希金斯炭疽菌PITP生物信息學分析

摘要：以釀酒酵母中已經報道的5個典型PITP序列為基礎，對炭疽菌屬蛋白質數(shù)據庫進行Blastp比對以及關鍵詞搜索，并通過SMART保守結構域分析，明確該菌含有4個典型的PITP；同時，通過對上述氨基酸序列進行疏水性、細胞信號肽、跨膜區(qū)結構域、亞細胞定位以及二級結構等生物信息學分析，并與其他物種中15個同源序列進行遺傳關系比較分析，以期為深入開展希金斯炭疽菌（Colletotrichum higginsanum Sacc.）PITP的功能研究打下理論基礎，同時，也為進一步開展其他炭疽菌的研究提供重要的理論指導。

關鍵詞：希金斯炭疽菌（Colletotrichum higginsanum Sacc.）；磷脂酰肌醇轉移蛋白質；生物信息學分析；遺傳關系；炭疽菌屬

中圖分類號：Q81 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）03-0713-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.03.055

Bioinformatic Analysis on PITP in Colletotrichum higginsianum Sacc.

HAN Chang-zhi

（College of Forestry/Key Laboratory of Forest Disaster Warning and Control of Yunnan Province，Southwest Forestry University，Kunming 650224，China）

Abstract： Based on the five typical PITP sequences reported in Saccharomyces cerevisiae Sacc.， to search PITP related protein sequence from the protein databases of Colletotrichum spp. with the Blastp as well as the use of keywords， four typical PITP were identified by conserved domain analysis in the SMART online. Meanwhile， bioinformatic analysis were made including the hydrophobic， signal peptide， trans-membrane domain structure， sub-cellular location and the secondary structure in four PITP proteins. In addition， the analysis of genetic relationships through comparative four PITPs in C. higginsanum with other species of 15 homologous sequences can provide strong theoretical foundation for the function of PITP， and an important theoretical guidance to clarify the other pathogens in Colletotrichum spp.

Key words： Colletotrichum higginsanum Sacc.； PITP； bioinformatics analysis； genetic relationship； Colletotrichum spp.

希金斯炭疽菌（Colletotrichum higginsanum Sacc.）屬于炭疽菌屬真菌，其可以侵染如菜心、小油菜、結球甘藍、羽衣甘藍、大白菜、蘿卜等多種十字花科蔬菜作物而引起炭疽病，是一類重要的世界性植物真菌病害，現(xiàn)主要分布于美國、中國、日本以及印度等國[1-3]。在我國，由該病菌侵染菜心引起的炭疽病是菜心上最常見和發(fā)生最嚴重的病害之一[4]。該病害對廣東省菜心種植地區(qū)具有重要的影響，不僅降低了菜心的產量，對菜心的品質也產生了較大影響[5，6]。國內外對該病菌的研究主要集中在生物學特性、生防菌篩選以及遺傳轉化等方面[7，8]，同時，隨著該病菌基因組序列的釋放[9]，林春花等[10]對其開展了MAPK途徑相關基因的找尋及信號通路簡圖的繪制工作。

磷脂酰肌醇轉移蛋白質（Phosphatidylinositol transfer protein，PITP）是一類廣泛存在于真核生物細胞中具有一個疏水性強的水溶性蛋白質載體，其功能在于把一分子的脂類物質包裹在疏水腔內，使包裹的脂類物質遠離細胞質內水溶性的環(huán)境，從而實現(xiàn)脂類物質在不同膜間定向轉運[11]。該蛋白質通過參與調節(jié)脂類代謝途徑和胞內進程，從而在多個復雜的生理發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[12]。目前，認為在肌醇磷脂代謝途徑中發(fā)揮重要作用的有PITP-PLC（磷脂酶C）途徑、CDP（胞嘧啶核苷二磷酸）-膽堿生物合成途徑[13，14]。學術界對于植物中所含有的PITP有較多報道，如大豆、日本百脈根、擬南芥以及棉花等，而對于真菌PITP的研究報道較為少見。

