角鯊烯的來(lái)源及其制備方法研究進(jìn)展

王寶琴，任麗麗

（1.濱州學(xué)院 山東省黃河三角洲野生植物資源開發(fā)利用工程技術(shù)研究中心，山東濱州256600；2.濱州學(xué)院濱州市食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濱州256600）

角鯊烯（Squalene），又稱三十碳六烯，或 2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯。角鯊烯是由6個(gè)異戊二烯單位構(gòu)成的不飽和脂肪烯烴，分子式為C30H50，含6個(gè)全反式雙鍵的開鏈三萜物質(zhì)。角鯊烯成品為微黃色至無(wú)色透明油狀液體，略帶特有的芳香味。因其具有極強(qiáng)的抗氧化、抗菌和抗紫外線輻射等活性而備受關(guān)注。

1 角鯊烯生物活性及其應(yīng)用

1906年，Mitsumaru Tsujirnoto首先發(fā)現(xiàn)角鯊烯大量存在于深海鯊魚的肝臟中[1]。1929年，Heilbron等初步揭示了角鯊烯的結(jié)構(gòu)組成[2]。1953年，Langdon RG等發(fā)現(xiàn)角鯊烯存在于人體的皮脂中，此發(fā)現(xiàn)將角鯊烯和化妝品緊密聯(lián)系起來(lái)[3]。小鼠靜脈注射和口服角鯊烯實(shí)驗(yàn)表明其LD50分別為1 800 mg/kg和5 000 mg/kg[4]，根據(jù)外來(lái)化合物毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，屬實(shí)際無(wú)毒物質(zhì)。

角鯊烯是所有細(xì)胞中甾醇的前體，是一種非常重要的功能油脂[5]，具有極強(qiáng)的抗氧化[6]、清除自由基作用[7]。角鯊烯具有類似紅細(xì)胞的攝氧功能，可生成活化的氧化角鯊烯，由血液循環(huán)輸送到機(jī)體組織后釋放出氧，從而增強(qiáng)機(jī)體組織對(duì)氧的利用能力。同時(shí)，角鯊烯具有滲透、擴(kuò)散和殺菌作用，人體皮膚分泌物中的角鯊烯和甾醇可維護(hù)皮膚柔軟滑潤(rùn)。此外，研究表明角鯊烯對(duì)高血壓、糖尿病、冠心病及癌癥具有治療作用，對(duì)乙型肝炎陰轉(zhuǎn)率優(yōu)于通用的保肝藥物[7-8]。尤其是角鯊烯具有抵御紫外線傷害的功能，而常被大量用于護(hù)膚品中[9]。角鯊烯乳液被大量應(yīng)用于疫苗和藥物載體[10]。最新研究表明，角鯊烯與抗腫瘤藥物阿霉素（squalenoyl doxorubicin，SQ-Dox）的納米裝配技術(shù)可以提高腫瘤細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性，并且可降低心臟毒性，在抗腫瘤治療中有顯著的改善效果[11]。角鯊烯有很低的凝固點(diǎn)（-72℃）和較高的沸點(diǎn)（350℃左右），有很好的抗熱和抗摩擦性，也被用來(lái)制作高級(jí)潤(rùn)滑油和精密科學(xué)儀器的潤(rùn)滑劑[12]。

2 角鯊烯來(lái)源及自然分布

目前，角鯊烯的主要來(lái)源和最重要的自然分布仍然是深海鯊魚的肝油，因?yàn)轷忯~肝的出油率高且角鯊烯的含量豐富，可達(dá)50%以上。但是，并非所有深海鯊魚的肝油中都存在角鯊烯，不同品種鯊魚肝油的比重具有較大差異，15℃條件下比重大于0.9的鯊魚肝油中一般不含角鯊烯[1]。人類皮膚脂肪中大約有12%的角鯊烯，這也是皮膚能夠抵御紫外線侵襲的重要原因[3]。

