLK中的表達(dá)也明顯高于OLP和NOM，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明相比于OLP和NOM，OLK與VASH1表達(dá)的相關(guān)性更為密切；VASH1在OSCC中的表達(dá)隨著分化程度的降低而逐漸增強(qiáng)，表明VASH1與OSCC的分化程度密切相關(guān)；OSCC中VASH1表達(dá)與TNM分期及有無淋巴轉(zhuǎn)移差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明VASH1的表達(dá)與OSCC的TNM分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。我們推測OSCC中VASH1的表達(dá)增高可能是由于機(jī)體負(fù)反饋調(diào)節(jié)，拮抗血管生長促進(jìn)因子，而出現(xiàn)高表達(dá)。

綜上所述，VASH1在OSCC中的表達(dá)隨著分化程度的降低而逐漸升高，即分化程度越差，VASH1的表達(dá)越高；VASH1在OSCC中也有較高的表達(dá)，可能與其易癌變有一定的關(guān)系，但其具體機(jī)制尚不明確，仍有待探討；VASH1表達(dá)與OSCC的分化程度、TNM分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，可能與OSCC的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移有關(guān)。VASH1具有抑制腫瘤血管和淋巴管生成的作用，有望成為抗OSCC血管形成及腫瘤治療的新方法，但其與口腔黏膜癌前病變癌變機(jī)制、口腔鱗癌的發(fā)病機(jī)制以及臨床應(yīng)用仍需進(jìn)一步探索。

[1]趙 民,劉 瑩,付秀蘭,等.COX-2在口腔扁平苔蘚、口腔乳頭狀瘤及口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)[J].口腔醫(yī)學(xué)研究,2013,2(29): 142-144.

[2]Tamaki K,Moriya T,Sato Y,et al.Vasohibin-1 in human breast carcinoma:a potential negative feedback regulator of angiogenesis[J]. Cancer Sci,2009,100(1):88-94.

[3]郭曉峰,楊鯤鵬,葛曉晴,等.食管鱗狀細(xì)胞癌組織中VASH1蛋白的表達(dá)[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2014,49(2):150-152.

[4]Miyazaki Y,Kosaka T,Mikami S,et al.The progostic significance of vasohibin-1 expression in patients with upper urinary tract urothelial carcinoma[J].Clin Cancer Res,2012,18(15):4145-4153.

[5]朱江蘭,石 蓓.VASH對血管新生的調(diào)節(jié)作用[J].遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2013,36(3):281-284.

[6]Abe M,Sato Y.cDNA microarray analysis of the gene expression profile of VEGF-activated human umbilical vein endothelial cells [J].Angiogenesis,2001,4(4):289-298.

[7]Shibuya T,Watanabe K,Yamashita H,et a1.Isolation and characterization of VASH2 as a homologue of VEGF—inducible endothelium derived angiogenesis inhibitor VASH[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2006,26:1051-1057.

[8]Kern J,Bauer M,Rychli K,et a1.Ahemative splicing of VASHl generates an inhibitor of endothelial cell proliferation，migration and capillary tube formation[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2008, 28:478-484.

[9]Kimura H,Miyashita H,Suzuki Y,et a1.Distinctive localization and opposed roles of vasohibin-1 and vasohibin-2 in the regulation of angiogenesis[J].Blood,2009,113(19):4810-4818.

[10]Kishlyansky M,Vojnovic J,Roudier E,et al.Striated muscle angio-adaptation requires changes in Vasohibin-1 expression pattern [J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2010, 399:359-364.

[11]Watanabe K,Hasegawa Y,Yamashita H,et a1.Vasohibin as an endothelium derived negative feedback regulator of angiogenesis[J]. Clin Invest,2004,114:898-907.

[12]Yoshinaga K,Ito K,Moriya T,et a1.Expression of vasehibin as a novel endothelium derived angiogenesis inhibitor in endometrial cancer[J].Cancer Sci,2008,99(5):914-919.

[13]Yoshinaga K,Ito K,Moriya T,et a1.Roles of intrinsic angiogenesis inhibitor,vasohibin,in cervical carcinomas[J].Cancer Sci,2011, 102(2):446-451.

Expression and significance of VASH1 protein in oral squamous cell carcinoma,oral leukoplakia and oral lichen planus.

SUN Xin,WEI Xiu-feng,LV Shan-shan,LIU Tong,AN Huan-huan,LI Na,GU Nan.Department of Oral Mucosal Disease Office,Hospital of Stomatology,Jilin University,Changchun 130021,Jilin,CHINA

ObjectiveTo explore the expression of vasohibin1(VASH1)in oral squamous cell carcinoma (OSCC),oral leukoplakia(OLK),oral lichen planus(OLP).MethodsImmunohistochemistry was used to detect the expression of VASH1 in 60 cases of OSCC,20 cases of OLK,20 cases of OLP and 20 cases of normal oral tissue. SPSS19.0 was used for statistical analysis.Results(1)The positive expression and staining intensity of VASH1 protein in the OSCC tissue showed an increasing trend with the decreasing of the tissue differentiation degree(P＜0.05). The expression of VASH1 in moderately and poorly differentiated OSCC was significantly higher than that in OLK (P＜0.05).(2)The expression of VASH1 in OLK was significantly higher in that in normal oral mucosa(NOM)and OLP(P＜0.05).(3)The expression of VASH1 in OLP and NOM showed no statistically significant difference(P＞0.05).(4)The expression of VASH1 in oral squamous cell carcinoma with lymph node metastsis group was significantly higher than that without lymph node metastasis group(P＜0.05).ConclusionVASH1 protein may be related to the occurrence of OSCC,development and metastasis.

Vasohibin1(VASH1);Oral squamous cell carcinoma(OSCC);Oral leukoplakia(OLK)

R739.85

A

1003—6350（2015）23—3560—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.23.1288

2015-05-12)

魏秀峰。E-mail：xfw79@sina.com