電針足三里對對乙酰氨基酚誘發(fā)大鼠肝損傷炎癥細(xì)胞因子的影響?

蒙光義，王冬曉，彭評志，龐家蓮，莫金權(quán)，楊斌，嚴(yán)明

(1.廣西玉林市第一人民醫(yī)院，廣西玉林537000;2.廣西玉林市婦幼保健院，廣西玉林537000; 3廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南寧530021)

電針足三里對對乙酰氨基酚誘發(fā)大鼠肝損傷炎癥細(xì)胞因子的影響?

蒙光義1，王冬曉2，彭評志1，龐家蓮1，莫金權(quán)1，楊斌3△，嚴(yán)明3

(1.廣西玉林市第一人民醫(yī)院，廣西玉林537000;2.廣西玉林市婦幼保健院，廣西玉林537000; 3廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南寧530021)

目的:研究電針足三里對對乙酰氨基酚(Acetaminophen，APAP)誘發(fā)大鼠肝損傷炎癥細(xì)胞因子水平的影響，探討其對藥源性肝損傷的保護(hù)作用。方法:SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為NC組、APAP1組和Acup1組、APAP2組和Acup2組，各組大鼠連續(xù)給藥或針刺14 d后，檢測大鼠血清和肝臟組織勻漿液白細(xì)胞介素6(IL-6)、白細(xì)胞介素8(IL-8)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的含量。結(jié)果:與APAP1組和APAP2組比較，Acup1組和Acup2組大鼠血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活性水平均顯著性升高。與APAP1組和APAP2組比較，Acup1組和Acup2組大鼠血清和肝臟勻漿組織液中IL-6、IL-8和TNF-α含量水平均顯著升高。結(jié)論:電針足三里上調(diào)APAP誘導(dǎo)大鼠肝損傷血清和肝臟組織炎癥細(xì)胞因子的反應(yīng)和表達(dá)水平，可能會對APAP誘導(dǎo)的肝臟損傷具有一定的促進(jìn)作用。

電針足三里;對乙酰氨基酚;肝損傷;白細(xì)胞介素6;白細(xì)胞介素8;腫瘤壞死因子a;大鼠

“足三里”屬于足陽明胃經(jīng)之合穴。研究顯示，電針足三里對酒精、內(nèi)毒素等毒物所致的肝損傷具有保護(hù)作用。而肝損傷與炎癥細(xì)胞因子密切相關(guān)，故明確電針足三里對機(jī)體炎癥細(xì)胞因子表達(dá)與反應(yīng)的影響，對闡明其保護(hù)肝損傷的作用機(jī)制具有重大意義。因此，本研究通過觀察電針足三里對APAP多次給藥誘發(fā)大鼠肝損傷炎癥細(xì)胞因子水平的影響，探討其對IL-6、IL-8和TNF-α等炎癥細(xì)胞因子調(diào)節(jié)作用與肝損傷的關(guān)系。

1 材料

1.1 動物分組

SD大鼠75只，雌雄各半，體質(zhì)量(230±20)g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供(動物使用許可證號SYXK桂2003-0005)。按隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，即模型1組和模型2組(分別簡稱APAP1組和APAP2組)、電針1組和電針2組(分別簡稱Acup1組和Acup2組)、正常對照組(簡稱NC組)，每組各15只。

1.2 藥品試劑

對乙酰氨基酚片(中美天津史克制藥有限公司，批號08060373);谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，批號2008114和20081114);大鼠白介素-6、白介素-8和腫瘤壞死因子定量酶聯(lián)檢測試劑盒(美國R＆D公司，進(jìn)口分裝，批號0812073、0812083和0812084)。

1.3 主要儀器

G6805-Ⅰ型針灸治療儀(青島鑫升實(shí)業(yè)有限公司)，電熱恒溫水浴(北京長安科學(xué)儀器廠)，低溫高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，722S分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Forma公司)，MULTISKAN MK3酶標(biāo)儀(美國Thermo Forma公司)。

2 方法

2.1 電針穴位

根據(jù)動物穴位定位圖譜［1］，選取大鼠后肢雙側(cè)足三里穴于膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，腓骨小頭下約5 mm處直刺7 mm，針刺后連接G6805-Ⅰ型針灸治療儀持續(xù)電針刺激20 min(電針治療儀參數(shù)設(shè)定為疏密波，頻率14 Hz，強(qiáng)度以大鼠安靜耐受為度，約1mA，保持大鼠清醒狀態(tài)，以雙下肢輕微抖動為宜)。

