趨化因子CXCL10啟動子區(qū)-201G/A多態(tài)性與慢性乙型肝炎易感相關(guān)性研究

李曉陽，張 強(qiáng)，易顯富，袁 情，唐文娟

(1.長沙泰和醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖南 長沙 410000；2.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院呼吸科，湖南 長沙 410000；3.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院急診科，湖北 十堰 442000；4.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 廣州 510405；5十堰市婦幼保健院婦女保健科，湖北 十堰 442000)

趨化因子CXCL10啟動子區(qū)-201G/A多態(tài)性與慢性乙型肝炎易感相關(guān)性研究

李曉陽1，張 強(qiáng)2，易顯富3，袁 情4，唐文娟5

(1.長沙泰和醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖南 長沙 410000；2.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院呼吸科，湖南 長沙 410000；3.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院急診科，湖北 十堰 442000；4.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 廣州 510405；5十堰市婦幼保健院婦女保健科，湖北 十堰 442000)

目的 研究趨化因子CXCL10啟動子區(qū)-201G/A位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性(SNP)與漢族人群慢性乙型肝炎(CHB)的易感相關(guān)性。方法采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法對142例慢性乙型肝炎患者(CHB組)和150名健康者(HC組)的CXCL10啟動子區(qū)-201G/A SNP進(jìn)行基因分型，以血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總膽紅素(T-Bil)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)、白蛋白(ALB)、乙型肝炎E抗原(HBeAg)、乙型肝炎病毒(HBV-DNA)及其病毒載量、乙肝病毒大蛋白(HBV-LP)、乙型肝炎病毒前s1抗原(HBV-PreS1)作為檢測指標(biāo)。結(jié)果與HC組比較，CHB組的CXCL10-201位點(diǎn)GA＆AA基因型及A等位基因分布頻率顯著增加，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且等位基因A可增加CHB易感風(fēng)險(xiǎn)(OR=1.940，OR95%CI：1.139～3.305)。CXCL10-201G/A多態(tài)性與ALT、AST、HBeAg、HBV-DNA、HBV-LP、HBV-PreS1陽性率無相關(guān)性(P＞0.05)；CHB組病毒載量在105～106取值范圍時，等位基因A與G分布頻率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.958，P=0.047)。結(jié)論CXCL10啟動子區(qū)-201G/A位點(diǎn)多態(tài)性與CHB患病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)聯(lián)，且等位基因A可能是HBV易感基因。

CXCL10；-201G/A；多態(tài)性；慢性乙型肝炎；易感性

慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B，CHB)是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染引起，遺傳、機(jī)體免疫和環(huán)境綜合作用導(dǎo)致的慢性傳染性疾病。趨化因子γ干擾素誘導(dǎo)蛋白10(CXCL10/IP-10)是趨化性細(xì)胞因子，可介導(dǎo)乙型肝炎過程中病毒清除與炎癥反應(yīng)，在CHB的發(fā)生、發(fā)展和HBV感染相關(guān)肝臟疾病進(jìn)程中起著重要作用[1-2]。CXCL10亦可強(qiáng)化肝細(xì)胞表面選擇素和整合素的表達(dá)，與細(xì)胞穿透血管定向遷移到炎癥部位以致肝細(xì)胞損傷密切相關(guān)[3-4]。研究表明趨化因子CXCL10基因存在多個SNP位點(diǎn)，包括rs56061981、rsl2979860、rsl2980275、rs8099917和rs1439490等，從而在功能上可改變核蛋白的親和力，影響CXCL10轉(zhuǎn)錄水平和表達(dá)[4-5]，進(jìn)而改變個體對HBV的易感性及CHB進(jìn)程，且有研究發(fā)現(xiàn)CXCL10啟動子區(qū)-201G/A多態(tài)性與病毒性肝炎等免疫性疾病可能存在關(guān)聯(lián)性[6-7]。本研究通過比較CXCL10啟動子區(qū)-201G/A基因型及其等位基因在正常人、CHB患者中的分布頻率差異，探討CXCL10-201G/A多態(tài)性與CHB易感相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 142例漢族病例組成員均為2010年5月至2012年11月門診與住院的CHB患者(CHB組)，均符合《2010年慢性乙型肝炎防治指南》診斷標(biāo)準(zhǔn)。病例入選標(biāo)準(zhǔn)：①年齡20～70歲；②HbsAg陽性至少在6個月以上；③血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶反復(fù)升高；④均接受過肝組織活檢，且病理性檢測均符合CHB。同時排除下列情況：前6個月接受過系統(tǒng)的抗病毒藥物治療；失代償期肝病重疊其他感染性疾病、酒精性肝病、脂肪肝和藥物性肝病等；合并精神病、自身免疫性肝炎、糖尿病、甲狀腺功能亢進(jìn)、溶血性貧血；妊娠哺乳婦女或進(jìn)行過器官移植；家族有精神病史，酗酒吸毒史。另選150例體檢正常的志愿者(漢族)為健康對照組(HC組)，無心腦血管病史和肝腎血液病自身免疫性疾病，經(jīng)檢測排除感染性疾病。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 清晨空腹真空采集HBV感染者肘靜脈血3管(K2EDTA抗凝管)，每管2 ml，其中一管在4℃保存，并在室溫下4 h內(nèi)完成肝功能檢測。第2管在4 h內(nèi)離心(3 000 r/m，5 min)，分離并分裝血漿凍于-70℃低溫冰箱，以備檢測血漿HBV-DNA用；第3管用于分離提取外周血淋巴細(xì)胞以備提取基因組DNA。同時由專人用統(tǒng)一調(diào)查表記錄一般的人口學(xué)和流行病學(xué)資料。

