云南紅豆杉莖灰斑病病原菌分離鑒定和生物學(xué)特性研究

謝美華等

摘要：對(duì)紅豆杉（Taxus yunnanensis Cheng et Lu）莖灰斑病進(jìn)行病原鑒定，并研究其生物學(xué)特性和殺菌劑對(duì)其抑制作用。結(jié)果表明，該病原菌為擬莖點(diǎn)霉屬真菌；該病原菌最適宜生長(zhǎng)的碳源為甘油，氮源為硝酸銨。菌絲適宜生長(zhǎng)的溫度范圍較窄，25～28 ℃ 菌絲生長(zhǎng)良好，分生孢子在32 ℃時(shí)萌發(fā)率最高；菌絲適宜生長(zhǎng)的pH范圍均較廣，分生孢子萌發(fā)率較高，菌絲適宜生長(zhǎng)的pH為6.0～7.0，弱酸性更利于孢子萌發(fā)；光周期對(duì)菌落生長(zhǎng)和分子孢子萌發(fā)的影響都不大。供試的殺菌劑中以代森錳鋅的抑菌效果最好。

關(guān)鍵詞：云南紅豆杉（Taxus yunnanensis Cheng et Lu）；莖灰斑病；病原鑒定；生物學(xué)特性

中圖分類(lèi)號(hào)：S718.81 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）03-0608-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.03.025

Pathogen Identification and Biological Characterstics of the Stem Spot

of Taxus yunnanensis

XIE Mei-hua1，LI lin2，LI Xue-lin1，YANG Hai-yan1，CHEN Hua-hong1，WANG Zhen-ji1，F(xiàn)AN Shu-guo1

（1. Department of Chemistry and Life Science， Chuxiong Normal University， Chuxiong 675000， Yunnan， China；2. Information Center，Chuxiong Pharmaceutical College/Key University Applied Biology Laboratory of Yunnan，Chuxiong 675000， Yunnan ， China）

Abstract： Pathogen of stem spot of Taxus yunnanensis Cheng et Lu was identified. Its biological characteristics and inhibition of germicides was studied. The results showed that the pathogen was Phomopsis sp. The best carbon and nitrogen source for hongdoushan 1 mycelial growth was glycerin and ammonium nitrate， respectively. The optimal temperature for mycelial growth and spore germination were 28 ℃ and 32 ℃， respectively. Light and dark alternative had little influence on mycelial growth and spore germination. In laboratory test， mancozeb was the best getrmicides on the tested.

Key words： Taxus yunnanensis Cheng et Lu； stem spot； pathogen identification； biological characterstics

云南紅豆杉（Taxus yunnanensis Cheng et Lu）又名紫杉、赤柏松，屬紅豆杉科喬木，產(chǎn)于云南西北部及西部、四川西南部與西藏東部[1]。主要生長(zhǎng)在山坡、針闊混交林中。云南紅豆杉的莖皮中富含具有抗癌活性成分的紫杉醇，由此使得紅豆杉身價(jià)急劇上升。自然環(huán)境中的紅豆杉資源非常稀缺，所以目前紅豆杉已被大面積的人工栽培。圍繞云南紅豆杉的研究主要集中在浸種育苗、扦插栽培、內(nèi)生真菌研究等方面，而對(duì)于云南紅豆杉大面積栽培引起病害大量滋生及病害如何防治的方面[2-7]鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究選取紅豆杉莖皮灰斑病的病斑，進(jìn)行該病害病原的分離鑒定和生物學(xué)特性研究，以期為云南紅豆杉病害控制和防治提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病原菌分離

云南紅豆杉莖灰斑病莖皮采自楚雄師范學(xué)院內(nèi)，用組織分離法進(jìn)行病原菌株分離，經(jīng)柯赫氏法則鑒定其為云南紅豆杉莖灰斑病的病原，菌株編號(hào)為hongdoushan01。

1.2 病原菌鑒定

1.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定 經(jīng)純化分離得到病原菌，利用顯微鏡進(jìn)行觀(guān)察，對(duì)其進(jìn)行形態(tài)鑒定。