2.2 給藥方案

APAP1組和APAP2組分別按體質(zhì)量灌胃給予APAP 300和600mg/kg，而Acup1組和Acup2組分別按體質(zhì)量灌胃給予APAP 300和600 mg/kg后，即刻固定在大鼠固定器內(nèi)，電針其后肢雙側(cè)足三里穴位20 min;NC組則給予相同體積劑量的生理鹽水。各組大鼠連續(xù)給藥或電針14 d，末次給藥24 h后采集大鼠血清和肝臟等標(biāo)本進(jìn)行測定。

2.3 指標(biāo)測定

摘除大鼠眼球采集靜脈血靜置0.5～1.0 h，3500 r/min離心15 min分離血清，4℃保存待測。處死大鼠，取部分肝臟加入冰冷的生理鹽水于冰浴中勻漿成10%肝臟組織勻漿液，離心分取上清液，放于-20℃冰箱保存待測。采用賴氏法測定各組大鼠血清ALT和AST活性水平，采用雙抗體夾心ABC-ELISA法測定血清和肝臟組織炎癥細(xì)胞因子IL-6、IL-8和TNF-α含量。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間均數(shù)比較采用方差分析，2組間比較采用t檢驗(yàn)，以α=0.05為顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

3 結(jié)果

3.1 電刺足三里對APAP誘導(dǎo)大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶的影響

表1顯示，與NC組比較APAP2組大鼠血清AST、ALT活性水平均明顯升高(P＜0.01)，表明APAP2組成功建立了肝損傷模型。與APAP1組和APAP2組比較，Acup1組和Acup2組大鼠AST和ALT活性水平進(jìn)一步增高，相應(yīng)組別間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)，提示電刺足三里能夠促進(jìn)APAP誘導(dǎo)大鼠血清AST和ALT活性水平的進(jìn)一步升高。

表1 電針足三里對APAP誘導(dǎo)大鼠血清AST和ALT活性的影響(±s)

表1 電針足三里對APAP誘導(dǎo)大鼠血清AST和ALT活性的影響(±s)

注:與NC組比較:△P＜0.05，△△P＜0.01;與相應(yīng)模型組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別鼠數(shù)AST(U·L-1)ALT(U·L-1)空白對照組(NC組)15107.36±24.9422.15±6.32模型1組(APAP1組)15102.71±31.7725.69±11.92電針1組(Acup1組)14140.34±43.95△＊44.17±15.24△△＊＊模型2組(APAP2組)11281.89±63.85△△39.53±11.91△△電針2組(Acup2組)13532.19±136.18△△＊＊65.04±22.18△△＊＊

3.2 電針足三里對APAP誘發(fā)肝損傷大鼠血清炎癥細(xì)胞因子的影響

表2顯示，與NC組比較各模型組和電針組大鼠血清IL-6、IL-8和TNF-α含量水平均明顯升高(P＜0.01)，提示APAP能夠誘導(dǎo)血清炎癥細(xì)胞因子水平的增高，誘發(fā)機(jī)體炎癥反應(yīng)的發(fā)生。與APAP1和APAP2組比較，Acup1組和Acup2組大鼠血清IL-6、IL-8和TNF-α含量水平進(jìn)一步顯著性增高，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，提示電針足三里能夠上調(diào)APAP誘導(dǎo)大鼠血清炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)水平。

表2 電針足三里對APAP誘發(fā)肝損傷大鼠血清炎癥細(xì)胞因子的影響(±s)

表2 電針足三里對APAP誘發(fā)肝損傷大鼠血清炎癥細(xì)胞因子的影響(±s)

注:與NC組比較:△P＜0.01;與相應(yīng)模型組比較:*P＜0.01

組別鼠數(shù)IL-6(pg/ml)IL-8(pg/ml)TNF-α(pg/ml)空白對照組(NC組)1533.24±8.0516.02±3.354.43±1.14模型1組(APAP1組)1557.19±12.42△29.84±5.22△4.38±1.05電針1組(Acup1組)1484.33±17.60△＊44.72±8.16△＊10.06±2.11△＊模型2組(APAP2組)11172.07±31.76△59.16±11.08△16.34±2.91△電針2組(Acup2組)13256.84±36.52△＊76.48±18.35△＊21.18±6.27△＊