1.2.2 患者基因組DNA提取 參照已建立的方法[8]。取EDTA-K2抗凝的全血200 μl與濃度6 mol/L碘化鈉(NaI)1:1混勻，加氯仿/異戊醇(24:1)400 μl，混勻，在15 000 r/min條件下離心15 min，吸取上清液400 μl，加入240 μl純異丙醇混勻，室溫靜置15 min，再在15 000 r/min條件下離心1 min，小心棄去上清液，沉淀物用70%乙醇洗滌3次，室溫干燥，加TE (Tris/EDTA)緩沖液50 μl溶解DNA，-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 TNF-α啟動子區(qū)-863C/A基因型檢測①引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)[6]，由生工生物工程(上海)有限公司合成。上游引物：5'-GCA GAT ACT GTC TCA GAA CCT GGT A-3'；下游引物：5'-TGT CAC CAT CTC TCA TTT TGA TTG T-3'。②PCR擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳：PCR反應(yīng)總體系為25 μl，擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)：94℃先預(yù)變性5 min，然后按94℃40 s、58℃40 s和72℃90 s，共40個循環(huán)，最后72℃延長到5 min。PCR結(jié)束后再取10 μl進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳(5 V/cm，電泳40 min)，在紫外燈下觀察PC R擴(kuò)增效率。③PCR產(chǎn)物鑒定分型-酶切+瓊脂糖凝膠電泳：酶切產(chǎn)物與10×loading buffer(3 μl)混勻，于瓊脂糖凝膠(3%)中電泳鑒定。以D2000作為DNA標(biāo)記物，在1×TAE buffer中電泳30 min(恒壓140 V)。在紫外線下觀察和照相并記錄。④選取部分標(biāo)本的PCR產(chǎn)物送上海英俊生物技術(shù)有限公司，使用ABI 3730測序儀測序，得到測序圖，以驗(yàn)證PCR-FLP的結(jié)果。

