常山胡柚果實不同部位有效成分含量及其抗氧化活性比較

方博文,齊睿婷,張 英

(浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院,浙江省農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究重點實驗室,浙江省食品加工技術(shù)與裝備工程中心,浙江 杭州 310058)

常山胡柚果實不同部位有效成分含量及其抗氧化活性比較

方博文,齊睿婷,張 英*

(浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院,浙江省農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究重點實驗室,浙江省食品加工技術(shù)與裝備工程中心,浙江 杭州 310058)

將常山胡柚全果分為白皮層、油胞層、籽、果渣和果汁5 部分，除果汁外其余4 部分烘干后用70%乙醇溶液熱回流提取制備不同部位的醇提物，分別測定醇提物總黃酮和總酚含量，并采用4 種自由基評價體系比較其抗氧化活性的差異。研究表明，常山胡柚不同部位醇提物中總黃酮含量的高低依次為:油胞層（3.78%）＞白皮層（2.38%）＞籽（1.67%）＞果渣（0.77%），總酚含量最高也為油胞層（21.30%），最低為果渣（1.73%）；油胞層清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、O2-·和·OH的效果最佳，IC50值分別為0.37、0.24 mg/mL和1.31 mg/mL；而清除ABTS+·效果最好的則是白皮層（IC50值為0.015 mg/mL）。同時，測得胡柚果汁的總黃酮和總酚含量分別為0.021%和0.19%，清除DPPH自由基、ABTS+·、·OH和O2-·的IC50值分別為8.55、18.97、35.17 mg/mL和23.30 mg/mL。研究表明，胡柚果皮含有豐富的強抗氧化成分，且其質(zhì)量約占全果的1/3，對其進行深入研究和綜合開發(fā)是常山胡柚這一寶貴資源高值化利用過程中不可或缺的環(huán)節(jié)。

常山胡柚；果實不同部位；醇提物；果汁；有效成分；抗氧化活性

常山胡柚（Citrus paradisi cv. Changshan Huyou）起源于常山縣青石鄉(xiāng)胡家村，是柚、寬皮柑橘、甜橙重復雜交的產(chǎn)物[1]，形態(tài)學、同工酶、核DNA和葉綠體DNA分析表明，常山胡柚的母本是柚，而父本則可能是橘或者橙[2]。常山胡柚產(chǎn)量大、質(zhì)量優(yōu)、果型好、風味獨特，具有清涼祛火、鎮(zhèn)咳化痰、降低血糖、潤喉醒酒、養(yǎng)顏益壽等諸多藥理功效，是一種具有較高營養(yǎng)和保健價值的果品[3]，躋身于全國“名特優(yōu)新”水果行列。1998年‘常山胡柚’原產(chǎn)地證明商標獲國家商標局批準，該縣被冠以“中國常山胡柚之鄉(xiāng)”的稱號。常山胡柚有兩大特點尤為值得一提:一是具有調(diào)節(jié)血糖的作用[4]，糖尿病人可放心食用；二是果實極耐貯藏[5-6]，一般可貯藏到翌年四月，且風味不變，有“天然水果罐頭”之美譽[7]。目前，原產(chǎn)地常山胡柚的種植面積達到10萬 畝，年產(chǎn)12～14萬 t。

文獻研究常山胡柚有效成分的報道較少。僅有的文獻報道有:趙雪梅等[8-9]從胡柚皮醇提物中分離得到柚皮苷等6 種黃酮類化合物；時海香等[10-12]通過超臨界二氧化碳萃取得到常山胡柚皮中的天然色素，并對其穩(wěn)定性進行研究；吳倩[13]、韓曉祥[14]等利用超聲波輔助提取柚皮，并測定了醇提物的黃酮含量和抗氧化性能；邢建榮等[15]采用吸附法對常山胡柚汁進行脫苦處理等。

本實驗研究常山胡柚的加工副產(chǎn)物，分析比較果實不同部位醇提物中總黃酮和總酚含量高低及其抗氧化活性，以期為常山胡柚的綜合開發(fā)和高值化利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