本研究以釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae S288c）中已經報道的5個典型PITP氨基酸序列為基礎，通過在炭疽菌屬蛋白質數(shù)據庫中進行Blastp比對分析以及關鍵詞搜索，獲得與釀酒酵母PITP同源的C. higginsanum序列，并通過保守結構域分析、疏水性分析、二級結構預測等生物信息學分析，以期明確該菌中所存在的PITP數(shù)量、疏水性特點、結構特征以及細胞定位情況，同時，基于上述PITP氨基酸序列，在美國國家生物信息中心（NCBI）在線進行同源序列搜索，通過遺傳關系分析，以期為進一步開展其他炭疽菌中PITP的研究提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料

根據釀酒酵母中含有的5個PITP（Sec14、Pdr16、Pdr17、Sfh5和CSR1）氨基酸序列，利用炭疽菌屬蛋白質數(shù)據庫在線進行Blastp比對[15]，所有參數(shù)均選擇默認值，獲得C. higginsianum中所含有的典型PITP，同時，通過輸入“Phosphatidylinositol-transfer-protein”、“PITP”關鍵詞，在上述數(shù)據庫中進行PITP檢索；另外，利用NCBI明確該菌中PITP蛋白質登錄號信息（表1）。

1.2 方法

1.2.1 保守結構域預測 利用SMART網站在線分析PITP所具有的保守結構域特征。

1.2.2 蛋白質疏水性預測 利用Protscale程序[16]對PITP進行疏水性測定。

1.2.3 蛋白質轉運肽及信號肽預測 轉運肽的預測利用TargetP 1.1 Server進行在線分析[17]，信號肽預測則是利用SignalP 3.0 Server[18]進行在線分析。

1.2.4 蛋白質二級結構及跨膜區(qū)結構預測 對蛋白質二級結構預測采用PHD[19]進行在線分析。同時，對其PITP的跨膜區(qū)結構進行預測，利用TMHMM Server v. 2.0進行在線分析[18]。

1.2.5 亞細胞定位分析 對C. higginsianum中PITP進行亞細胞定位分析，利用ProtComp v.9.0進行在線分析[20]。

1.2.6 系統(tǒng)進化樹構建 在NCBI中，以C. higginsianum中所含PITP氨基酸序列為基礎，在線進行Blastp同源搜索，獲得來自不同物種的同源蛋白質序列。對所獲得的同源序列，利用Clustal X軟件[21]進行多重比對分析，隨后利用MEGA 5.2.2軟件[22]構建系統(tǒng)進化樹，采用鄰近法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，各分支之間的距離計算采用p-distance模型，系統(tǒng)可信度檢測采用自舉法重復1 000次進行。

2 結果與分析

2.1 希金斯炭疽菌含有4個典型的PITP

對釀酒酵母中典型的5個PITP進行SMART分析，明確上述PITP均具有SEC14保守域結構，除Sfh5外，其他4個還具有一個存在于氨基酸序列N端，且尚未知功能的CRAL_TRIO_N保守域結構，同時，上述典型PITP所含氨基酸的大小范圍為343～469 aa。

對炭疽菌屬進行Blastp比對分析，除Sec14、CSR1具有同源的序列外，其他3個（Pdr16、Pdr17、Sfh5）在希金斯炭疽菌中均沒有發(fā)現(xiàn)其同源序列。同時，結合關鍵詞搜索，結果表明，C. higginsianum中存在4個與酵母中PITP同源性較高序列，其ID分別為CH063_00815.1、CH063_06673.1、CH063_01014.1、CH063_10638.1。根據SMART保守域分析，結果顯示，上述4個蛋白質序列均含有典型PITP所具有的SEC14保守域（圖1），按照氨基酸長度，重新對上述希金斯炭疽菌中的典型PITP進行命名，分別為ChPITP1、ChPITP2以及ChPITP3、ChPITP4（表1）。

2.2 蛋白質疏水性預測

疏水性分析結果顯示，ChPITP1中位于291位的E，親水性最強，數(shù)值達到-1.995，而位于179位的D，親水性最弱，為0.921；ChPITP2中位于314、317位的Q、W，親水性最強，而位于248位的T，親水性最弱；ChPITP3中位于62位的T，親水性最強，而位于294位的W，親水性最弱；ChPITP4中位于66位的V，親水性最強，而位于255位A，其親水性最弱（表2，圖2）。同時，發(fā)現(xiàn)ChPITP1、ChPITP2、ChPITP3、ChPITP4這4個典型PITP盡管在親水性最強氨基酸殘基位置和數(shù)值、疏水性最強氨基酸殘基位置和數(shù)值、疏水性氨基酸殘基數(shù)值總和以及親水性氨基酸殘基數(shù)值總和等方面的結果不盡相同，但均屬于親水性蛋白質，這與通過理化性質分析中的GRAVY計算所得結果一致。