1.2.4 觀察指標(biāo)及檢測方法 肝功能指標(biāo)定量檢測采用日立全自動生化分析儀及其配套試劑檢測，具體步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。陽性標(biāo)準(zhǔn): ALT＞40 U/L；AST＞40 U/L。HbeAg檢測采用化學(xué)發(fā)光定量法，在美國Abbott公司ARCHITECT i2000SR全自動分析儀上進(jìn)行，采用儀器配套試劑，按照Abbott化學(xué)發(fā)光免疫分析儀標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行檢測，陽性標(biāo)準(zhǔn)：HbeAg＞1.0 S/CO。HBV-DNA定量采用ABI 7500基因擴(kuò)增儀、以實(shí)時熒光定量PCR法檢測(試劑由上海科華生物技術(shù)公司提供)，PCR反應(yīng)條件及步驟按試劑說明書要求設(shè)置操作，應(yīng)用ABI 7500配套軟件分析HBV DNA載量。HBV DNA陰轉(zhuǎn)標(biāo)準(zhǔn)：＜103copies/ml。HBV-LP、Pre-S1抗原采用ELISA雙抗體夾心法檢測，嚴(yán)格按照試劑盒操作說明書進(jìn)行操作，選擇波長450 nm，通過酶標(biāo)儀測定吸光度(A)值，按要求設(shè)定Cutoff值，測定結(jié)果大于Cutoff值為陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以哈迪溫伯格(Hardy-Weinberg)遺傳平衡定律檢驗(yàn)確認(rèn)研究樣本的群體代表性，以O(shè)R及其OR95%CI表示患病風(fēng)險(xiǎn)；檢驗(yàn)水準(zhǔn)α= 0.05，雙側(cè)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CXCL10-201G/A位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布 CHB組和HC組比較，性別、年齡、家族史、酗酒史和吸煙史等差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，且T-Bil、GGT和ALB差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，提示兩組均衡可比。但ALT和AST組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見表1。經(jīng)哈迪-溫伯格遺傳平衡定律檢驗(yàn)，趨化因子CXCL10啟動子區(qū)-201G/A位點(diǎn)的基因型均符合分布(P＞0.05)，提示研究人群具有良好群體代表性(見表2)。-201G/A位點(diǎn)共有3種基因型，分別是GG、GA和AA，且以GG和GA多見(在CHB和HC組中分別占97.2%和99.3%)。CHB組與HC組基因型(GA+AA)：GG比值分別約為1:2.84和1:5.52,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2= 5.138，P=0.023)，等位基因A：G比值分別約為1:5.88和1:11.50，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.111，P=0.013)。HC組與CHB組比較，GA＆AA基因型與CHB存在統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)(OR=1.946，OR95%CI為1.088～3.479)，等位基因A可能是CHB的危險(xiǎn)因素(OR=1.940，OR95%CI為1.139～3.305)。

表1 兩組人口基本情況及相關(guān)指標(biāo)基線水平的比較(±s)

表1 兩組人口基本情況及相關(guān)指標(biāo)基線水平的比較(±s)

注：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(ALT)，天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)，總膽紅素(T-Bil)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)，白蛋白(ALB)。

組別 性別(例)男女年齡(歲) ALT (U/L) AST (U/L) T-Bil (μmol/L) GGT (U/L) ALB (μmol/L)乙肝家族史(例)是否酗酒(例)是否吸煙(例)有無無有 無CHB組HC組檢驗(yàn)值P值99 100 43 50 χ2=0.313 0.576 41.62±12.97 38.24±14.05t=0.622 0.535 72.71±16.64 31.07±10.25t=37.062 0.000 65.82±9.56 29.06±7.43t=54.449 0.000 17.16±3.24 14.97±2.76t=1.091 0.276 31.30±8.36 32.45±6.52t=0.835 0.404 50.14±14.73 47.73±12.26t=1.316 0.189有21 14 49 43 χ2=2.058 0.151 121 136 64 73 78 77 93 107 χ2=0.379 0.538 χ2=1.153 0.283

表2 趨化因子CXCL10啟動子區(qū)-201G/A基因型分布頻率的比較[例(%)]

2.2 CXCL10-201G/A多態(tài)性與AST、ALT、HbeAg的相關(guān)性 -201G/A的等位基因A與G相比，ALT和AST的陽性率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表3，OR及OR95%CI為1.174(0.604～2.281)和1.268(0.653～2.461)，提示A等位基因可能與CHB患者ALT和AST陽性表達(dá)不相關(guān)；CHB組攜帶等位基因G和A的HbeAg陽性率分別為68.7%和80.5%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，提示等位基因A可能不是HbeAg陽性表達(dá)的危險(xiǎn)因素(OR=1.877，OR95%CI：0.828～4.256)。

表3 多態(tài)性與AST、ALT、HbeAg的相關(guān)性

2.3 CXCL10-201G/A多態(tài)性與HBV-DNA、HBV-LP、HBV-PreS1的相關(guān)性 -201G/A的等位基因A與G相比，HBV-LP、HBV-PreS1及HBV-DNA的表達(dá)降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表4。同時等位基因A與HBV-LP、HBV-PreS1的表達(dá)不相關(guān)(OR95%CI分別為0.489～1.974、0.485～1.829和0.575～2.447)，表明等位基因A可能不會是CHB的保護(hù)因素。-201G/A位點(diǎn)等位基因與HBV-DNA病毒載量相關(guān)性分析結(jié)果顯示：HBV-DNA病毒載量在105～106范圍時，等位基因A與等位基因G差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P= 0.047)，見表5，表明等位基因A可能與HBV-DNA病毒載量相關(guān)，提示等位基因A可能是CHB的危險(xiǎn)因素。

