電針內(nèi)關(guān)穴對心肌缺血大鼠ATP敏感性鉀離子通道蛋白的影響?

李迪，王穎，戴儉宇，劉昱甫，荊秦，王熙，王列

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，沈陽110847)

電針內(nèi)關(guān)穴對心肌缺血大鼠ATP敏感性鉀離子通道蛋白的影響?

李迪，王穎△，戴儉宇，劉昱甫，荊秦，王熙，王列

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，沈陽110847)

目的:研究電針循經(jīng)穴位與其他穴位對心肌缺血大鼠心肌細(xì)胞ATP敏感性鉀離子通道相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。方法:通過注射鹽酸異丙腎上腺素制作大鼠心肌缺血模型，針刺內(nèi)關(guān)、列缺、非經(jīng)非穴進(jìn)行干預(yù)，采用Western blot檢測Kir6.1、Kir6.2、SUR2A和SUR2B的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:與模型組比較，內(nèi)關(guān)組和列缺組蛋白表達(dá)均顯著降低，非經(jīng)非穴組蛋白表達(dá)降低不顯著;與列缺組比較，內(nèi)關(guān)組蛋白表達(dá)顯著降低。結(jié)論:電針內(nèi)關(guān)穴和列缺穴均可降低心肌缺血大鼠心肌細(xì)胞ATP敏感性鉀通道相關(guān)蛋白的表達(dá)，且心包經(jīng)內(nèi)關(guān)穴的針刺效應(yīng)優(yōu)于列缺穴。

心肌缺血;ATP敏感性鉀離子通道;蛋白表達(dá);內(nèi)關(guān)

ATP敏感性鉀離子通道(ATP-sensitive potassium channels，KATP通道)是日本學(xué)者Noma于1983年在豚鼠的心肌細(xì)胞中首先發(fā)現(xiàn)的［1］，它是由2個(gè)亞基構(gòu)成的四聚體，即內(nèi)向整流鉀通道(inwardly-rectifying potassion channel，Kir)和ATP結(jié)合蛋白超家族成員磺酰脲類受體(SUR)。構(gòu)成KATP通道的Kir和SUR分別有Kir6.1、Kir6.2和SUR2A、SUR2B 2種亞型。在心肌細(xì)胞中，KATP通道的主要表達(dá)形式是Kir6.2和SUR2A［2］。

ATP是KATP通道最強(qiáng)而有效的內(nèi)源性阻滯劑。在生理狀態(tài)下，心肌細(xì)胞內(nèi)的ATP濃度相對較高，能夠與KATP通道上的ATP結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合而達(dá)到飽和，從而使KATP通道處于關(guān)閉狀態(tài)。在心肌缺血時(shí)，心肌細(xì)胞內(nèi)的ATP濃度降低，ATP/ADP比率下降，KATP通道上的ATP結(jié)合不足，致使KATP通道開放。激活的KATP通道可以促進(jìn)K+外流增加，心肌細(xì)胞趨于復(fù)極化或超極化，縮短動(dòng)作電位時(shí)程;同時(shí)能夠抑制Na+-Ca2+通道，降低心肌細(xì)胞Ca2+濃度，減輕Ca2+超載，使心肌收縮力降低，心肌耗氧量減少，從而產(chǎn)生心肌保護(hù)作用［3-4］。

本實(shí)驗(yàn)通過注射異丙腎上腺素法復(fù)制心肌缺血大鼠模型，采用Western Blot檢測方法，觀察不同經(jīng)脈穴位對心肌細(xì)胞KATP通道相關(guān)蛋白(Kir6.1、Kir6.2、SUR2A、SUR2B)表達(dá)的影響，探討“穴位-經(jīng)脈-心臟”之間的特異性聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性SPF級SD大鼠72只，體質(zhì)量(200± 25)g，由遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供(許可證號SCXE2010-0001)，在室溫(24±1)℃、相對濕度(50±5)%的同等條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 主要試劑及儀器

鹽酸異丙腎上腺素(美國SIGMA公司，I5627-5G)，Rabbit Anti-Kir6.1 antibody(美國Abcam公司，ab80972)，Rabbit Anti-Kir6.2 antibody(美國Abcam公司，ab79171)，Goar Anti-SUR2A antibody(美國Abcam公司，sc32462)，Goar Anti-SUR2B antibody (美國Abcam公司，sc5793)，Mouse Anti-GAPDH Monoclonal antibody(美國Abcam公司，20120912)。