常山胡柚果實采自常山縣同弓鄉(xiāng)棋盤山村，采摘時間為2013年11月18日。此種由常山縣糧食局專家楊業(yè)海鑒定為蕓香科柑橘屬常山胡柚種。

抗壞血酸（V C） 國藥集團化學試劑有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、鄰二氮菲、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽（2,2’-azino bis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS）、鄰苯三酚美國Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HX-502榨汁機 奧克斯集團；DGX-9243B-2烘箱上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司；WP502B百分之一電子天平上海精科天平儀器廠；DS-1高速組織搗碎機 上海標本模型廠；3K-15實驗通用離心機 上海楚柏實驗室設(shè)備有限公司；R-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海申科機械研究所；FD-1-50冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；T6紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 常山胡柚全果不同部位的分割及其醇提物制備

取新鮮的常山胡柚果1 0 只，單果質(zhì)量在274.35～334.60 g之間（其中質(zhì)量小于300 g的4 只，300～320 g之間的3 只，質(zhì)量大于320 g的3 只）。將其洗凈、擦干、剝皮，得到果皮和果瓤；將果皮壓平，從水平方向?qū)⒐で蟹殖蓛刹糠郑玫浇瘘S色的油胞層以及白色的白皮層；將果瓤榨汁兩次，分別得籽粒、果渣和果汁。預處理完成之后得到白皮層、油胞層、籽、果渣、果汁5部分。由于果實含籽量較少，另用80 只果單獨取籽。

白皮層、油胞層、籽、果渣經(jīng)烘干（（60±1） ℃，48 h）后粉碎，過40 目篩，備用。取一定量不同部位的粉末試樣，用體積分數(shù)70%的乙醇溶液按料液比1∶5（g/mL）熱回流（（90±1） ℃）提取1 h，濾渣再用等比例的乙醇溶液提取0.5 h。合并濾液，40 ℃條件下減壓濃縮至料液比為1∶1（g/mL）。冷凍干燥，得到果實不同部位的醇提物粉末試樣。

1.3.2 總黃酮含量測定（硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法[16]）

標準曲線的繪制:吸取150 μg/mL蘆丁標準溶液0、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00 mL于10 mL刻度比色管中，加30%乙醇溶液至5 mL，加0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻后放置5 min。加0.3 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻后放置6 min。加2 mL 1.0 mol/L氫氧化鈉溶液，用30%乙醇溶液定容至10 mL。搖勻后在510 nm波長處測定吸光度，記錄數(shù)據(jù)，繪制標準曲線。

樣品測定:稱取一定量待測樣品，用30%的乙醇溶液溶解、定容并稀釋至適宜質(zhì)量濃度，記錄總體積；取一定體積的待測液，按標準曲線制備中的操作步驟，于510 nm波長處進行吸光度的測定。

根據(jù)標準工作曲線，求出相當于試樣吸光度的蘆丁含量，按式（1）求出樣品總黃酮含量:

式中:m1為依據(jù)標準曲線計算出被測液中總黃酮含量/mg；m為供試品取樣量/mg；V1為待測液分取的體積/mL；V2為待測液的總體積/mL。

1.3.3 總酚含量測定（福林酚試劑還原比色法[17]）

標準曲線的繪制:吸取0.250 mg/mL對羥基苯甲酸標準溶液 0、0.05、0.10、0.20、0.40、0.80、1.20 mL于25 mL具塞試管中，加水稀釋至10.0 mL。加入1.0 mL福林試劑和2.0 mL 20%的Na2CO3溶液，混勻后沸水裕加熱1 min。立即用水冷卻并稀釋至25 mL?；靹蚝蠓胖?0 min，在745 nm波長處測定吸光度，記錄數(shù)據(jù)，繪制標準曲線。

樣品測定:稱取一定量待測樣品，用水溶解、定容并稀釋至適宜質(zhì)量濃度，記錄總體積；取一定體積的待測液，按標準曲線制備中的操作步驟，于745 nm波長處進行吸光度的測定。

根據(jù)標準工作曲線，求出相當于試樣吸光度的對羥基苯甲酸含量，按式（2）求出樣品總酚含量:

式中:m1為依據(jù)標準曲線計算出被測液中總酚含量/mg；m為供試品取樣量/mg；V1為待測液分取的體積/mL；V2為待測液的總體積/mL。

差量法得出樣品的酚酸含量，如式（3）所示。

1.3.4 抗氧化性能評價

1.3.4.1 清除DPPH自由基能力測定

稱取20 mg DPPH標準品，用甲醇定容至500 mL，置于棕色瓶中備用。將適當質(zhì)量濃度的常山胡柚醇提物溶液0.2 mL和3.8 mL DPPH溶液混合，室溫條件下放置1 h，在517 nm波長處測定吸光度（As）；同時測定DPPH溶液與0.2 mL蒸餾水的吸光度（A0），以及0.2 mL醇提物溶液與3.8 mL甲醇的吸光度（Ar）。按式（4）計算樣品的DPPH自由基抑制能力[18]。

1.3.4.2 清除ABTS+· 能力的測定

取440 μL過硫酸鉀溶液（140 mmol/L）加入到25 mL ABTS溶液中混合，室溫、避光，靜置反應12 h，得到ABTS儲備液。用無水乙醇將ABTS儲備液調(diào)節(jié)至吸光度為0.700±0.02（734 nm波長處），制得ABTS使用液。取0.1 mL醇提物溶液和3.9 mL ABTS使用液混合，靜置6 min，在734 nm 波長處測定吸光度（As）。同時測定0.1 mL蒸餾水和3.9 mL ABTS溶液的吸光度（A0），以及0.1 mL醇提物溶液和3.9 mL無水乙醇的吸光度（Ar）[19]。

1.3.4.3 清除·OH能力的測定

將1.0 mL鄰二氮菲溶液（0.5 mmol/L）、0.5 mL FeSO4溶液（0.75 mmol/L）、1 mL磷酸鹽緩沖液（pH 7.4，200 mmol/L）混合，加入醇提物溶液，最后加0.5 mL H2O2（體積分數(shù)0.1%）溶液，用去離子水補至10 mL，靜置1 h。在500 nm波長處測定吸光度（As）；同時用等量的蒸餾水代替醇提物溶液及H2O2溶液，測量吸光度（A0）；用等量蒸餾水替代樣品溶液，測量吸光度（Ar）。計算·OH清除能力[20]。

取2.25 mL Tris-HCl緩沖液（pH 8.2）與2.1 mL蒸餾水混和，25 ℃水浴預熱，加入0.5 mL適當質(zhì)量濃度的常山胡柚醇提物溶液，最后加入0.15 mL已預熱的30 mmol/L鄰苯三酚溶液，搖勻后立即倒入比色皿中在320 nm波長處測量吸光度，每30 s記錄一次數(shù)據(jù)，3 min后結(jié)束?？瞻讓φ找?0.01 mol/L HCl溶液代替鄰苯三酚溶液，自氧化對照以蒸餾水代替樣品溶液。按式（6）計算·清除能力[21]。

式中:v1為對照組鄰苯三酚自氧化速率；v2為加入多糖溶液的鄰苯三酚氧化速率。

1.4 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 常山胡柚果實不同部位占比及醇提得率

將10 只平均質(zhì)量為（304.28±22.30）g的常山胡柚鮮果按不同部位進行取樣、稱質(zhì)量，得到的數(shù)據(jù)如表1所示。油胞層、白皮層、籽、果渣和果汁在總質(zhì)量中的平均占比分別為14.55%、16.20%、0.19%、31.73%和37.33%，胡柚汁加工副產(chǎn)物（油胞層、白皮層、籽、果渣）合計約占全果質(zhì)量的三分之二，對其綜合利用可推動環(huán)保和工業(yè)附加值，提高胡柚產(chǎn)業(yè)的良性發(fā)展。

將油胞層、白皮層、果渣和籽于（60±1） ℃的烘箱內(nèi)干燥48 h獲得干品，脫水率分別為79.13%、75.34%、87.26%和64.15%，將其粉碎成40 目后，作為試樣備用；各取2 g試樣粉末于（110±1） ℃的烘箱內(nèi)干燥至質(zhì)量恒定，測定干粉的水分含量，以便在數(shù)據(jù)分析時統(tǒng)一折算成干基進行比較。綜合表2的兩組數(shù)據(jù)，可推算出鮮果不同部位的含水率分別為:油胞層80.43%、白皮層76.77%、果渣88.43%、籽66.42%。