大量研究證明，自然界中還有部分角鯊烯存在于橄欖油、棕櫚油、麥胚油和酵母中。能形成角鯊烯規(guī)模生產(chǎn)的原料為橄欖油和棕櫚油，其中角鯊烯含量均達(dá)到1.16%以上，而且可利用油脂的副產(chǎn)物如脫臭熘出物和渣油為原料獲得純度較高的角鯊烯，并大幅降低制造成本。新發(fā)現(xiàn)的角鯊烯來(lái)源以植物為主，羅漢果種仁出油率51.5%，其油脂和渣油中角鯊烯含量分別達(dá)4.4%和0.34%，其他如省沽油、糯米香茶、梅樹、欖仁樹、尾巨桉等均可成為制取角鯊烯的原料而成為新熱點(diǎn)。近年發(fā)現(xiàn)莧屬植物中也含一定量的角鯊烯，不僅存在于種子油中，其他組織中也有分布[13]。2011年，古巴學(xué)者報(bào)道了從用于治療多種疾病的熱淤泥中分離鑒定了50多種活性物質(zhì)，其中就有角鯊烯[14]。

另外，可從微生物如面包酵母和圓孢酵母油脂中分離純化角鯊烯[15]。筆者從啤酒工業(yè)廢棄酵母提取物中發(fā)現(xiàn)三萜烯占精制酵母油脂總量的37.74%，制備的角鯊烯含量達(dá)2.01g/100 g（以干酵母計(jì)）。利用廢棄酵母獲取角鯊烯，不僅提高了廢棄酵母的附加值，且綜合利用解決了廢棄物的環(huán)保問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)循環(huán)經(jīng)濟(jì)[16]。對(duì)酵母進(jìn)行基因改造后使其中合成角鯊烯相關(guān)的酶高效表達(dá)，以提高發(fā)酵過(guò)程中角鯊烯的產(chǎn)量將成為新的研究熱點(diǎn)。

3 角鯊烯制備方法

3.1 動(dòng)物來(lái)源的角鯊烯

傳統(tǒng)制備角鯊烯的方法是通過(guò)蒸餾獲得鯊魚肝油濃縮液或?qū)Ω斡瓦M(jìn)行皂化再進(jìn)行減壓蒸餾、脫酸，與鈉鹽減壓蒸餾或?qū)⒀趸蜾寤鼗‵arnesyl）用金屬鎂或金屬鈣縮合等方法，最后采用溶劑（乙醇）處理，經(jīng)減壓蒸餾，得到角鯊烯精制品[17]。

Owen等在實(shí)驗(yàn)室和中試規(guī)模上采用超臨界CO2對(duì)鯊魚肝油進(jìn)行了連續(xù)提取。鯊魚肝油含50%角鯊烯，是萃取回收的主要成分，另一種主要成分甘油三酯以抽余油的形式回收，而姥鮫烷，是萃取回收液流的第二主要成分。超臨界CO2萃取的分離效果取決于溫度、壓力、油對(duì)CO2流速比率、物料裝填高度和回流比率等。壓力、溫度、原料油中角鯊烯的濃度決定油在CO2中的負(fù)載量，油對(duì)CO2的比率決定角鯊烯在兩個(gè)回收液流中和抽余油中的濃度。油的流速與角鯊烯流速之比，要求剛好達(dá)到使CO2飽和，這對(duì)CO2攜帶量和終產(chǎn)品的組成是非常重要的參數(shù)。在250 bar（25 MPa）和333 K（約60℃）的分離條件下，中試試驗(yàn)中應(yīng)用回流，能將產(chǎn)品回收液流中的角鯊烯含量從92%（質(zhì)量比）提高到 99%（質(zhì)量比）[18]。