1.2.2 病原茵rDNA-ITS序列擴(kuò)增和分析 用CTAB法提取病原菌全基因組DNA，進(jìn)行ITS-PCR擴(kuò)增。引物序列為ITS4：5-TCCTCCGCTTATTGAT

ATGC-3；ITS5：5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAG

G-3。PCR反應(yīng)體系總體積25 μL，反應(yīng)各成分終濃度為：Taq酶0.02 U/μL；引物0.4 μmol/L；DNA 模板20 ng/μL；dNTPs 0.4 μmol/L；2×PCR反應(yīng)緩沖液。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性95 ℃，3 min；變性94 ℃，30 s，退火52 ℃，45 s， 復(fù)性72 ℃，45 s，30個(gè)循環(huán)；延伸72 ℃，10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物送北京百泰克生物技術(shù)有限公司測(cè)序，所得序列在NCBI上比對(duì)，下載與其相似性較高的序列及其近似屬的序列，用BioEdit、Clustal x和MEGA 4.1軟件采用NJ法進(jìn)行系統(tǒng)分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.3 生物學(xué)特性研究[8，9]

1.3.1 不同碳源和氮源對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響 以察氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以葡萄糖、甘油、D-果糖、D-半乳糖、乳糖、可溶性淀粉等量取代其碳源；分別以硫酸銨、硝酸銨、甘氨酸、L-苯丙氨酸、牛肉膏、蛋白胨取代氮源。每種培養(yǎng)基中分別接種直徑為5 mm的菌塊，25 ℃恒溫暗室培養(yǎng)，5 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.3.2 不同溫度對(duì)菌落和分子孢子萌發(fā)的影響 取直徑為5 mm的菌塊接種于察氏培養(yǎng)基中央，分別在5、10、15、20、25、28、30、32、35、40、45 ℃暗室下恒溫培養(yǎng)，5 d后測(cè)量菌落直徑。用無(wú)菌水制備菌懸液，滴于載玻片上，培養(yǎng)條件同菌落培養(yǎng)，24 h后鏡檢孢子萌發(fā)率，每次檢100個(gè)孢子。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.3.3 不同pH對(duì)菌落和孢子萌發(fā)的影響 將高壓滅菌后的察氏培養(yǎng)基pH分別調(diào)為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、10.9，倒平板，取直徑5 mm的菌塊接種于察氏培養(yǎng)基中央，黑暗條件下25 ℃培養(yǎng)5 d后測(cè)量菌落直徑。用0.2 mol/L磷酸氫二鈉和0.2 mol/L檸檬酸緩沖液將分生孢子懸浮液pH調(diào)配為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、10.9，置于25 ℃恒溫箱暗室培養(yǎng)，24 h后鏡檢萌發(fā)率，每次檢100個(gè)孢子。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.3.4 不同光照處理 取直徑為5 mm的菌塊接種于察氏培養(yǎng)基中央，分別置于24 h光照、12 h/12 h光暗交替，25 ℃培養(yǎng)5 d后測(cè)量菌落直徑。用無(wú)菌水制備菌懸液，滴于載玻片上，培養(yǎng)條件同菌落培養(yǎng)，24 h后鏡檢孢子萌發(fā)率，每次鏡檢100個(gè)孢子。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.4 不同殺菌劑對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響

將代森錳鋅、百菌清、敵克松、惡霜錳鋅和撲海因用無(wú)菌水按其常用倍數(shù)稀釋?zhuān)?0 mL培養(yǎng)基中加入1 mL藥液制成含藥液的平板，對(duì)照組加入等量無(wú)菌水。取5 mm菌塊置于察氏培養(yǎng)基平板中央，25 ℃暗室培養(yǎng)5 d后測(cè)量菌落直徑。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 云南紅豆杉病原菌的鑒定