2.3 轉運肽及信號肽特征

通過分析，ChPITP1、ChPITP2、ChPITP3、ChPITP4具有分泌途徑信號肽的可能性最大，其預測值分別為0.948、0.961、0.854、0.924（表3）。經過SingnalP 3.0 Server在線分析，上述4個PITP均不含有明顯的信號肽序列。

2.4 二級結構及跨膜結構域預測

二級結構預測結果顯示，4個PITP均含有α螺旋、β折疊、無規(guī)卷曲等二級結構，其中，ChPITP1、ChPITP3、ChPITP4所含α螺旋比例較高，分別為49%、51%、46%，而在ChPITP2中，其所含無規(guī)卷曲結構所占比例較高，為44%；對于β折疊結構，ChPITP1、ChPITP2、ChPITP3、ChPITP4所含比例均較低（圖3）。

通過TMHMM Server v. 2.0在線分析，上述4個PITP均不含有典型的跨膜結構域，然而，通過二級結構預測發(fā)現(xiàn)ChPITP4在281到311位氨基酸之間存在一個跨膜結構域，兩者預測不同，有待于今后通過試驗進一步驗證。

2.5 亞細胞定位分析

通過ProtComp v. 9.0在線分析，結果表明，4個典型的PITP亞細胞定位情況不盡相同，其中，ChPITP1、ChPITP2定位于高爾基體中，而ChPITP3定位于線粒體上，ChPITP4定位于細胞質中（表4）。

2.6 遺傳關系

在NCBI中，通過對C. higginsianum 4個典型PITP序列進行Blastp搜索，分別獲得ChPITP1、ChPITP2、ChPITP3、ChPITP4的同源序列，選擇同源性較高的15條序列進行聚類分析，結果顯示，上述4個PITP與其各自同源序列分別聚在一起，而彼此之間并未聚在一起；就C. higginsianum中每一個PITP與其他物種同源序列之間的親緣關系而言，ChPITP1與禾谷炭疽菌中的EFQ27511.1、西瓜炭疽病菌中的ENH76666.1之間親緣關系較近；ChPITP2與大麗輪枝菌中的EGY17177.1、黑白輪枝菌中的XP003005673.1親緣關系較近；ChPITP3與C. graminicola中的EFQ29482.1之間的親緣關系較近；ChPITP4與C. graminicola中的EFQ30498.1之間的親緣關系較近（圖4），這與前期關于禾谷炭疽菌PITP的親緣關系研究所得結果一致[23]。

3 小結與討論

C. higginsanum可侵染菜心、白菜等眾多十字花科蔬菜引起炭疽病，不僅影響蔬菜的產量，也對其品質造成重要影響。深入開展該病菌的致病因子研究，有助于進一步開發(fā)以致病因子為作用靶標的防治藥劑。2012年，隨著該菌全基因組序列的釋放[9]，為學術界對其開展致病因子研究提供了便利條件。

目前，已經明確PITP參與真核生物體內眾多生理功能以及信號轉導過程，然而，對于真菌中PITP的報道尚不多見。本研究基于釀酒酵母中已經報道的5個典型PITP序列，在炭疽菌屬蛋白質數(shù)據庫中，利用Blastp比對以及關鍵詞搜索，同時，基于SMART保守域分析，共獲得C. higginsanum 4個典型的PITP。利用生物信息學分析，初步明確了上述4個典型PITP在細胞信號肽、疏水性、亞細胞定位、跨膜結構域以及二級結構等方面具有的特征，為深入解析C. higginsanum PITP的功能研究打下堅實基礎。與此相似，通過上述方法，也獲得了C. graminicola中含有3個PITP，并明確上述PITP具有的相關特征。在炭疽菌屬病菌中上述2種全基因組測序已經完成，而大多數(shù)危害農、林業(yè)生產的炭疽菌的全基因組測序尚未完成，因此，本研究基于C. higginsanum中典型PITP，通過遺傳關系比較分析，可為進一步開展其他炭疽菌屬真菌中PITP研究提供重要的理論指導。

參考文獻：

[1] 沈瑞清，張 萍，郭成瑾，等.寧夏炭疽菌屬真菌資源研究[J].河南農業(yè)科學，2012（5）：100-102，149.