表4 CXCL10-201G/A多態(tài)性與HBV-DNA、HBV-LP、HBV-PreS1的相關(guān)性

表5 CXCL10-201G/A等位基因與HBV-DNA病毒載量的相關(guān)性

3 討論

HBV感染可誘導(dǎo)已感染的肝細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)趨化性CXCL10，CXCL10過度聚集可導(dǎo)致已表達(dá)CXCR3的T細(xì)胞遷移到受感染的肝細(xì)胞，因此CXCL10在病毒性肝炎的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸及肝臟的免疫損傷中起重要作用[9-10]。有研究證實(shí)呈CXCL10的高表達(dá)和相應(yīng)的受體相互作用可趨化白細(xì)胞向炎癥和感染部位遷移，影響正常生理?xiàng)l件下淋巴細(xì)胞的歸巢，也拮抗病理狀態(tài)下炎癥部位對淋巴細(xì)胞的募集[11]。位于CXCL10啟動子區(qū)域的201位點(diǎn)被認(rèn)為具有SNP，γ干擾素刺激外周血單個核細(xì)胞時，擁有AA和GA基因型的患者更易發(fā)生CXCL10高轉(zhuǎn)錄[6，9]。有研究發(fā)現(xiàn)CXCL10啟動子區(qū)-201G/A位點(diǎn)SNP與CHB易感性有相關(guān)性，且-201G/A位點(diǎn)SNP可改變機(jī)體對HBV的易感性及疾病進(jìn)展過程[6，9-10]。本研究結(jié)果顯示我國漢族人群趨化因子CXCL10啟動子區(qū)201位點(diǎn)基因型以(GG+GA)為主，等位基因頻率G＞A，與相關(guān)研究結(jié)果報(bào)道一致[6，9]。同時，本研究證實(shí)-201G/A位點(diǎn)SNP與CHB易感性關(guān)聯(lián)，A等位基因與HBV感染的慢性化相關(guān)。

CHB患者的血清和肝組織中CXCL10水平均增高，且與血清HbeAg、ALT水平等相關(guān)[12]。血清AST/ ALT比值可判斷肝病的嚴(yán)重程度和預(yù)后[13]。本研究結(jié)果顯示：CHB組ALT和AST陽性率在各基因型及等位基因間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，雖未發(fā)現(xiàn)等位基因A能提高CHB患者ALT和AST的陽性率，但由于ALT和AST的升高與病情程度有一定的關(guān)系，在輕度肝炎時仍有患者的ALT和AST在正常范圍[14]，因此不能排除CXCL10啟動子區(qū)-201G/A位點(diǎn)與CHB易感性有關(guān)聯(lián)。HbeAg可判定HBV復(fù)制程度及CHB患者預(yù)后[15]。但是HbeAg的轉(zhuǎn)陰并不能完全排除病毒的感染與復(fù)制的可能，本研究結(jié)果與此相符，等位基因A并不會使CHB患者HbeAg陽性率增加，且亦不能否認(rèn)CXCL10啟動子區(qū)-201G/A位點(diǎn)與CHB的相關(guān)性。