BL-420S生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)，6805-D電針儀(汕頭市醫(yī)用設(shè)備有限公司)，“華佗牌”針刺針(0.18 mm×0.25 mm蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)，-80℃超低溫冰箱(日本SANYO電器集團(tuán))，TGL-20M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(湘儀離心機(jī)廠)，TS-1000水平脫色搖床(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)，MINIVE蛋白電泳及轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(GE公司)，IQ350冷CCD凝膠成像系統(tǒng)(GE公司)。

1.3 方法

采用0.3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射法對大鼠進(jìn)行麻醉后，描述正常狀態(tài)下心電圖。按隨機(jī)數(shù)字表法抽取10只大鼠作為對照組，采用一次性多點(diǎn)位(四肢內(nèi)側(cè)根部)注射生理鹽水(85 mg/kg);其余62只大鼠以同樣方式注射鹽酸異丙腎上腺素(85 mg/kg)復(fù)制動(dòng)物模型。間隔24 h注射1次，再次描述心電圖。當(dāng)心電圖出現(xiàn)T波由正變負(fù)或雙相并伴有ST段抬高、QRS波增寬、竇性心動(dòng)過速、期前收縮或其他心律失常等現(xiàn)象時(shí)，則認(rèn)為造模成功［5-6］(圖1、2)。將造模成功的40只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、內(nèi)關(guān)組、列缺組、非經(jīng)非穴組每組各10只。

內(nèi)關(guān)穴、列缺穴的定位依據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》［7］中大鼠針灸穴位的定位方法進(jìn)行定位，非經(jīng)非穴定位于大鼠腹部神闕與天樞連線的中點(diǎn)。采用“華佗牌”針灸針(0.18 mm×0.25 mm)順經(jīng)30°角斜刺入各組大鼠相應(yīng)穴位皮下2 mm。待大鼠穩(wěn)定后接入電針儀，施以疏密波，頻率2～20Hz，電流強(qiáng)度以大鼠前肢出現(xiàn)與電針頻率相一致的輕微顫動(dòng)為宜。留針20 min，每日1次，連續(xù)7次。對照組與模型組不進(jìn)行針刺。

1.4Western blot分析

將各組大鼠斷脊處死，在冰袋上迅速分離出心臟組織，用冰生理鹽水沖洗干凈，將組織盡量剪碎后放置于玻璃勻漿器中，與裂解液按1∶1000比例混合。充分裂解后，以12000 r/min，4℃離心10 min取上清液，加入1 oading煮沸5 min以定性。采用Broadford蛋白濃度測定法測定蛋白濃度，以確定上樣量。

配置濃縮膠和分離膠，將Mark與樣本按照順序以50μg/孔上樣后電泳(電源參數(shù):濃縮膠80 V，約15 min，分離膠120 V，以不跑出膠外為主);將蛋白樣品轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(電源參數(shù):80 mA，20 V，3 h);將轉(zhuǎn)移膜取下，用TBST從下向上浸濕后轉(zhuǎn)至含有封閉液(5%脫脂奶粉)的平皿中，37℃水浴震蕩1 h;對照標(biāo)準(zhǔn)Marker將膜上的目標(biāo)蛋白剪下，同時(shí)將一抗用封閉液稀釋到適當(dāng)濃度，一起放入雜交袋中，37℃水浴震蕩1 h后4℃過夜;用TBST在室溫下脫色搖床上液洗3次，每次5 min。同樣方法封閉液配置二抗并與膜接觸，37℃水浴震蕩孵育1 h后，TBST在室溫下脫色搖床上液洗4次，每次5 min;使用IQ350冷CCD凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，分析目標(biāo)條帶和內(nèi)參條帶的凈光密度值以及比值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心電圖T波電壓變化

表1顯示，實(shí)驗(yàn)過程中對照組大鼠心電圖無明顯變化(P＞0.05);造模后，模型組、非經(jīng)非穴組、內(nèi)關(guān)組和列缺組大鼠心電圖T波電壓變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與造模后比較，針刺后的內(nèi)關(guān)組和列缺組大鼠心電圖T波電壓變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且內(nèi)關(guān)組大鼠心電圖T波電壓升高幅度明顯大于列缺組，非經(jīng)非穴組大鼠心電圖T波電壓變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 實(shí)驗(yàn)過程中各組大鼠心電圖T波電壓變化(±s)

表1 實(shí)驗(yàn)過程中各組大鼠心電圖T波電壓變化(±s)

注:組內(nèi)與造模前比較:◆P＜0.05，◆◆P＜0.01;與造模后比較:▼P＜0.05，▼▼P＜0.01。組間針刺后與對照組比較:■P＜0.05，■■P＜0.01;與模型組比較:▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組別鼠數(shù)(只)造模前造模后針刺后對照組100.139±0.0620.131±0.0520.152±0.038模型組100.134±0.0670.042±0.032◆◆0.044±0.032◆◆■■非經(jīng)非穴組100.127±0.0280.043±0.020◆◆0.045±0.021◆◆■■內(nèi)關(guān)組100.143±0.0300.042±0.010◆◆0.117±0.039◆▼▼■▲▲列缺組100.122±0.0340.041±0.024◆◆0.082±0.046◆▼■■▲