3.3 電針足三里對APAP誘發(fā)肝損傷大鼠肝臟炎癥細(xì)胞因子的影響

表3顯示，與NC組比較，各模型組和電針組大鼠肝臟IL-6、IL-8和TNF-α含量水平均明顯升高(P＜0.01)。與APAP1和APAP2組比較，Acup1組和Acup2組大鼠血清IL-6、IL-8和TNF-α含量水平進(jìn)一步顯著性增高(P＜0.01)，提示APAP能夠誘導(dǎo)肝臟組織炎癥細(xì)胞因子水平的增高，誘發(fā)肝臟炎癥反應(yīng)的發(fā)生;而電針足三里則加劇誘導(dǎo)APAP所致肝損傷炎癥細(xì)胞因子的進(jìn)一步表達(dá)和反應(yīng)，上調(diào)其表達(dá)水平。

表3 電針足三里對APAP誘發(fā)肝損傷大鼠肝臟炎癥細(xì)胞因子的影響(±s)

表3 電針足三里對APAP誘發(fā)肝損傷大鼠肝臟炎癥細(xì)胞因子的影響(±s)

注:與NC組比較:△P＜0.01;與相應(yīng)模型組比較:*P＜0.01

組別例數(shù)IL-6(pg/ml)IL-8(pg/ml)TNF-α(pg/ml)空白對照組(NC組)15215.34±53.18134.97±37.4037.22±8.94模型1組(APAP1組)15347.28±77.94△261.04±51.42△62.83±12.06△電針1組(Acup1組)14984.33±183.60△＊544.72±98.16△＊110.06±20.75△＊模型2組(APAP2組)111329.40±230.67△873.56±153.08△261.60±47.94△電針2組(Acup2組)131682.15±344.05△＊1125.62±197.42△＊336.75±68.23△＊

4 討論

APAP長期大劑量使用時(shí)，代謝產(chǎn)生的N-乙酰對苯醌亞胺能夠誘發(fā)肝細(xì)胞變形壞死導(dǎo)致肝損傷，而血清轉(zhuǎn)氨酶則是肝細(xì)胞損傷的敏感標(biāo)志物。研究結(jié)果顯示，APAP2組大鼠連續(xù)給予600mg/kg劑量APAP 14 d后誘發(fā)肝損傷，而電針足三里則進(jìn)一步促進(jìn)大鼠血清AST和ALT活性水平的升高，提示其可能促進(jìn)肝臟的進(jìn)一步損傷。

TNF-α主要由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，是機(jī)體炎癥反應(yīng)起關(guān)鍵始動作用的促炎細(xì)胞因子［2-3］。IL-6和IL-8與TNF-α共同組成機(jī)體的正性致炎因子，使細(xì)胞發(fā)生趨化運(yùn)動、激活中性粒細(xì)胞釋放彈性蛋白，生成活性氧化代謝物及引起組織浸潤反應(yīng)，造成肝細(xì)胞壞死和轉(zhuǎn)氨酶升高［4-5］。因此，有效抑制機(jī)體中TNF-α等炎癥細(xì)胞因子水平，對減輕炎癥反應(yīng)和器官組織損傷具有重要意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，APAP1組和APAP2組大鼠血清和肝臟組織IL-6、IL-8和TNF-α含量水平表達(dá)水平均與血清AST和ALT活性水平的升高趨勢相一致，表明大劑量的APAP能夠誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子的上調(diào)表達(dá)水平，誘發(fā)肝臟炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

文獻(xiàn)報(bào)道表明，電針足三里能夠抑制炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)水平和減輕各種器官的炎癥反應(yīng)。胡森等［6-7］研究結(jié)果表明，電針足三里顯著抑制盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)制備膿毒癥模型大鼠肝臟炎癥細(xì)胞因子表達(dá)水平，減輕肝臟組織水腫和功能損傷?；魟t軍等［8］研究表明，電針足三里通過下調(diào)TNF-α和IL-6表達(dá)水平而抑制炎性反應(yīng)，對脊髓缺血再灌注損傷家兔有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。李文迅［9］研究表明，電針足三里可以對機(jī)體TNF-α等炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生良性誘導(dǎo)，改變相關(guān)炎性細(xì)胞因子的合成與釋放，提高慢性佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的抗炎修復(fù)功能。