3.2 植物來(lái)源的角鯊烯

3.2.1 植物油副產(chǎn)物中提取

專利CN101597204A中以橄欖油為原料提取高純度角鯊烯，采用二級(jí)分子蒸餾和硅膠柱色譜法形成的工藝路線，可將橄欖油中角鯊烯的含量從3.6%提高到98%左右，實(shí)現(xiàn)以橄欖油為原料大規(guī)模生產(chǎn)角鯊烯[19]。專利CN1849331A公開了自植物油副產(chǎn)品回收植物脂質(zhì)組合物的方法。產(chǎn)生的植物脂質(zhì)組合物包含角鯊烯、植物甾醇、混合生育酚和植物蠟，可用作潤(rùn)膚劑。其步驟包括：（1）在170℃～320℃的溫度和13.33 Pa～4 665.5 Pa的壓力下，蒸餾包含混合生育酚、脂肪酸、烴類、植物蠟、脂肪酸甾醇酯、甾醇、三萜醇、角鯊烯、甲基-甾醇和甘油單-、雙-和三酸酯的植物油副產(chǎn)物，產(chǎn)生（i）含脂肪酸和低沸點(diǎn)烴類的蒸氣產(chǎn)物及（ii）液體產(chǎn)物；（2）在 230℃～300℃和 0.066 65 Pa～133.3 Pa的壓力下，蒸餾步驟（1）的液體產(chǎn)物，產(chǎn)生（i）含混合母育酚濃縮液、角鯊烯、植物甾醇和植物蠟的第二蒸氣產(chǎn)物和（ii）第二液體產(chǎn)物；（3）使得自步驟（2）的經(jīng)冷凝的蒸氣產(chǎn)物與選自鏈烷醇或丙酮與水的混合物的萃取劑充分接觸，隨后使得到的混合物分離成兩相，包括（i）含大部分萃取劑的第一相和（ii）含大部分步驟（2）的經(jīng)冷凝的蒸氣流出液的第二相；（4）收集在步驟（3）中形成的第二相；（5）冷卻在步驟（3）中形成的第一相以形成沉淀，隨后收集沉淀；（6）合并在步驟（4）中收集的第二相與在步驟（5）中收集的沉淀并且除去步驟（4）和（5）中收集的物料中的步驟（3）所使用的萃取劑；由此得到含10%～40%角鯊烯、2%～20%植物甾醇、1%～10%混合母育酚和40%～80%植物蠟的植物脂質(zhì)組合物[20]。

Sugihara等研究了一種從油脂加工脫臭物或未氧化變質(zhì)的脫臭物廢皂化物中分離濃縮角鯊烯和植物甾醇的新方法。以超臨界CO2提取法，在30℃、100 kg/cm2（9.8 MPa）、CO2流速7 mL/min的條件下，將角鯊烯濃縮到25%的含量，再利用硅膠填充柱的超臨界流體色譜（supercritical fluid chromatography，SFC）得到約 50%的更高濃度。利用超臨界CO2重復(fù)提取2次可獲得含量為68%的角鯊烯。對(duì)脫臭物皂化后，直接使用正己烷分離，可獲得97%的植物甾醇。利用溶劑提取再結(jié)合硅膠填充柱超臨界流體色譜（Si-gel-SFC）可從非皂化物中得到81%和100%高純度角鯊烯[21]。

3.2.2 非食用油中提取

植物角鯊烯的研究開發(fā)目前已成為國(guó)內(nèi)角鯊烯研究的熱點(diǎn)。新發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)角鯊烯的植物有羅漢果、糯米香茶、尾巨桉、梅樹、省沽油，含量最高的為莧屬植物的種子。

專利CN1670005C用有機(jī)溶劑浸取出羅漢果的破碎種仁或種籽中的脂溶性物質(zhì)，除去有機(jī)溶劑后得到角鯊烯含量大于40%的羅漢果角鯊烯粗品。再將羅漢果角鯊烯粗品過(guò)硅膠層析柱，用有機(jī)溶劑洗脫，收集洗脫液無(wú)色部分，并用減壓蒸餾法除去有機(jī)溶劑，即得角鯊烯含量大于95%的羅漢果角鯊烯精品[22]。專利CN101417916C公開了一種糯米香茶角鯊烯及其制備方法，將糯米香茶的葉片干燥后粉碎，用有機(jī)溶劑或液態(tài)CO2浸提出脂溶性物質(zhì)，除去脂溶性物質(zhì)中的有機(jī)溶劑，即得到糯米香茶角鯊烯粗提物。再將糯米香茶角鯊烯粗提物過(guò)氧化鋁或硅膠層析柱，用有機(jī)溶劑洗脫，即制得含量大于90%的糯米香茶角鯊烯精品[23]。羅漢果角鯊烯和糯米香茶角鯊烯經(jīng)用氣相色譜法或高壓液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀法、紅外光譜法、核磁共振法測(cè)定，其圖譜均與角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品圖譜相符合，且具有角鯊烯特有的香味，均可以替代只能從深海鯊魚的肝臟中提取出的角鯊烯，并可作為角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品使用。