2.1.1 形態(tài)學(xué)鑒定 該病主要發(fā)生在莖部，發(fā)病初期莖皮部出現(xiàn)黑色病斑或病塊，病情嚴(yán)重時(shí)，病塊可延伸至整株植物的莖。在PDA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)第3天菌落直徑2 cm ，不規(guī)則，不透明；菌絲深褐色、絮狀、短，外周為白色絮狀極短菌絲，背面深褐色，外周為白色；菌絲生長(zhǎng)較慢，28 ℃培養(yǎng)第7天菌落直徑為5 cm；培養(yǎng)第15天長(zhǎng)滿(mǎn)全皿，培養(yǎng)基正面不均勻分布黑色小圓點(diǎn)，背面出現(xiàn)少量小黑點(diǎn)；培養(yǎng)第20天，正面有黏稠的分泌物出現(xiàn)（圖1）。分生孢子座為真子座，埋生或半埋生，后暴露，黑色，球形或不規(guī)則形，分散或合生，含單腔、多腔，腔壁厚，周邊顏色深，無(wú)孔口，孢子團(tuán)沖破上壁而開(kāi)裂；分生孢子梗缺；產(chǎn)孢細(xì)胞無(wú)色至淡褐色，安瓿瓶狀，內(nèi)壁芽生瓶體式產(chǎn)孢，產(chǎn)孢口寬，圍領(lǐng)及平周加厚不明顯；分生孢子無(wú)色，單胞，橢圓形，光滑，大小2.5～5.3 μm×3.2～4.9 μm（平均3.6 μm×4.2 μm）（圖2與圖3）。

2.1.2 病原菌rDNA-ITS序列分析 將云南紅豆杉01菌株的5.8S rDNA-ITS序列在NCBI里進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果顯示hongdoushan01與Diaporthe eres、Phomopsis amygdali、Phomopsis sp.、Phomopsis vaccinii、Phomopsis magnoliae和Phomopsis juglandina同源性最高，下載它們的序列，以Phoma sp.和Phoma schachtii為外群，用BioEdit、Clustal x和MEGA 4.1軟件采用NJ法進(jìn)行系統(tǒng)分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果顯示與其遺傳距離較近的有6個(gè)種，屬內(nèi)節(jié)點(diǎn)支持率為0.99，結(jié)合其形態(tài)特征的觀(guān)察研究，供試菌株hongdoushan01為擬莖點(diǎn)霉屬（Phomopsis sp.）。

2.2 不同氮源和碳源對(duì)hongdoushan01菌落生長(zhǎng)的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌對(duì)供試的7種氮源和碳源均能利用，菌落在不同氮源和碳源培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度有明顯差異。最適該菌生長(zhǎng)的氮源是硝酸銨，其在1%差異水平與甘氨酸、硝酸鈉作氮源達(dá)到極顯著差異，與硫酸銨、牛肉膏和蛋白胨作氮源在5%差異水平達(dá)到顯著差異。最適該菌生長(zhǎng)的的碳源是甘油，在5%差異水平與葡萄糖、D-果糖、可溶性淀粉和蔗糖達(dá)到顯著差異，在1%差異水平與D-半乳糖與乳糖達(dá)到極顯著差異（見(jiàn)表1）。

2.3 不同光照對(duì)hongdoushan01菌株生長(zhǎng)的影響

通過(guò)24 h光照，12 h/12 h光/暗交替、無(wú)光照培養(yǎng)，結(jié)果表明（表2），有無(wú)光照對(duì)菌落的生長(zhǎng)和分生孢子萌發(fā)的影響差異不顯著。

2.4 不同溫度對(duì)hongdoushan01菌落生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，該病原菌在15～30 ℃范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)，最適的生長(zhǎng)溫度是28 ℃，與20、25和30 ℃在5%水平存在顯著差異，與其他處理在1%顯著水平達(dá)到極顯著差異；該病原菌在5、10、32、35、40、45 ℃條件下停止生長(zhǎng)。該病原菌孢子在5～40 ℃范圍內(nèi)均能萌發(fā)，最適萌發(fā)溫度為32 ℃，高于40 ℃孢子無(wú)法萌發(fā)，與20、25、28、35 ℃在5%水平存在顯著差異，與其他處理在1%水平顯著水平達(dá)到極顯著差異（表3）。

