芥菜類(lèi)蔬菜的組織培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用研究進(jìn)展

摘 要 組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)于芥菜類(lèi)蔬菜育種材料的保存與繁殖、遺傳轉(zhuǎn)化、種質(zhì)資源創(chuàng)制有著十分重要的意義。主要對(duì)芥菜類(lèi)蔬菜器官離體培養(yǎng)的現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，包括：外植體類(lèi)型（子葉、帶柄子葉及下胚軸），外植體生理狀態(tài)（苗齡等），外植體極性（近根端、近芽端）與接種方式（正插、平放等）；培養(yǎng)基類(lèi)型及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合濃度等。分析認(rèn)為，影響芥菜類(lèi)蔬菜作物離體再生的各種因素是相互作用的，通過(guò)選擇適宜的外植體類(lèi)型和最佳生理時(shí)期，改良培養(yǎng)基及優(yōu)化生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比，優(yōu)化培養(yǎng)條件及使用培養(yǎng)基添加物，綜合所有的因素進(jìn)行優(yōu)化，才能獲得高效的芥菜類(lèi)蔬菜離體培養(yǎng)再生體系。

關(guān)鍵詞 蔬菜；芥菜類(lèi)；組織培養(yǎng)；培養(yǎng)基；生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑

中圖分類(lèi)號(hào)：S645.9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-890X（2015）31-025-04

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芥菜類(lèi)蔬菜屬于十字花科蕓薹屬芥菜種的一、二年生草本植物栽培變種群[1]，分為根芥、莖芥、葉芥、薹芥四種類(lèi)型[2]。通常作為蔬菜、油料和調(diào)料作物栽培[1]。芥菜是我國(guó)重要的原產(chǎn)蔬菜種類(lèi)，栽培歷史悠久，分布廣泛，種質(zhì)資源豐富。

植物離體培養(yǎng)具有占用空間小、繁殖速度快、培養(yǎng)物脫毒等特點(diǎn)，是現(xiàn)代農(nóng)作物育種、生產(chǎn)上常用的技術(shù)手段。在芥菜育種的研究中，離體培養(yǎng)技術(shù)可以作為實(shí)驗(yàn)室育種的常規(guī)技術(shù)，保存難以獲得種子的材料，為今后芥菜細(xì)胞培養(yǎng)、遺傳研究、基因工程技術(shù)搭建技術(shù)平臺(tái)。本文綜述芥菜類(lèi)蔬菜組織培養(yǎng)技術(shù)的研究進(jìn)展。

1植物材料基因型

植物材料的基因類(lèi)型直接影響著離體培養(yǎng)的效果，不同材料再生能力不同[3]。陳石頭[4]以五個(gè)不同品種榨菜子葉為外植體時(shí)，不定芽誘導(dǎo)率不明顯，而以子葉柄為外植體時(shí)，五個(gè)品種間不定芽的誘導(dǎo)率有明顯差異。余小林等[1]認(rèn)為不同的基因型嚴(yán)重影響著第一代愈傷組織的分化。沈進(jìn)娟等[5]認(rèn)為不同榨菜品種之間外植體不定芽的分化率差異明顯，“藺市草腰子”和“郫縣榨菜”容易誘導(dǎo)不定芽，而“永安小葉”不容易被誘導(dǎo)，其外植體的分化率均比較低。吳慧敏等[3]在葉用芥菜小孢子培養(yǎng)中，最終認(rèn)為不同基因型材料間胚狀體產(chǎn)量差異顯著。陳材林等[6]認(rèn)為芥菜類(lèi)作物在自然選擇和人工選擇的共同影響下形成了一系列變異類(lèi)型。付杰等[7]認(rèn)為在所有栽培作物中，芥菜變異的程度之大是少見(jiàn)的，是蕓薹屬植物在進(jìn)化上的一個(gè)典型種類(lèi)。芥菜在組織培養(yǎng)中基因型差異嚴(yán)重影響了愈傷組織的誘導(dǎo)及愈傷組織的分化。何曉明[8]在菜薹研究中指出，所用6個(gè)菜薹品種在相同的培養(yǎng)基上不同品種間不定芽的分化能力有著明顯差異。

