棉籽殼酶法制備低聚木糖工藝條件優(yōu)化

丁長(zhǎng)河，張洪賓，周迎春，馬 康，殷麗君

（河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001）

棉籽殼酶法制備低聚木糖工藝條件優(yōu)化

丁長(zhǎng)河，張洪賓，周迎春，馬 康，殷麗君

（河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001）

對(duì)棉籽殼酶法生產(chǎn)低聚木糖的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。采用響應(yīng)面法優(yōu)化了預(yù)處理時(shí)間、鹽酸溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)和酶解pH值，得到最佳工藝條件為：預(yù)處理時(shí)間35.70 min、鹽酸溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.17%、酶解pH 6.5。在此條件下，木二糖質(zhì)量濃度達(dá)到14.52 g/L，與模型預(yù)測(cè)值基本相符。且低聚木糖以木二糖為主，木二糖得率為8.13%（以棉籽殼干質(zhì)量計(jì)）。

棉籽殼；低聚木糖；木二糖；響應(yīng)面法

低聚木糖（xylo-oligosaccharide，XO）是由2～7 個(gè)木糖以β-1,4糖苷鍵結(jié)合而成的一種功能性寡聚糖[1]，固態(tài)低聚木糖為乳白色至淡黃色粉末，主要是從富含木聚糖的植物（如棉籽殼、麩皮、玉米芯等）中，通過(guò)木聚糖酶酶解而制得的一種非消化低聚糖[2-4]。低聚木糖的主要有效成分是木二糖和木三糖，其中木二糖的甜度約為蔗糖的40%，含量達(dá)到50%的低聚木糖產(chǎn)品的甜度約為蔗糖的30%，甜味純正，類似蔗糖。低聚木糖作為一種理想的功能性食品添加劑，它不能夠被消化道內(nèi)的消化酶水解，且代謝不依賴胰島素，不影響人體血糖，屬于無(wú)熱量甜味劑，可以滿足糖尿病人群對(duì)糖的需求被廣泛用于糖尿病人食品中。除此之外低聚木糖還常被用于減肥、預(yù)防癌癥、補(bǔ)鈣等各類保健食品中[5-6]。低聚木糖極強(qiáng)的酸熱穩(wěn)定性、較好耐儲(chǔ)藏性以及與砂糖相似能夠很好增強(qiáng)飲料醇厚口感的特點(diǎn)[7]，可部分取代砂糖且不用擔(dān)心因加入低聚木糖而對(duì)飲料中其他成分帶來(lái)影響。

動(dòng)物食用添加低聚木糖的飼料后能明顯提高動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用率、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、改善動(dòng)物腸道環(huán)境、增強(qiáng)機(jī)體免疫力[8-12]。有研究[13]將低聚木糖用于血液透析患者高血脂并發(fā)癥的治療，取得了良好的效果，同時(shí)低聚木糖對(duì)腸道內(nèi)雙歧桿菌等有益菌的增殖也有良好的效果，因此在醫(yī)藥中低聚木糖具有很大的發(fā)展?jié)摿14]。

我國(guó)是世界棉花生產(chǎn)大國(guó)，2013年棉花產(chǎn)量預(yù)計(jì)達(dá)到640萬(wàn) t左右，棉籽殼資源豐富。但從我國(guó)目前棉籽殼的利用情況來(lái)看，棉籽殼大部分用作食用菌栽培的原料，利用途徑比較單一，生物利用率極低。因此，尋找棉籽殼新的利用途徑及提高棉籽殼加工附加值具有很重要的意義。根據(jù)文獻(xiàn)[15-18]可知，目前酶法制備低聚木糖主要有堿-酶法、酸-酶法、蒸汽爆噴-酶法、微波輔助-酶法等。但利用以上方法制備的水解產(chǎn)物中，具有功能特性的木二糖所占比例較少（30%左右）[19]。與前人研究相比，本研究利用棉籽殼制備低聚木糖主要有以下優(yōu)勢(shì)：所用原料棉籽殼中的木聚糖長(zhǎng)鏈不含阿拉伯糖等雜糖，有利于制得純度較高的低聚木糖溶液；實(shí)驗(yàn)條件溫和，降低了工廠生產(chǎn)的設(shè)備要求，利于工業(yè)化生產(chǎn)；酶解產(chǎn)物中具有功能特性的木二糖所占比例（90%以上）較大，減少了后期純化的成本，利于生產(chǎn)出高純度的低聚木糖產(chǎn)品。本實(shí)驗(yàn)室前期研究已確定，預(yù)處理?xiàng)l件一定，酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間20 h時(shí)酶解效果最好。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了預(yù)處理時(shí)鹽酸溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、預(yù)處理時(shí)間、木聚糖酶種類、酶解pH值對(duì)木二糖得率的影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝參數(shù)，確定利用棉籽殼生產(chǎn)低聚木糖的最佳工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