2.5 不同pH對(duì)hongdoushan01菌落生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，菌絲和分生孢子萌發(fā)適應(yīng)的pH值范圍較廣，在pH 2.5～10.9之間均能生長(zhǎng)和萌發(fā)。該菌菌絲在酸性條件下生長(zhǎng)較好，在堿性條件下生長(zhǎng)緩慢；該菌生長(zhǎng)最適宜的pH為7.0，與pH為3.0～6.0處理差異不明顯，與pH為8.0～10.9處理在5%水平存在顯著差異。當(dāng)pH 6.0時(shí)孢子萌發(fā)率最高，pH 6.0時(shí)的孢子萌發(fā)率與pH 4.0、5.0、7.0和9.0時(shí)孢子萌發(fā)率在5%水平存在顯著差異，與其它處理達(dá)到極顯著差異（表4）。

2.6 不同殺菌劑對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照相比，5種廣譜殺菌劑對(duì)該菌的生長(zhǎng)均有抑制作用（圖5）。代森錳鋅對(duì)該菌的抑制效果最好，隨后依次是百菌清、撲海因、惡霜錳鋅，效果最差的是敵克松。代森錳鋅的抑菌效果在5%差異水平與撲海因、百菌清達(dá)到差異顯著，與敵克松和惡霜錳鋅在1%水平達(dá)到極顯著差異。

3 小結(jié)與討論

3.1 病原菌的分離鑒定

自然分布的云南紅豆杉原先主要生長(zhǎng)在深山中，由于具有抗癌活性的紫杉醇的發(fā)現(xiàn)，使云南紅豆杉的藥用價(jià)值得以認(rèn)識(shí)，目前已有很多地方進(jìn)行大面積栽培。大面積栽培使病害發(fā)生嚴(yán)重，而目前還未見(jiàn)對(duì)云南紅豆杉莖灰斑病病原菌的報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)云南紅豆杉莖灰斑病病原菌進(jìn)行分離純化，利用形態(tài)學(xué)特征觀(guān)察并結(jié)合分子生物學(xué)手段進(jìn)行分析鑒定[10，11]，結(jié)果表明，兩者的鑒定結(jié)果相互吻合一致，初步推測(cè)病原菌為擬莖點(diǎn)霉屬真菌。

3.2 病原菌生物學(xué)特性研究

本研究結(jié)果表明，該菌對(duì)供試的7種氮源和碳源均能利用，菌落在不同氮源和碳源培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度有明顯差異，最適該菌生長(zhǎng)的的氮源是硝酸銨，最適該菌生長(zhǎng)的碳源是甘油。該病原菌在15～30 ℃范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)，最適的生長(zhǎng)溫度是28 ℃，在5、10和32℃及以上溫度條件下停止生長(zhǎng)；該病原菌孢子在5～40 ℃范圍內(nèi)均能萌發(fā)，高于40 ℃孢子無(wú)法萌發(fā)； 有無(wú)光照對(duì)菌落生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)無(wú)顯著影響；菌絲和分生孢子萌發(fā)適應(yīng)的pH范圍較廣，偏酸的條件下對(duì)菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)較好，孢子萌發(fā)最適宜的pH為6.0。

3.3 廣譜殺菌劑對(duì)該菌生長(zhǎng)的影響

在本研究中5種廣譜殺菌劑對(duì)該菌落的生長(zhǎng)均有抑制作用。代森錳鋅對(duì)該菌的抑制效果最好，隨后依次是百菌清、撲海因、惡霜錳鋅，效果最差的是敵克松。該菌的生物學(xué)特性研究都是在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，相對(duì)于大田種植時(shí)復(fù)雜的生長(zhǎng)環(huán)境，實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境相對(duì)單一。因此，要確定該病害的生物學(xué)特性，哪一種殺菌劑對(duì)該菌的抑制作用最好，還有待進(jìn)一步的大田試驗(yàn)研究。

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