2植物外植體

2.1外植體類(lèi)型

植物不同的外植體再生能力有很大的差異性，因此選擇合適的外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)是提高植株再生頻率的有效手段。目前在蕓薹屬植物上采用的外植體主要有子葉、帶柄子葉及下胚軸[9-15]。陳石頭等[4]在榨菜組織培養(yǎng)的研究中發(fā)現(xiàn)，榨菜子葉和帶柄子葉在不定芽誘導(dǎo)條件下，“浙桐1號(hào)”子葉再生芽分化頻率達(dá)到91.3%，帶柄子葉的不定芽再生率高達(dá)100%。沈進(jìn)娟等[5]也對(duì)此做了相關(guān)的研究，指出不同的外植體類(lèi)型誘導(dǎo)不定芽的分化差異較大，其中子葉和帶柄子葉分化率較高，帶柄子葉分化率最高，下胚軸在不同分化培養(yǎng)基中不定芽的分化率均偏低。張艷梅等[16]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，榨菜下胚軸愈傷組織的誘導(dǎo)率達(dá)90.0%，不定芽誘導(dǎo)率達(dá)92.2%。黃欣等[17]在擬南芥再生體系的研究中指出，用真葉誘導(dǎo)愈傷時(shí)，處于花期的真葉出愈能力稍快于處于營(yíng)養(yǎng)期的真葉。余小林等[1]在提高榨菜離體植株再生頻率的研究表明，不同外植體在適宜的培養(yǎng)基中的再生頻率差異明顯，其中下胚軸的不定芽再生頻率為最高，達(dá)到50%；子葉柄不定芽再生頻率為34.43%，帶柄子葉的不定芽再生頻率為16.67%，不定芽再生頻率最低的外植體是子葉，僅為33.33%。但就愈傷組織誘導(dǎo)頻率而言，誘導(dǎo)頻率最高的外植體卻為子葉柄，誘導(dǎo)頻率可達(dá)96.67%。

2.2外植體生理狀態(tài)

外植體的生理狀態(tài)對(duì)芥菜類(lèi)蔬菜離體再生及分化頻率也有很大影響，不同生長(zhǎng)期的無(wú)菌苗明顯影響外植體不定芽再生能力。一般情況下，幼嫩組織比老化組織具有較高的形態(tài)發(fā)生能力[18]。劉樂(lè)承等[19]在對(duì)蕓薹屬植物的研究中報(bào)道，以無(wú)菌苗的子葉、帶柄子葉和下胚軸等為外植體時(shí)，苗齡顯著影響芽再生頻率。陳石頭等[4]研究發(fā)現(xiàn)，子葉外植體的苗齡為4 d時(shí)分化能力最強(qiáng)，達(dá)到91.3%，隨著苗齡的增加，不定芽的分化頻率明顯降低；帶柄子葉則以5～6 d苗齡分化最佳，其中6 d苗齡的帶柄子葉，分化頻率高達(dá)100%。張艷梅等[16]在對(duì)榨菜下胚軸的再生體系的建立研究中指出，不同苗齡榨菜愈傷組織的誘導(dǎo)效果有顯著的差異，3 d苗齡榨菜幼苗的愈傷組織誘導(dǎo)率最低，4 d苗齡誘導(dǎo)率最高，達(dá)到90%，但其后隨著榨菜苗齡的增加，誘導(dǎo)率逐漸下降。

2.3外植體極性與接種方式

離體培養(yǎng)中外植體的極性影響在芥菜類(lèi)蔬菜中的研究報(bào)道較少。金波[20]認(rèn)為以下胚軸和花莖為外植體時(shí)，極性是影響芽再生的重要因素。一般認(rèn)為，近根端容易產(chǎn)生根，近芽端容易產(chǎn)生芽[19]。但李樹(shù)賢等[21]在結(jié)球甘藍(lán)上發(fā)現(xiàn)下胚軸不定芽的發(fā)生沒(méi)有明顯極性。

外植體的接種方式對(duì)芽的再生也有一定的影響。許多研究表明，插植較平放芽再生率要高[22-23]。朱麗華等[24]對(duì)大白菜下胚軸接種方式的研究表明，以近根端插入培養(yǎng)基的正插方式明顯有利于不定芽的再生。張艷梅等[16]在對(duì)榨菜下胚軸的研究中全部采用平放，在不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度的配比中，不定芽的最高誘導(dǎo)率為92.2%，不定根的最高誘導(dǎo)率為97.8%。

3培養(yǎng)基及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合濃度

3.1培養(yǎng)基

芥菜離體培養(yǎng)中常用的基本培養(yǎng)基為MS、B5。黃欣[17]在擬南芥的研究中選用B5培養(yǎng)基，在不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比下外植體均有愈傷組織形成。沈進(jìn)娟[5]選用B5和MS為基本培養(yǎng)基，探討不同基因型在不同培養(yǎng)基中誘導(dǎo)不定芽分化的差異，以B5培養(yǎng)基為分化培養(yǎng)基時(shí)，不同榨菜品種之間外植體不定芽分化率差異不大；以MS培養(yǎng)基為分化培養(yǎng)基時(shí)，不同榨菜品種之間外植體不定芽的分化率差異明顯，“藺市草腰子”和“郫縣榨菜”容易誘導(dǎo)不定芽，其中“藺市草腰子”的帶柄子葉不定芽分化率達(dá)到94.4%，“郫縣榨菜”的子葉不定芽分化率達(dá)到80.0%，而“永安小葉”不容易被誘導(dǎo)，其外植體的分化率較低。余小林等[1]以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，采用不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合來(lái)研究榨菜間接不定芽發(fā)生情況，建立了高效的榨菜離體培養(yǎng)再生體系。張艷梅等[16]的研究中選用MS培養(yǎng)基，其愈傷組織的誘導(dǎo)率達(dá)到了47.8%。孫全等[25]的研究中，也以MS培養(yǎng)基為主，在不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合中，外植體最大分化率達(dá)97%，成苗率最大值為73%以上。陳石頭等[4]研究中表明，以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，誘導(dǎo)榨菜子葉和帶柄子葉不定芽，浙桐1號(hào)榨菜子葉再生芽分化頻率達(dá)91.3%，帶柄子葉的不定芽再生率高達(dá)100%。