HBV-DNA含量是判斷病毒復(fù)制活躍和具有傳染性最為直接可靠的依據(jù)，定量HBV-DNA可反映HBV基因水平的復(fù)制狀況[16]。有研究表明HBV-LP與HBV-PreS1可反映HBV蛋白水平的復(fù)制狀況[17-18]。HBV-LP與病毒復(fù)制、病毒顆粒組裝和從細(xì)胞內(nèi)釋放調(diào)節(jié)密切相關(guān)。PerS1-Ag是HBV感染標(biāo)志和復(fù)制依據(jù)，可體現(xiàn)病毒復(fù)制和病毒顆粒存在[17]。本研究結(jié)果顯示-201G/A位點(diǎn)與HBV-DNA、HBV-LP、HBV-PreS1陽性率的無相關(guān)性(P＞0.05)，且等位基因A可能不是CHB的保護(hù)因素。外周血HBV-DNA病毒載量水平提示病毒導(dǎo)致肝細(xì)胞損害、破壞，肝功能異常，肝纖維化進(jìn)一步發(fā)展[19-20]。本研究結(jié)果顯示當(dāng)HBV-DNA病毒載量在105～106時，等位基因A與等位基因G組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.047)，攜帶有等位基因A的患病風(fēng)險(xiǎn)是攜帶有等位基因G的2.764倍，提示等位基因A可能與病毒HBV-DNA的復(fù)制相關(guān)，-201G/A多態(tài)性可能改變CHB患者體內(nèi)病毒的復(fù)制狀況。

綜上所述，CXCL10啟動子區(qū)-201G/A多態(tài)性與CHB存在遺傳關(guān)聯(lián)，且等位基因A可能是易感基因，但本研究在設(shè)計(jì)研究方案及結(jié)果分析未充分考慮遺傳因素與環(huán)境因素之間的交互作用，且其作用機(jī)制尚不明確，今后仍需開展大樣本量和不同種族獨(dú)立的病例-對照研究和功能性研究去明確CXCL10啟動子變異體對基因表達(dá)以致CHB發(fā)展和轉(zhuǎn)歸的影響。

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Investigation of the association between the SNP in-201 loci of chemotactic factor CXCL10 gene promoter region and the susceptibility to chronic hepatitis B.

LI Xiao-yang1,ZHANG Qiang2,YI Xian-fu3,YUAN Qing4,TANG Wen-juan5.1.Department of Clinical Laboratory,Taihe Hospital of Changsha City,Changsha 410000,Hunan,CHINA; 2.Department of Respiration,the Third Xiangya Hospital of Central South University,Changsha 410000,Hunan,CHINA; 3.Department of Emergency,the Affiliated Taihe Hospital of Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,Hubei, CHINA;4.Department of Clinical Laboratory,the First Affiliated Hospital of Guangzhou University,Shiyan 442000,Hubei,CHINA; 5.Women'sHealthDepartment,ShiyanMaternalandChildHealthHospital,Shiyan442000,Hubei,CHINA

ObjectiveTo investigate the association between the single nucleotide polymorphism(SNP) in-201 loci of chemotactic factor CXCL10 gene promoter region and the susceptibility to chronic hepatitis B(CHB).MethodsOne hundred and forty-two patients with chronic hepatitis B(CHB group)and 150 healthy controls(HC group)were included in our research.Genotypes of-201 loci in the chemotactic factor CXCL10 gene promoter were examined by the polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP).The serum levels of alanine aminotransferase(ALT),aspartate aminotransferase(AST),total bilirubin(T-Bil),gamma glutamyl transpeptidase(GGT),albumin(ALB),hepatitis B e antigen(HBeAg),hepatitis B virus(HBV-DNA)and the HBV-DNA viral load,hepatitis B virus large protein(HBV-LP)and hepatitis B virus S1 antigen(HBV-PreS1)were detected.ResultsCompared with HC group,the frequency distribution of the GA＆AA genotype of CXCL10-201A/G was significantly increased in CHB group(P＜0.05),as well as the frequency distribution of the A-allele.Moreover, the A-allele of-201 loci may be associated with the susceptibility to CHB virus(OR=1.940,OR95%CI:1.139～3.305). CXCL10-201A/G SNP was not associated with the positive rate of ALT,AST,HbeAg,HBV-DNA,HBV-LP, HBV-PreS1(P＞0.05).When HBV-DNA viral load in the CHB group was in the range of 105～106 copies/ml,the frequency distribution of A-allele and G-allele was statistically significant(χ2=3.958,P=0.047).ConclusionSNPin-201 loci of CXCL10 gene promoter region is associated with susceptibility to chronic hepatitis B,and A-allele may be the susceptible factors of HBV infection.

CXCL10;-201G/A;Polymorphism;Chronic hepatitis B;Susceptibility

R512.6+2

A

1003—6350（2015）14—2093—05

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.14.0755

2015-01-22)

湖北省教育廳資助課題（編號：鄂教科Z20082401）

唐文娟。E-mail：wenjuantangfuyou@163.com