[2] 梁惠凌，唐 輝.廣西常見花卉真菌性病害的防治[J].廣西園藝， 2002（2）：18-19.

[3] HYDE K， CAI L， CANNON P， et al. Colletotrichum-names in current use[J]. Fungal Diversity， 2009， 39： 147-182.

[4] 盧博彬，楊 暹.菜心炭疽病研究進展[J].長江蔬菜，2009（24）： 1-5.

[5] 張 華，周而勛，劉自珠，等.菜心炭疽病苗期抗病性鑒定技術[J].華南農業(yè)大學學報，1998（3）：50-53.

[6] 張 華，劉自珠，鄭巖松，等.菜心品種資源炭疽病抗性鑒定[J]. 廣東農業(yè)科學，2000（3）：47-49.

[7] 周而勛，楊 媚，張 華，等.菜心炭疽病菌菌絲生長、產孢和孢子萌發(fā)的影響因素[J].南京農業(yè)大學學報，2002，25（2）：47-51.

[8] 況福元，吳小麗，呂風青，等.菜心炭疽病菌拮抗細菌的篩選及鑒定[J].微生物學通報，2009（9）：1350-1355.

[9] O′CONNELL R J， THON M R， HACQUARD S， et al. Lifestyle transitions in plant pathogenic Colletotrichum fungi deciphered by genome and transcriptome analyses[J]. Nat Genet， 2012， 44（9）：1060-1065.

[10] 林春花，蔡志英，黃貴修.全基因組法繪制禾谷炭疽菌和希金斯炭疽菌中MAPK級聯(lián)信號途徑簡圖[J].熱帶作物學報，2012， 33（4）：674-680.

[11] HSUAN J， COCKCROFT S. The PITP family of phosphatidylinositol transfer proteins[J]. Genome Biol，2001，2（9）：3011-3018.

[12] COCKCROFT S. Phosphatidylinositol transfer proteins couple lipid transport to phosphoinositide synthesis[J]. Seminars in Cell & Developmental Biology，2001，12（2）：183-191.

[13] XIE Z G， FANG M， BANKAITIS V A. Evidence for an intrinsic toxicity of phosphatidylcholine to Sec14p-dependent protein transport from the yeast Golgi complex[J]. Molecular Biology of the cell，2001，12（4）：1117-1129.

[14] PHILLIPS S E， VINCENT P， RIZZIERI K E， et al. The diverse biological functions of phosphatidylinositol transfer proteins in eukaryotes[J]. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology，2006，41（1）：21-49.

[15] ALTSCHUL S F， MADDEN T L， SCHAFFER A A， et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST： A new generation of protein database search programs[J]. Nucleic Acids Res， 1997， 25（17）：3389-3402.

[16] WALKER J M. The Proteomics Protocols Handbook[M].Totowa：Humana Press Enc，2005.

[17] EMANUELSSON O， BRUNAK S， VON HEIJNE G， et al. Locating proteins in the cell using TargetP， SignalP and related tools[J]. Nature Protocols，2007，2（4）：953-971.

[18] BENDTSEN J D， NIELSEN H， VON HEIJNE G， et al. Improved prediction of signal peptides： SignalP 3.0[J]. Journal of Molecular Biology，2004，340（4）：783-795.

[19] KELLEY L A， STERNBERG M J. Protein structure prediction on the Web： A case study using the Phyre server[J]. Nat Protoc， 2009，4（3）：363-371.

[20] EMANUELSSON O， NIELSEN H， BRUNAK S， et al. Predicting subcellular localization of proteins based on their N-terminal amino acid sequence[J]. Journal of Molecular Biology， 2000， 300（4）： 1005-1016.

[21] THOMPSON J D， GIBSON T J， HIGGINS D G. Multiple sequence alignment using ClustalW and ClustalX[J]. Current Protocols in Bioinformatics，2002， DOI：10.1002/047 1250953.bi0203s00.

[22] TAMURA K， PETERSON D， PETERSON N， et al. MEGA5： Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood， evolutionary distance， and maximum parsimony methods[J]. Mol Biol Evol，2011，28（10）：2731-2739.

[23] 韓長志.禾谷炭疽菌磷脂酰肌醇轉移蛋白生物信息學分析[J]. 生物技術，2014（3）：39-43.