本研究結(jié)果顯示，電針足三里促進(jìn)APAP誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子水平的表達(dá)上調(diào)，且與其促進(jìn)血清AST和ALT活性水平的升高趨勢相同，表明電針足三里能夠促進(jìn)APAP誘導(dǎo)大鼠肝臟炎癥的進(jìn)一步反映，可能會促進(jìn)APAP誘導(dǎo)肝臟的進(jìn)一步損傷。顯然，本研究結(jié)果與上述相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道不一致，可能與選用造模藥物或針刺方法不同等因素有關(guān)。筆者的前期研究結(jié)果表明，電針足三里能夠促進(jìn)APAP在大鼠體內(nèi)的吸收而增大其生物利用度，減慢藥物清除率，延長其在體內(nèi)的平均滯留時(shí)間［10］。因此，筆者推測電針足三里促進(jìn)APAP所致炎癥細(xì)胞因子水平的上調(diào)表達(dá)，從而促進(jìn)肝臟的進(jìn)一步損傷，可能與電針足三里促進(jìn)APAP生物利用度增大、而清除率減慢、導(dǎo)致APAP積蓄中毒誘發(fā)肝損傷有關(guān)，電針足三里可能間接地促進(jìn)APAP誘導(dǎo)肝臟的進(jìn)一步損傷。

中醫(yī)理論認(rèn)為，電針足三里能夠?qū)C(jī)體進(jìn)行雙向調(diào)節(jié)，電針足三里促進(jìn)APAP誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子上調(diào)表達(dá)的同時(shí)，是否相應(yīng)上調(diào)有關(guān)抗炎細(xì)胞因子(如IL-4、IL-10和IL-13等)的表達(dá)和反應(yīng)來維持促炎和抗炎的平衡，以保護(hù)APAP誘發(fā)的肝損傷尚未明確，電針足三里對肝損傷的影響作用及其相關(guān)作用機(jī)制都有待進(jìn)一步的深入研究。

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Effect of Acupuncture at Zusanli Acupoint on Inflammatory Cytokines of Hepatic Injury With Given Multiple Doses of Paracetamol in Rats

MENG Guang-yi1，WANG Dong-xiao2，PENG Ping-zhi1，PANG Jia-lian1，MO Jin-quan1，
YANG Bin3△，YAN Ming3(1．The First People's Hospital of Yulin City，Guangxi，Yulin 537000，China;2．The Maternal and Child Health-Care Hospital of Yulin City，Guangxi，Yulin 537000，China;3．Pharmacy College，Guangxi Medical University，Nanning 530021，China)

Objective:To investigate the effects of acupuncture at Zusanli acupoint on inflammatory cytokines changes in rats with given multiple doses of paracetamol，and the protective effect of acupuncture on hepatic injury.Methods:SD rats were divided into five groups，the NC group，the APAP1group and the Acup1group，the APAP2group and the Acup2group.Each group was given paracetamol or saline once a day for 14 continuous days，and the serum levels of alanine transaminase(ALT)and aspartate transaminase(AST)of the rats were measured，and the levels of Interleukin 6(IL-6)、Interleukin 8(IL-8)、tumor necrosis factor-α(TNF-α)in serum and liver tissue homogenate were determined by euzymelinked immunosorbent assay(ELISA)respectively.Results:Compared with groups of APAP1andAPAP2，the levels of serum AST and ALT were significantly increased in groups of Acup1and Acup2.And compared with groups of APAP1andAPAP2，the levels of IL-6，IL-8 and TNF-α in the serum and liver were significantly increased in groups of Acup1and Acup2.Conclusion:The results suggest that electroacupuncturing Zusanli acupoints can increase levels of inflamatory IL-6，IL-8 and TNF-α in the serum and liver，and may promote liver damage induced by paracetamol.

Electroacupuncture Zusanli;paracetamol;hepatic injury;Interleukin 6;Interleukin 8;tumor necrosis factor-α;rat

R245.9+7

:B

:1006-3250(2015)05-0575-03

2015-02-08

廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(桂科自0991135):針刺對對乙酰氨基酚所致肝損傷的保護(hù)作用機(jī)制研究

蒙光義(1983-)，男，廣西靈山人，主管藥師，醫(yī)學(xué)碩士，從事臨床藥理學(xué)和藥物毒理學(xué)研究。

△通訊作者:楊斌(1964-)，男，廣西靈山人，教授，醫(yī)學(xué)博士，碩士研究生導(dǎo)師，從事藥物毒理學(xué)和中藥藥理學(xué)研究，Tel:0771-5358272，E-mail:yangbin2003202@sina.com。