按照1.3.1節(jié)方法得到醇提物，表3顯示油胞層、白皮層、果渣和籽以干基計的醇提得率分別為50.54%、42.24%、76.40%和24.70%。

2.2 醇提物的總黃酮和總酚含量

表4顯示，醇提物中油胞層的總酚含量最高（21.30%），其次是白皮層（11.77%），果渣（1.73%）和籽（1.81%）含量很低；總黃酮含量最高的部位也是油胞層（3.78%），其次是白皮層（2.38%），果渣（0.77%）和籽（1.67%）含量很低。同時，測得胡柚果汁的總黃酮和總酚含量分別為0.021%和0.19%。

2.3 常山胡柚不同部位醇提物的抗氧化能力

2.3.1 清除DPPH自由基的作用

從圖1可見，當試樣質(zhì)量濃度低于0.8 mg/mL時，白皮層和油胞層清除DPPH自由基的活性呈顯著的質(zhì)量濃度依賴關(guān)系，當試樣質(zhì)量濃度繼續(xù)加大到1 mg/mL及以上水平時，則呈現(xiàn)完全抑制，即其質(zhì)量濃度在0.8 mg/mL以上水平時達到了與VC相同的清除活性。果渣和籽的醇提物具有相同的抑制趨勢，但其作用僅相當于皮層醇提物的1/2～1/3。

2.3.2 清除ABTS+· 的作用

從圖2可見，當試樣質(zhì)量濃度小于0.1 mg/mL時，白皮層和油胞層醇提物對ABTS+· 的抑制作用隨質(zhì)量濃度升高而上升，在該質(zhì)量濃度時清除率分別達到91.71%、87.65%，質(zhì)量濃度繼續(xù)加大，清除作用接近陽性對照，達到完全抑制；果渣和籽醇提物的抑制作用明顯弱于皮層，至0.2 mg/mL質(zhì)量濃度時，清除率分別為61.92%和74.71%。陽性對照VC在0.01 mg/mL時即可完全抑制ABTS+·。

2.3.3 清除·OH的作用

如圖3所示，油胞層醇提物對·OH的抑制作用在所試質(zhì)量濃度范圍內(nèi)（0.1～2 mg/mL）隨質(zhì)量濃度升高而增加，2 mg/mL時清除率為93.7%；白 皮層醇提物清除自由基效果弱于油胞層，2 mg/mL時清除率為49.36%；果渣醇提物在質(zhì)量濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出低的抑制作用（＞15%）；而籽醇提物的清除率則表現(xiàn)為負數(shù)。

如圖4所示，在所試質(zhì)量濃度范圍（0.1～0.5 mg/mL）內(nèi)，白皮層、油胞層、果渣、籽醇提物對O2-·的抑制作用均呈顯著的質(zhì)量濃度依賴關(guān)系，質(zhì)量濃度0.5 mg/mL時，清除率分別為:白皮層92.01%、油胞層99.68%、果渣59.03%、籽50.18%。

2.3.5 胡柚果汁的抗氧化活性

從圖5可見，在所試質(zhì)量濃度范圍（1～50 mg/mL）內(nèi)，胡柚果汁對ABTS+·、·OH、O2-·的抑制作用都隨質(zhì)量濃度升高而線性增加，當試樣質(zhì)量濃度為50 mg/mL時，其清除率分別為99.28%、66.84%和99.34%。唯獨對DPPH自由基在15 mg/mL時即可完全抑制。

2.3.6 常山胡柚不同部位抗氧化活性綜合分析

胡柚果實不同部位醇提物、果汁及陽性對照VC對4 種活性氧自由基的半數(shù)抑制濃度（IC50值）見表5。在4 個不同部位醇提物中，清除O2-·和·OH能力大小依次是油胞層＞白皮層＞果渣＞籽，其中油胞層和白皮層醇提物清除O2-·的活性約為純品VC的1/10、果汁的100 倍左右，果渣和籽醇提物在所試質(zhì)量濃度范圍內(nèi)沒有表現(xiàn)出清除·OH活性；清除DPPH自由基的順序是油胞層＞白皮層＞果渣＞籽，果皮強于果渣和籽；清除ABTS+·能力最強的是白皮層醇提物，其活性約為純品VC的1/3；油胞層的清除·OH活性約為VC的1/25，白皮層約為VC的1/40。