棉籽殼 新疆博樂(lè)油脂股份有限公司；D-木糖（分析純） 上海邁坤化工有限公司；木聚糖酶分別購(gòu)自山東省沂水隆大生物工程有限責(zé)任公司（記為QS酶）、諾維信（中國(guó)）生物技術(shù)有限公司（記為WX酶）、寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司（記為NX酶）、山東戴迪實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司（記為SD酶）、蘇柯漢生物工程有限公司（記為SK酶）。

1.2 儀器與設(shè)備

pH211 pH計(jì) 哈納儀器公司；MVE-1漩渦混合器北京金北德工貿(mào)有限公司；10 μL微量進(jìn)樣器 上海安亭微量進(jìn)樣器廠；THZ-82 B氣浴恒溫振蕩器 江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；UV-7504紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海欣茂儀器有限公司；高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀、示差折光檢測(cè)器美國(guó)Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 提取液及酶解液中糖組分的測(cè)定

采用薄層層析（thin layer chromatography，TLC）法[20]。選擇乙腈和水85∶15（V/V）為展開(kāi)劑，選用5%（V/V）的硫酸甲醇溶液為顯色劑。樣品上樣量為2.0～4.0 μL，展開(kāi)時(shí)，薄層層析板沒(méi)入展開(kāi)劑5 mm左右，兩次展開(kāi)。顯色劑潤(rùn)濕后置于130 ℃烘箱中烘5 min。

1.3.2 還原糖含量的測(cè)定

采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法[21]。

1.3.3 木聚糖（可溶性戊聚糖）含量的測(cè)定

采用地衣酚-鹽酸法[22]。

1.3.4 樣品中主要成分的測(cè)定

根據(jù)QB/T 2984—2008《低聚木糖》，將待測(cè)樣品稀釋至合適梯度經(jīng)0.45 μm膜過(guò)濾，用HPLC檢測(cè)。色譜條件為：色譜柱：Shodex sugar KS-802，內(nèi)徑8 mm，柱長(zhǎng)30 mm，填料粒度6 μm離子型凝膠柱；檢測(cè)器：示差折光檢測(cè)器；流動(dòng)相：超純水。在測(cè)定的前1 d接通示差折光檢測(cè)器電源，預(yù)熱穩(wěn)定（45 ℃），安裝色譜柱，調(diào)柱溫至80 ℃，以0.1 mL/min的流速通入流動(dòng)相平衡過(guò)夜。在正式進(jìn)樣分析前，在所有流動(dòng)相輸入?yún)⒈瘸?0 min以上，再回復(fù)正常流速使流動(dòng)相經(jīng)過(guò)樣品池，調(diào)節(jié)流速0.8 mL/min走基線，待基線走穩(wěn)后即可進(jìn)樣，進(jìn)樣量為20 μL。

1.3.5 單因素試驗(yàn)

1.3.5.1 預(yù)處理鹽酸溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)得率的影響

秤取4 份10 g棉籽殼分別加入10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%、0.2%、0.3%、0.4%鹽酸溶液，在60 ℃條件下水浴30 min，測(cè)定提取液中還原糖轉(zhuǎn)化率及可溶性戊聚糖的得率。得率計(jì)算公式如下：

式中：W為得率/%；C為酶解液中還原糖或可溶性戊聚糖含量/（g/L）；V為酶解液體積/L；M為棉籽殼干質(zhì)量/g。

1.3.5.2 預(yù)處理時(shí)間對(duì)得率的影響

秤取6 份10 g棉籽殼分別加入10 mL 0.2%鹽酸溶液，在60 ℃條件下分別水浴20、30、40、50、60、70 min，測(cè)定提取液中還原糖得率及可溶性戊聚糖得率。