2.2 各組大鼠KATP通道相關(guān)蛋白表達(dá)變化

圖3表2顯示，在western blot檢測中，Kir6.1、Kir6.2、SUR2A和SUR2B蛋白表達(dá)量的變化趨勢呈現(xiàn)一致性。心肌缺血時(shí)，模型組的蛋白表達(dá)量明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。電針7 d后與模型組比較，內(nèi)關(guān)穴組、列缺穴組各指標(biāo)的蛋白表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且內(nèi)關(guān)組明顯高于列缺組(P＜0.05);非經(jīng)非穴組各指標(biāo)的蛋白表達(dá)量變化不顯著，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

圖1 造模前大鼠心電圖

圖2 造模后大鼠心電圖

圖3 各組大鼠左室心肌細(xì)胞Kir6.1、Kir6.2、SUR2A和SUR2B蛋白表達(dá)情況

表2 各組大鼠左室心肌細(xì)胞Kir6.1、Kir6.2、SUR2A和SUR2B蛋白表達(dá)情況(±s)

表2 各組大鼠左室心肌細(xì)胞Kir6.1、Kir6.2、SUR2A和SUR2B蛋白表達(dá)情況(±s)

注:與對照組比較:■P＜0.05，■■P＜0.01;與模型組比較:▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組別鼠數(shù)(只)Kir6.1Kir6.2SUR2ASUR2B對照組100.204±0.0200.209±0.0290.219±0.0210.241±0.029模型組100.374±0.031■■0.383±0.029■■0.468±0.034■■0.491±0.059■■非經(jīng)非穴組100.360±0.002■■0.372±0.039■■0.437±0.009■■0.468±0.027■■內(nèi)關(guān)組100.258±0.029■▲▲0.264±0.016■▲▲0.291±0.018■▲▲0.316±0.033■▲▲列缺組100.310±0.047■■▲0.317±0.025■■▲0.374±0.058■■▲▲0.393±0.033■■▲

3 討論

心肌缺血是指心臟的血流量減少、供氧減少、心肌細(xì)胞能量代謝不正常、不能支持心臟正常工作的一種病理狀態(tài)，其主要病理機(jī)制是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化造成的冠脈狹窄或閉塞，改善冠狀動(dòng)脈的病理狀態(tài)已被廣泛關(guān)注［8-9］。

冠狀動(dòng)脈起始于主動(dòng)脈干的冠狀動(dòng)脈竇，經(jīng)左右心耳與肺動(dòng)脈干之間產(chǎn)生分支，形成血管網(wǎng)散布于心臟大部分。冠狀動(dòng)脈為心臟提供血液，血流總量占心輸出量的4%～5%。在中醫(yī)理論中，心包絡(luò)是心臟外面的包膜，是心臟的外圍組織，其上附著通行氣血的脈絡(luò)，起著保護(hù)心臟、代心受邪的作用。由于冠狀動(dòng)脈與心包絡(luò)的形態(tài)與功能相似，學(xué)者普遍認(rèn)為冠狀動(dòng)脈與心包絡(luò)有密切的聯(lián)系［10］?，F(xiàn)代研究中，大鼠內(nèi)關(guān)穴區(qū)神經(jīng)和心臟神經(jīng)的投影進(jìn)行示蹤時(shí)發(fā)現(xiàn)，大鼠C5-C7脊神經(jīng)節(jié)及迷走神經(jīng)節(jié)中存在著同源細(xì)胞，針刺內(nèi)關(guān)穴可以通過這些同源細(xì)胞來調(diào)節(jié)心臟的功能活動(dòng)，這揭示了“內(nèi)關(guān)-脊神經(jīng)節(jié)-心臟短反射”的存在［11］。另外有報(bào)道指出，來自內(nèi)關(guān)穴和來自心臟的感覺神經(jīng)纖維的細(xì)胞體在C6-T1脊神經(jīng)節(jié)中匯聚，來自內(nèi)關(guān)穴和心臟的交感節(jié)后纖維的細(xì)胞體在交感神經(jīng)頸下節(jié)和T1-T3交感神經(jīng)節(jié)中共存，這些交匯處的神經(jīng)節(jié)構(gòu)成了軀體神經(jīng)與內(nèi)臟神經(jīng)之間機(jī)能聯(lián)系的樞紐，是針刺內(nèi)關(guān)穴得氣感與心臟神經(jīng)效應(yīng)伴同發(fā)生的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)［12］。列缺穴所在的部位受前臂外側(cè)皮神經(jīng)的支配［13］，前臂外側(cè)皮神經(jīng)是臂叢外側(cè)束所發(fā)出的肌皮神經(jīng)的分支之一，而支配肌皮神經(jīng)脊髓階段是C5-C7［14］。與內(nèi)關(guān)穴相似，列缺穴也與支配心臟的脊髓階段相重合。