總體上看，胡柚皮層含有豐富的抗氧化成分，具有相當強的抗自由基、抗氧化活性，且其醇提物具有柑橘類果實的特殊芬芳，是開發(fā)生物抗氧化劑的難得資源。

3 討 論

常山胡柚果實美觀，呈梨形、圓球形或扁球形，色澤金黃，內(nèi)質(zhì)飽滿，脆嫩多汁，酸甜適度，甘中微苦，鮮爽可口。單果質(zhì)量300 g左右，皮厚約0.6 cm，鮮食的可食率約70%。鑒于常山胡柚突出的營養(yǎng)和保健價值及其不可多得的耐貯性，它是一種非常適用于工業(yè)化生產(chǎn)的、具有廣闊開發(fā)前景的功能飲料主劑來源。然而，常山胡柚非可食部位（白皮層和油胞層）約占全果質(zhì)量的1/3，榨汁后又會產(chǎn)生1/3左右的加工副產(chǎn)物（果渣和籽）。本研究顯示，常山胡柚果皮部分（油胞層和白皮層）酚類物質(zhì)含量較高，具有抗氧化活性，是一種良好的天然抗氧化物質(zhì)的來源。對其進行綜合開發(fā)是常山胡柚工業(yè)化、規(guī)?；透咧祷眠^程中不可或缺的環(huán)節(jié)。

常山胡柚是葡萄柚的鼻祖，與其同宗同源的葡萄柚享譽全球，是人們熟悉并喜愛的日常水果，獲得了廣泛的關(guān)注，被研究的部位包括皮、肉、籽、果汁、各類醇提物以及副產(chǎn)物，研究內(nèi)容涵蓋了抗氧化性[22]、神經(jīng)活性[23]、基因毒性[24]等諸多方面。與之相比，對常山胡柚的研究則顯得十分薄弱，因此也更為迫切，建議重點關(guān)注其對血糖的調(diào)節(jié)功效和對糖尿病并發(fā)癥的預防作用。

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Active Components and Antioxidant Activities of Different Parts of Citrus paradise Fruit

FANG Bowen, QI Ruiting, ZHANG Ying*
(Zhejiang R&D Center for Food Technology and Equipment, Zhejiang Key Laboratory for Agro-Food Processing, College of Biosystems Engineering and Food Science, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China)

The fruit of Citrus paradisi was separated into albedo layer, oil gland layer, seed, pomace and juice. Active substances were extracted from albedo layer, oil gland layer, seed and pomace with 70% aqueous ethanol by hot refluxing. The contents of total flavonoids and phenolic substances in the resulting extracts were evaluated. Antioxidant activity was tested in four systems. The results showed that the content of total flavonoids in different fruit extracts of C. paradisi was in the following order: oil gland layer (3.78%) ＞ albedo layer (2.38%) ＞ seed (1.67%) ＞ pomace (0.77%). Similarly, the content of total phenols was the highest in oil gland layer (21.30%) and the lowest in pomace (1.73%). The ethanol extract of oil gland layer showed the highest antioxidant activity to scavenge 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), superoxide anion and hydroxyl radicals with IC50of 0.37, 0.24 and 1.31 mg/mL, respectively. The ethanol extract of albedo layer showed the highest ABTS+· scavenging activity with IC50of 0.015 mg/mL. The contents of total flavonoids and total phenols in the fresh juice were 0.021% and 0.19%, respectively. The IC50values for DPPH free radical, ABTS+·, O2-·, ·OH were 8.55, 18.97, 35.17 and 23.30 mg/mL, respectively. These results showed that oil gland layer and albedo layer had quite good antioxidant activities, which were positively correlated with the contents of total flavonoids and phenols. The pericarp consisting of the two layers made up about one third of the total fruit weight, and was rich in potent antioxidant compounds. To conclude, further study and development of C. paradisi fruit will have great practical significance.

Citrus paradisi; different parts of whole fruit; alcohol extract; fresh juice; effective constituent; antioxidant activity

TS209

A

10.7506/spkx1002-6630-201510032

2014-10-09

浙江大學馥莉食品研究院基金資助項目(KY201303)

方博文(1993—),男,本科生,研究方向為天然產(chǎn)物與功能性食品。E-mail：bwfang@zju.edu.cn

*通信作者：張英(1961—),女,教授,博士,研究方向為天然產(chǎn)物與功能性食品。E-mail：yzhang@zju.edu.cn