1.3.5.3 不同種類酶對(duì)得率的影響

取6 份10 g棉籽殼分別加入10 mL 0.2%鹽酸溶液，在60 ℃條件下水浴40 min。預(yù)處理后取其中一份樣品作為對(duì)照樣，調(diào)節(jié)其他樣品pH值至6.0，再分別加入0.01%（棉籽殼干質(zhì)量）不同種類的木聚糖酶，50 ℃氣浴振蕩20 h。分別測(cè)定各樣品還原糖得率及可溶性戊聚糖得率。

1.3.6 最適酶解pH值的確定

配制一系列pH 3.5～9.5的200 mmol/L緩沖溶液，所用的緩沖體系和pH值范圍為：檸檬酸-檸檬酸鈉（pH 3.5、4.0、4.5、5.0），MES（pH 5.5、6.0、6.5、7.0），Tris-HCl（pH 7.5、8.0、8.5），glycine-NaOH（pH 9.0、9.5）。分別用以上緩沖液以體積比1∶3與去離子水溶解的木聚糖（1.3%）混合作為反應(yīng)底物，取1.8 mL底物加0.2 mL用相應(yīng)50 mmol/L緩沖液稀釋過(guò)的木聚糖酶在60 ℃水浴條件下，反應(yīng)10 min。取1 mL反應(yīng)過(guò)的酶解液加入1 mL DNS溶液沸水浴15 min，迅速加1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%酒石酸鉀鈉冷卻15 min，540 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。測(cè)定純酶的木聚糖酶活力[23]，以最大值為100%。

1.3.7 響應(yīng)面法優(yōu)化提取條件

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取3 個(gè)主要影響因子：預(yù)處理時(shí)間（A）、鹽酸溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)（B）、酶解pH值（C），運(yùn)用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以木二糖質(zhì)量濃度（Y）為指標(biāo)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化提取工藝條件，響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素與水平如表1所示。

1.4 模型驗(yàn)證

以響應(yīng)面分析法優(yōu)化出的工藝條件提取棉籽殼中的木二糖，通過(guò)比較理論值和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)值來(lái)證明其有效性。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)處理鹽酸溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)得率的影響

由圖1、2可知，隨著鹽酸溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，還原糖得率和可溶性戊聚糖得率都呈遞增趨勢(shì)，與TLC板比較得出，在鹽酸溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%和0.4%時(shí)單糖較多，因此選取鹽酸溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為0.1%～0.2%。

2.2 預(yù)處理時(shí)間對(duì)得率的影響

由圖3、4可知，隨著預(yù)處理時(shí)間的延長(zhǎng)，還原糖得率和可溶性戊聚糖得率在40～60 min變化不明顯，結(jié)合TLC板結(jié)果可知，預(yù)處理時(shí)間50～70 min時(shí)單糖含量較高；20 min時(shí)可溶性戊聚糖得率最低。因此選定預(yù)處理時(shí)間為30～40 min。

2.3 酶種類對(duì)得率的影響

由圖5、6可以看出，與酶解前樣相比較，還原糖得率變化不明顯，其中NX酶酶解后樣與SK酶解后樣可溶性戊聚糖得率較高。比較TLC結(jié)果可知，在相同進(jìn)樣量的條件下NX酶解后樣中木二糖質(zhì)量濃度大于SK酶酶解后樣中木二糖質(zhì)量濃度，因此選定NX酶為實(shí)驗(yàn)用酶。

2.4 酶解pH值對(duì)酶活的影響

由圖7可知，在pH 3.5～9.5范圍內(nèi)木聚糖酶活變化比較明顯，隨著酶解pH值的不斷增加，酶活呈現(xiàn)了先增、再緩、后減的趨勢(shì)。pH 5.5時(shí)酶活最大。在pH 4.5～6.5范圍內(nèi)酶活較大，因此，選定范圍為pH 4.5～6.5。