3.2生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑類(lèi)型及組合濃度

芥菜組織培養(yǎng)很難得到完全脫分化的愈傷組織，在沒(méi)有添加生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基中，其外植體只能生根而不能形成愈傷組織[26]。生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在植物組織培養(yǎng)中有著至關(guān)重要的作用，是誘導(dǎo)愈傷及植株再生的決定性因素，因此尋求適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)調(diào)節(jié)劑類(lèi)型及配比濃度是提高愈傷及芽再生頻率的重要途徑[19]。在芥菜的組織培養(yǎng)中最常用的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑有NAA、6-BA、2，4-D等。不同基因型品種以及外植體對(duì)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組成的要求有顯著差異。余小林等[1]在榨菜的研究中報(bào)道，在2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2，4-D的MS培養(yǎng)基中，榨菜愈傷組織誘導(dǎo)頻率和不定芽再生頻率均為最高，下胚軸、子葉柄、帶柄子葉、子葉等不同外植體在上述培養(yǎng)基中的再生頻率差異很大，分別為50%、34.43%、16.67%、33.33%。同時(shí)，在此生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度組合下，愈傷組織誘導(dǎo)頻率最高的外植體為子葉柄，誘導(dǎo)率達(dá)96.67%。使用1.5 mg/L CPPU+0.2 mg/L 2，4-D濃度配比的組合結(jié)果表明，不論是愈傷組織誘導(dǎo)還是不定芽的分化，均好于6-BA與2，4-D的組合，也最適合不定芽的分化，但不同的外植體類(lèi)型在此組合中的再生頻率是不一樣的，其中帶柄子葉外植體的再生頻率最高，達(dá)66.67%，子葉、子葉柄和下胚軸在以上組合中的不定芽再生頻率分別為36.67%、5%和1.67%。陳石頭等[4]使用6-BA與NAA的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合研究榨菜子葉及帶柄子葉的再生體系，認(rèn)為2 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA為子葉的最佳分化濃度。帶柄子葉的優(yōu)化培養(yǎng)基則為MS+2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA +5.0 mg/L AgNO3。張艷梅等[16]研究發(fā)現(xiàn)，6-BA與NAA、6-BA與2，4-D的配比組合，愈傷組織誘導(dǎo)的最佳生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比為0.5 mg/L 6-BA+0.8 mg/L NAA，不定芽誘導(dǎo)的最佳生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比為2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，不定根誘導(dǎo)的最佳生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比為0.2 mg/L NAA。沈進(jìn)娟[5]等的研究表明，分化培養(yǎng)基中添加2 mg/L 6-BA、0.2～0.4 mg/L NAA時(shí)，不定芽分化率最高。

4硝酸銀

Chi等[27-28]首先發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中添加硝酸銀顯著促進(jìn)大白菜、白菜和菜心的子葉再生率。硝酸銀作為一種乙烯抑制劑，能通過(guò)促進(jìn)多胺的合成提高體細(xì)胞胚胎和芽發(fā)生的頻率[29]。因此AgNO3在蕓薹屬植物組織培養(yǎng)中被廣泛運(yùn)用，濃度在4～10 mg/L可顯著增加不定芽的分化率[30-37]。陳石頭[4]認(rèn)為，添加5 mg/L AgNO3能促進(jìn)帶柄子葉的分化。沈進(jìn)娟[5]在分化培養(yǎng)基中也添加了5 mg/L AgNO3，認(rèn)為添加適宜的AgNO3更有利于不定芽分化。

5結(jié)束語(yǔ)

影響芥菜類(lèi)蔬菜作物離體再生的各種因素是相互作用的，通過(guò)選擇適宜的外植體類(lèi)型和最佳生理時(shí)期，改良培養(yǎng)基及優(yōu)化生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比，優(yōu)化培養(yǎng)條件及使用培養(yǎng)基添加物，綜合所有的因素進(jìn)行優(yōu)化，才能獲得高效的芥菜類(lèi)蔬菜離體培養(yǎng)再生體系。從總體研究來(lái)看，芥菜類(lèi)蔬菜離體再生系統(tǒng)仍不完善，再生頻率普遍不高，有關(guān)提高芥菜類(lèi)蔬菜離體再生頻率的研究仍需進(jìn)一步加強(qiáng)，以便為今后芥菜類(lèi)蔬菜新品種選育、遺傳轉(zhuǎn)化研究打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：丁志祥）