RP—HPLC法同時(shí)測定藏藥肋柱花中三種成分的含量

張召華等

摘要：建立了同時(shí)測定藏中當(dāng)藥黃素、當(dāng)藥醇苷、苦龍苷含量的方法。采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC），以Kromasil-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以甲醇（A）-0.04%磷酸溶液（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫，40%A（0 min）-63%A（20 min）；流速為0.8 mL/min；柱溫為30 ℃，檢測波長為254 nm。結(jié)果表明，在20 min內(nèi)完成對3種成分的分析，各成分之間均達(dá)到基線分離。當(dāng)藥黃素、當(dāng)藥醇苷、苦龍苷的線性范圍分別為：0.675 0～4.050 0 μg（R2=0.999 5）、0.005 5～0.330 0 μg（R2=0.999 5）、0.027 5～0.165 0 μg（R2=0.999 5），線性關(guān)系良好。平均加樣回收率（n=9）分別為99.90%、99.15%、99.88%。建立的HPLC分析方法簡單、準(zhǔn)確，能快速測定藏藥肋柱花中有效成分的含量。

關(guān)鍵詞：RP-HPLC；藥肋柱花（Lomatogonium rotatum（L.）Fries es Nym）；當(dāng)藥黃素；當(dāng)藥醇苷；苦龍苷

中圖分類號：O657.7+2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）03-0687-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.03.047

Content Analysis of Three Constituents in Tibetan Herb Lomatogonium rotatum （L.）Fries es Nym by RP-HPLC

ZHANG Zhao-hua1，ZENG Qing-yi2，3，LIN Peng-cheng2，3，ZHAO Ying2，3

（1.Qinghai Province Test Center， Xining 810007， China； 2.College of Chemistry and Life Science， Qinghai Nationality University， Xining 810007， China； 3.Key Laboratory of Plant Resources of Qinghai-Tibet Plateau in Chemical Research， Xining 810007， China）

Abstract： RP-HPLC was used to determine the content of swertisin， swertianolin， amarogerth in Tibetan herb. The sample was separated on the column of Kromasil-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm） eluted with methanol（A） and 0.04% phosphoric acid solution（B）. The initial condition was 40%A， then rose to 63% A in 20 min with detection wavelength at 254 nm， flow rate 0.8 mL/min， and column temperature 30 ℃. And three active constituents were base-isolated. The linear ranges of swertisin， swertianolin， amarogerth， were 0.675 0～4.050 0 μg（R2=0.999 5）， 0.005 5～0.330 0 μg（R2=0.999 5）， and 0.027 5～0.165 0 μg（R2=0.999 5）respectively； the average recoveries（n=9） were 99.90%， 99.15% and 99.88% respectively. The method was easy and precise which can be used for content analysis of active constituents in Lomatogonium rotatum （L.）Fries es Nym rapidly.

Key words： RP-HPLC； Lomatogonium rotatum（L.）Fries es Nym； swertisin； swertianolin； amarogerth

肋柱花（Lomatogonium rotatum（L.）Fries es Nym）是一種傳統(tǒng)藏蒙醫(yī)（蒙藥名為哈比日跟—地格達(dá)），是龍膽科植物輻花肋柱花的干燥全草。味苦，性寒、鈍、糙、輕、燥。用于“協(xié)日”熱、瘟疫、流感、傷寒、中暑頭熱、肝膽熱、黃疸、胃“協(xié)日”、傷熱等癥狀[1，2]。肋柱花為歐亞大陸及北美洲間斷分布，全世界已發(fā)現(xiàn)的有18種，其中16種集中分布在中國西部喜馬拉雅山-克什米爾地區(qū)，僅兩種分布于歐亞大陸及北美，并直達(dá)北極地區(qū)。在中國分布于黑龍江、遼寧、內(nèi)蒙古、河北、陜西、甘肅、新疆、青海等地。生于海拔4 200 m以下的山坡，草坡及灌木叢中[3-7]。

當(dāng)藥黃素對四氯化碳引起的轉(zhuǎn)氨酶升高有抑制作用。當(dāng)藥醇苷主要功能是減輕肝細(xì)胞的損傷，有效抑制炎癥介質(zhì)（腫瘤壞死因子）的形成，減輕細(xì)胞間質(zhì)的炎性反應(yīng)，促進(jìn)受損肝細(xì)胞的修復(fù)?？帻堒帐驱埬憣僦参锏闹饕辔冻煞郑Ｓ米骺辔冻煞諿8]。目前有關(guān)輻花肋柱花這3種成分檢測的文獻(xiàn)報(bào)道較少[9]；本研究利用RP-HPLC測定肋柱花中當(dāng)藥黃素、當(dāng)藥醇苷、苦龍苷的含量，對評價(jià)藥材質(zhì)量及新藥源的研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料 輻花肋柱花由中國科學(xué)院西北高原生物研究所胡鳳祖教授鑒定并提供，陰干后粉碎過100目篩，冷藏保存。甲醇（色譜純，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司禹城化工廠）；磷酸（分析純，北京紅星化工廠）。當(dāng)藥黃素、當(dāng)藥醇苷、苦龍苷為課題組分離鑒定，純度大于98%。

1.1.2 儀器 Agilent1100型高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司），配置手動(dòng)進(jìn)樣器、在線脫氣機(jī)、高壓二元梯度泵、恒溫柱溫箱、DAD檢測器、Agilent1100色譜工作站、Kromasil-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；AG204型電子分析天平（南京安鐸貿(mào)易有限責(zé)任公司）；SHB-Ⅱ型循環(huán)水式多用真空泵（上海科興儀器有限公司）；EYEL4型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本東京理化器械株式會社）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Kromasil-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）柱；流動(dòng)相：甲醇和0.04%磷酸溶液，在0～20 min內(nèi)由40∶60至63∶27（V/V）；流速為0.8 mL/min；檢測波長為254 nm；柱溫為30 ℃。該色譜條件下當(dāng)藥黃素、當(dāng)藥醇苷、苦龍苷3種成分均被洗脫且達(dá)到基線分離，保留時(shí)間分別為10.40、14.30、15.86 min（圖1）。