內(nèi)關(guān)是手厥陰心包經(jīng)別走手少陽三焦經(jīng)的絡(luò)穴。內(nèi)關(guān)穴與陰維脈相通，是八脈交會(huì)穴之一，陰維脈病可以導(dǎo)致心痛，如《難經(jīng)·二十九難》所言“陰維為病苦心痛”。內(nèi)關(guān)穴的穴位特性是內(nèi)關(guān)治療心病的主要機(jī)理和依據(jù)，使之成為歷代醫(yī)家治療心痛病癥的首選穴。心包是心的護(hù)衛(wèi)，直接與心相連，正如《滑壽醫(yī)學(xué)全書》記載:“心包，一名手心主，以藏象校之，在心下橫膜之上，豎膜之下。其與橫膜相黏，而黃脂裹者，心也。脂膜之外，有細(xì)筋膜如絲，與心肺相連者，心包也?！蓖瑫r(shí)可以看出，肺是借助心包間接地與心相聯(lián)系。而列缺穴是手太陰肺經(jīng)的絡(luò)穴，手太陰肺經(jīng)內(nèi)屬于肺，肺主宗氣、朝百脈，宗氣灌注心脈行氣血，對心主血脈起到輔助作用。因此，針刺手太陰肺經(jīng)的列缺穴治療心臟病不如手厥陰心包經(jīng)內(nèi)關(guān)穴效果直接而顯著。

本實(shí)驗(yàn)通過制造心肌缺血模型發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠心電圖T波電壓下降，心肌細(xì)胞膜上KATP通道蛋白表達(dá)水平明顯升高。電針7 d后，內(nèi)關(guān)組和列缺組大鼠心電圖T波電壓升高顯著，且左心室心肌細(xì)胞上的KATP通道蛋白的表達(dá)量均降低，而非經(jīng)非穴組的T波電壓和蛋白表達(dá)變化不明顯。結(jié)果表明，電針內(nèi)關(guān)穴和列缺穴均可改善大鼠心肌缺血的癥狀，且內(nèi)關(guān)組的針刺效應(yīng)優(yōu)于列缺組。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，針刺手厥陰心包經(jīng)內(nèi)關(guān)穴治療心肌缺血具有循經(jīng)特異性的特點(diǎn)。

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Effect of Neiguan point on the Protein Expression of ATP-sensitive potassium channels of Rat with Myocardial ischemia

LI Di，WANG Ying△，DAI Jian-yu，LIU Yu-fu，JING Qin，WANG Xi，WANG Lie
(Acupuncture and Massage College，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Liaoning，Shenyang 110847，China)

Objective:To study the effect of needling at points of pericardium meridian of Hand Jueyin on the protein expression of ATP-sensitive potassium channels in rat cardiomyocytes of myocardial ischemia(MI)，compare selecting acupoints according to meridian with others.Methods:SD rats were randomly divided into control group，model group，Neiguan-point group，Lieque-point group and non-meridians-points group，and observe the change of the channel in rat cardiomyocytes of MI by the method of western blot.Results:Compared with model group，the protein expression of Neiguan-point group and Lieque-point group were decreased.There was no significance between non-meridiams-points group and model group.The protein expression of Neiguan-point group was lower than Lieque point group，but it was higher than control group.Conclusion:Electro-acupuncture(EA)at Neiguan-points and Lieque-points can decrease the protein expression of ATP-sensitive potassium channels in myocardial cells，and the effect of Neiguan-point was better than Liequepoint.

Myocardial ischemia;ATP-sensitive potassium channels;Protein expression;Neiguan-point

R245.9+7

:B

:1006-3250(2015)05-0571-04

2015-02-24

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(2012CB518500)-經(jīng)穴效應(yīng)循經(jīng)特異性靶器官響應(yīng)的生物學(xué)基礎(chǔ)研究

李迪(1988-)，女，在讀碩士，從事針灸機(jī)理的臨床與研究。

△通訊作者:王穎(1964-)，男，副教授，醫(yī)學(xué)碩士，從事針灸機(jī)理的臨床與研究，E-mail:wangrying@126.com。