專利CN1810744A提供了一種從尾巨桉木材中提取角鯊烯的方法，具體步驟為先將尾巨桉木材制成木片或木粉，用有機(jī)溶劑從中提取出含角鯊烯的粗提物，其溶劑比（V溶劑/V木）為 3～50∶1，用系統(tǒng)溶劑分離法分離含角鯊烯的粗提物，得到含角鯊烯的烴類混合物，再將含角鯊烯的烴類混合物在1.330 Pa～0.133 Pa真空度下進(jìn)行2次～5次分子蒸餾，得到含量達(dá)80%～90%的角鯊烯產(chǎn)品[24]。專利CN101190281A公開了一種梅樹提取物的制備方法，該提取物含有0.5%～50%角鯊烯，其中的角鯊烯主要來(lái)自梅樹非果實(shí)部分的脂溶性有效部位，通過(guò)超臨界CO2流體或非極性有機(jī)溶劑萃取得到[25]。

賈春曉等采用超臨界CO2萃取技術(shù)對(duì)省沽油種子油進(jìn)行萃取，壓力25 MPa，溫度50℃，時(shí)間2 h。結(jié)果表明：超臨界CO2萃取種子油的收率為28.83%，省沽油種子油中含4.65%角鯊烯，1.58%維生素E[26]。岳才軍等以莧菜葉片為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，用皂化和不同有機(jī)溶劑浸泡的方法提取莧菜愈傷細(xì)胞中角鯊烯，并用HLPC測(cè)定其含量，結(jié)果表明，皂化法提取莧菜愈傷細(xì)胞的角鯊烯含量高于用有機(jī)溶劑浸泡方法提取的含量，莧菜愈傷細(xì)胞提取的角鯊烯在HLPC上與標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間一致，而且該峰與其他峰有很好的分離[27]。Han-Ping He用超臨界CO2萃取莧屬植物種子油，在50℃、300 bar（30 MPa）時(shí)盡管油脂產(chǎn)量較低（2.07 g/100 g），但角鯊烯的產(chǎn)量（0.31 g角鯊烯/100 g種子）和含量（15.3%）卻最高[13]。

Ko等對(duì)凍干欖仁樹落葉的超臨界CO2提取物進(jìn)行了GC-MS和HPLC含量分析，在40℃和3 000 psi（20.67 MPa）壓力條件下，超臨界CO2提取物中的角鯊烯含量為 1 499 μg/g（12.29%），遠(yuǎn)高于老葉、成葉、幼葉和種子提取物中的含量，落葉提取物具有較強(qiáng)的抗共軛二烯氫過(guò)氧化物（conjugated diene hydroperoxide，CDHP）形成和二苯基苦酰肼基自由基（1，1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl，DPPH）清除活性，而種子提取物僅表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制CDHP形成作用和很低的DPPH清除活性[28]。

3.3 微生物來(lái)源的角鯊烯

動(dòng)物來(lái)源的角鯊烯需要捕殺深海魚類，存在資源日益枯竭和生態(tài)平衡日益破壞的問(wèn)題。于是人們將目光轉(zhuǎn)向用食用油脂及其副產(chǎn)物為原料提取角鯊烯，已被大量應(yīng)用的為棕櫚油和橄欖油，雖部分地解決了原料來(lái)源問(wèn)題，但又開始與人類爭(zhēng)奪食物。因副產(chǎn)品和渣油的綜合利用存在量小、不易擴(kuò)大規(guī)模等問(wèn)題，使得人們的視角轉(zhuǎn)向利用非食用油脂植物資源開發(fā)角鯊烯，但非食用油脂植物存在種植面積小、不易收集、周期長(zhǎng)的缺點(diǎn)。因此，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)角鯊烯液成為關(guān)注的焦點(diǎn)。

印度學(xué)者P.Bhattacharjee等在通氣條件下，對(duì)面包酵母（Saccharomyces cerevisiae）和分離自糖蜜的戴爾布有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）菌株發(fā)酵培養(yǎng)，角鯊烯的產(chǎn)量分別為41.16和237.25 μg/g（相對(duì)于干菌體），在 60 ℃、250 bar～255 bar（25 MPa～25.5 MPa）CO2流量為0.2 L/min的條件下，對(duì)菌株Torulaspora delbrueckii的培養(yǎng)物進(jìn)行提取，角鯊烯的產(chǎn)量相對(duì)于酵母細(xì)胞最大為11.12 μg/g（干重），提取前對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行預(yù)凍，可將角鯊烯的產(chǎn)量提高到430.52 μg/g（細(xì)胞干重），該產(chǎn)量遠(yuǎn)高于氯仿-甲醇（2∶1）溶劑提取的得率[29]。