2.5 回歸方程的建立與分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法選擇最佳提取工藝，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。采用Design-Expert 8.05b軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到二次多項(xiàng)回歸模型為：Y=13.82+0.36A—0.54B+1.52C—1.00AB+ 0.48AC+1.91BC—1.74A2—1.64B2—1.12C2。

對(duì)模型進(jìn)行回歸方程系數(shù)顯著性分析見(jiàn)表3。模型中一次項(xiàng)B、C，二次項(xiàng)AB、BC、A2、B2、C2（P＜0.01）影響極顯著。響應(yīng)面回歸模型（P＜0.01）達(dá)到極顯著水平，失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），說(shuō)明該二次模型能夠擬合真實(shí)的試驗(yàn)結(jié)果?？梢?jiàn)，各試驗(yàn)因素對(duì)酶解液中木二糖質(zhì)量濃度的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。各因素之間交互作用對(duì)木二糖質(zhì)量濃度影響的響應(yīng)面如圖8～10所示。為了分析酶解液中的主要成分，從TLC分析中（圖11）可以得出酶解液以木二糖為主，從HPLC分析結(jié)果中得出木二糖、木三糖、木四糖占總糖比之和為71%，其中木二糖占總糖的64.5%，木三糖占其總量的6.46%。因此響應(yīng)面的最佳結(jié)果以木二糖質(zhì)量濃度來(lái)衡量。由Design-Expert軟件分析得到響應(yīng)面值最大時(shí)對(duì)應(yīng)的最佳條件是預(yù)處理時(shí)間35.70 min、鹽酸溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.17%、酶解pH 6.5，木二糖質(zhì)量濃度理論值為14.53 g/L。

為了驗(yàn)證響應(yīng)面法的可行性，選擇預(yù)處理時(shí)間35.70 min、鹽酸溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.17%、酶解pH 6.5，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，3 次平行實(shí)驗(yàn)得到木二糖質(zhì)量濃度平均值為14.52 g/L，與理論值基本相符，酶解后木二糖得率為8.13%（以棉籽殼干質(zhì)量計(jì)）。因此，響應(yīng)面法對(duì)棉籽殼制備低聚木糖的條件優(yōu)化是可行的，具有實(shí)際應(yīng)用的價(jià)值。

3 3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)研究了預(yù)處理時(shí)間、鹽酸溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶解pH值對(duì)木二糖質(zhì)量濃度的影響，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)利用棉籽殼提取低聚木糖的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化。得出最佳的提取工藝條件為：預(yù)處理時(shí)間35.70 min、鹽酸溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.17%、酶解pH 6.5。進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，3 次平行實(shí)驗(yàn)得到木二糖質(zhì)量濃度平均值為14.52 g/L，理論值為14.53 g/L，重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果較好。酶解后木二糖得率為8.13%（以棉籽殼干質(zhì)量計(jì)），為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)。

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Optimization of Extraction Conditions for Xylo-oligosaccharides from Cotton Seed Husk

DING Changhe, ZHANG Hongbin, ZHOU Yingchun, MA Kang, YIN Lijun
(College of Food Science and Technology, Henan University of Technology, Zhengzhou 450001, China)

The enzymatic hydrolysis of cotton seed husk with xylanase for xylo-oligosaccharides production was optimized by response surface methodology in this research. A pretreatment time of 35.70 min with 0.17% HCl was found optimal for the enzymatic hydrolysis, which was performed at an initial pH of 6.5. At the end of the hydrolysis, the concentration of xylobiose in hydrolysis was measured to be 14.52 g/L, agreeing with the predicted value. The final product was mostly xylobiose with a yield of 8.13% (relative to the dry weight of cotton seed husk).

cottonseed husk; xylo-oligosaccharides; xylobiose; response surface methodology

TS245.9

A

1002-6630（2015）04-0029-05

10.7506/spkx1002-6630-201504006

2013-11-25

河南省科技成果轉(zhuǎn)化基金項(xiàng)目（132201610014）；河南工業(yè)大學(xué)研究生教育創(chuàng)新計(jì)劃基金項(xiàng)目（2012YJCX22）

丁長(zhǎng)河（1968—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工和功能性低聚糖。E-mail：dch2004-2008@163.com