1.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取對照品當(dāng)藥黃素0.27 mg溶于1 mL甲醇配成0.27 mg/mL、當(dāng)藥醇苷0.22 mg 溶于1 mL配成0.22 mg/mL、苦龍苷0.22 mg溶于1 mL甲醇配成0.22 mg/mL，使用時(shí)稀釋成所需濃度。

1.2.3 供試溶液的制備 分別精密稱取粉碎至100目的樣品0.1 g兩份，一份加入甲醇10 mL，超聲連續(xù)提取兩次（1.0，0.5 h），合并提取液定容至25 mL；另一份加入甲醇10 mL，熱回流連續(xù)提取兩次（1.0，0.5 h），合并提取液定容至25 mL。過0.45 μm濾膜，在選定色譜條件下測定有效成分的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系考察

精密量取3種對照品儲備液，當(dāng)藥黃素：濃度為0.27 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品分別以質(zhì)量為0.675、1.350、2.025、2.700、3.375、4.050 μg進(jìn)樣。當(dāng)藥醇苷：濃度為0.22 mg/mL稀釋至0.002 2 mg/mL，分別以質(zhì)量為0.005 5、0.011 0、0.016 5、0.027 5、0.330 0 μg進(jìn)樣。苦龍苷： 濃度 0.22 mg/mL稀釋20倍至0.011 mg/mL，分別以質(zhì)量為0.027 5、0.055 0、0.082 5、0.110 0、0.138 0、0.165 0 μg進(jìn)樣。以含量（x）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（y）為縱坐標(biāo)，繪制3個(gè)成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別求得上述3個(gè)組分的回歸方程，見表1。

2.2 檢測限

在選定的色譜條件下，當(dāng)S/N=3時(shí)，對各組分最低檢測限進(jìn)行測定，結(jié)果表明，當(dāng)藥黃素、當(dāng)藥醇苷、苦龍苷的最低檢測限分別為0.27、0.44、0.50 ng。

2.3 精密度考察

取濃度為0.27 mg/mL當(dāng)藥黃素、0.011 mg/mL當(dāng)藥醇苷、0.002 2 mg/mL苦龍苷混合對照品溶液，在選定的色譜條件下測定色譜峰的峰面積，計(jì)算得RSD分別為0.72%、0.90%、0.93%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性考察

精密稱取肋柱花樣品0.1 g，按“1.2.3”的方法操作，分別在0、2、4、6、12、16 h時(shí)分別進(jìn)樣，測定當(dāng)藥黃素、當(dāng)藥醇苷、苦龍苷的峰面積，計(jì)算得RSD分別為1.4%、1.8%、1.0%（n=5）。表明樣品溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取肋柱花樣品0.1 g共6份，按“1.2.3”的方法操作，在選定的色譜條件下測定當(dāng)藥黃素、當(dāng)藥醇苷、苦龍苷的含量，計(jì)算得RSD分別為2.4%、1.4%、2.0%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.6 回收率試驗(yàn)

精密稱取已測知含量的肋柱花樣品0.1 g共9份，分為3組，每組3份，分別添加低、中、高3種濃度的對照品，按“1.2.3”項(xiàng)下操作，測得當(dāng)藥黃素平均回收率為99.90%，RSD為0.42%；當(dāng)藥醇苷平均回收率為99.15%，RSD為0.73%；苦龍苷平均回收率為99.88%，RSD為0.11%，見表2。

2.7 樣品測定

按“1.2.3”的方法制備的青藏高原輻花肋柱花樣品，以“1.2.1”的色譜條件進(jìn)行分析，以峰面積為標(biāo)法計(jì)算青藏高原輻花肋柱花中當(dāng)藥黃素、當(dāng)藥醇苷、苦龍苷的含量分別為0.021 7、0.016 1、0.044 2 mg/g。

3 小結(jié)與討論

利用DAD檢測器在190～400 nm內(nèi)掃描3種成分的紫外吸收曲線，吸收曲線顯示3種活性成分的甲醇溶液在254 nm波長處有較高的吸收，故確定波長254 nm為檢測波長。對不同流速（0.7、0.8、1.0 mL/min）及不同柱溫（25、30、35、40 ℃）進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)柱溫30 ℃、流速在0.8 mL/min時(shí)3種待測成分均可與其他組分達(dá)到基線分離，且分析時(shí)間較短。參照文獻(xiàn)[10]，比較了不同提取時(shí)間（15、30、45、60 min）對提取率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)30 min即可將有效成分提取完全。精密稱取肋柱花樣品0.1 g共8份，每4份為一組，分別用甲醇超聲和加熱回流處理，測定不同提取次數(shù)下上述各有效成分的含量。結(jié)果表明，熱提取3次以及超聲提取2次以后，繼續(xù)增加提取次數(shù)對提取率已無明顯影響，但超聲次數(shù)少，提取率比熱回流提取法略高，故本試驗(yàn)采用超聲提取法。用甲醇-水、甲醇-0.04%磷酸水溶液，結(jié)果顯示甲醇-0.04%磷酸溶液做流動(dòng)相時(shí)樣品中3種成分分離效果及峰形均較好。因此該方法具有提取、分析方法簡便、快速、結(jié)果準(zhǔn)確可靠等特點(diǎn)，對全面評價(jià)藥物質(zhì)量及新藥的研究有重要的作用。

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