Chang等分離自海洋的一株產(chǎn)角鯊烯和多種不飽和脂肪酸的酵母菌株，rDNA分析的結(jié)果為Pseudozyma屬真菌，與Pseudozyma rugulosa和Pseudozyma aphidis有98%以上的遺傳同源性，其發(fā)酵的最佳碳源為葡萄糖，在葡萄糖和酵母提取物比例為4.5時(shí)角鯊烯的產(chǎn)生被激活，且為產(chǎn)角鯊烯的最佳比率，產(chǎn)角鯊烯的最佳葡萄糖濃度為4 g/L，最佳氮為硝酸鈉，此時(shí)菌體生物量為5.20 g/L，角鯊烯產(chǎn)量340.52 mg/L。其角鯊烯產(chǎn)量高于以往報(bào)道的產(chǎn)角鯊烯菌株，為商業(yè)化生產(chǎn)角鯊烯的較佳候選[30]。Walker等發(fā)明了一種酵母制備的角鯊烯和利用酵母生產(chǎn)角鯊烯的方法，通過(guò)利用基因修復(fù)寡核苷酸酶對(duì)酵母的一個(gè)或多個(gè)基因進(jìn)行修飾達(dá)到對(duì)酵母進(jìn)行基因改造的目的。對(duì)酵母基因的改造提高了角鯊烯相關(guān)的酶的表達(dá)，如乙酰輔酶A羧化酶、羥甲基戊二酰輔酶A還原酶、角鯊烯環(huán)氧酶和角鯊烯合成酶，并利用這種基因改造酵母，可生產(chǎn)異戊二烯，尤其是角鯊烯[31]。

綜上所述，雖然已有多種獲取角鯊烯的來(lái)源，但大部分采用超臨界CO2提取，在實(shí)現(xiàn)物料前處理、規(guī)模化生產(chǎn)及降低成本方面仍存在諸多限制。目前，亞臨界、循環(huán)超聲等技術(shù)在油脂提取方面都應(yīng)用與推廣，角鯊烯的制備技術(shù)將有望新的突破。

4 展望

4.1 新型產(chǎn)油植物和產(chǎn)油微生物的發(fā)展

植物性角鯊烯來(lái)源中，雖然橄欖油和棕櫚油可實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，以提供生產(chǎn)角鯊烯的原料。但這兩種油脂均為食用油脂，雖不存在安全和生態(tài)環(huán)境問(wèn)題，但存在與人爭(zhēng)食的問(wèn)題。以其加工過(guò)程的廢棄物脫臭餾出物或渣油作原料將是廢物利用的途徑。盡快開發(fā)富含角鯊烯的非食用油來(lái)源，如莧屬植物等，將是真正解決角鯊烯植物來(lái)源的根本途徑。

利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)角鯊烯雖然產(chǎn)量較低，其發(fā)酵工藝、生長(zhǎng)代謝調(diào)控，尤其是生產(chǎn)菌株、工程菌株的獲得還存在很多的技術(shù)困難，但利用微生物生產(chǎn)油脂有可再生性和低成本等特點(diǎn)，開發(fā)微生物油脂資源獲得角鯊烯產(chǎn)品將更有直接的社會(huì)與經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

4.2 角鯊烯代謝過(guò)程關(guān)鍵酶的研究

通過(guò)基因工程手段改造角鯊烯相關(guān)基因，利用基因修復(fù)寡核苷酸酶對(duì)多個(gè)基因進(jìn)行修飾改造，以提高角鯊烯相關(guān)酶的表達(dá)，可促進(jìn)異戊二烯的產(chǎn)生，進(jìn)而可提高微生物體內(nèi)角鯊烯的積累。利用生物技術(shù)生產(chǎn)角鯊烯雖然面臨諸多的挑戰(zhàn)，但卻是前景誘人的一條出路。

4.3 角鯊烯的人工合成

二十世紀(jì)八十年代，日本科學(xué)家首先人工合成了角鯊?fù)閇32]，并以Salangane SK為商品名進(jìn)行了短期銷售，但由于其生產(chǎn)成本高昂，后期未見相關(guān)報(bào)道。因此，如何降低人工合成的生產(chǎn)成本也是解決角鯊烯資源短缺的一個(gè)重要途徑。

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