前處理對’澳洲青蘋'蘋果果實中有機酸組成與含量的影響

楊 巍，高文民，馬海仲，王柏松，和 陽，呂春晶，魏 瀟，張素敏,*

（1.遼寧省果樹科學研究所，遼寧 熊岳 115009；2.吉林省撫松縣松江河鎮(zhèn)農業(yè)技術推廣站，吉林 撫松 134504；3.長白山森工集團安圖林業(yè)有限公司，吉林 安圖 133600）

前處理對’澳洲青蘋'蘋果果實中有機酸組成與含量的影響

楊 巍1，高文民2，馬海仲3，王柏松1，和 陽1，呂春晶1，魏 瀟1，張素敏1,*

（1.遼寧省果樹科學研究所，遼寧 熊岳 115009；2.吉林省撫松縣松江河鎮(zhèn)農業(yè)技術推廣站，吉林 撫松 134504；3.長白山森工集團安圖林業(yè)有限公司，吉林 安圖 133600）

將‘澳洲青蘋’樣品去除果皮、果心，采用液相色譜法，研究破碎處理方式、浸提條件、測定前樣品貯藏條件對其果肉組織有機酸組成與含量的影響。結果表明:人工研磨與機械勻漿都是樣品破碎處理的有效手段，其選擇要視實驗目的、要求及具體實施情況而定。浸提溫度與振蕩時間對提取效果沒有顯著影響，以在常溫（25 ℃）條件下超聲波振蕩提取15 min為宜。樣品前處理后最好立即檢測分析，如不能立即進行，則以將破碎后經離心處理的樣品保存在常溫、光照條件下做短期貯藏為好?！闹耷嗵O’果實中含有草酸、奎尼酸、蘋果酸、莽草酸和檸檬酸5 種有機酸，含量順序為蘋果酸＞奎尼酸＞檸檬酸＞草酸＞莽草酸，蘋果酸是最為主要的有機酸，同一果實中不同有機酸與不同果實中相同有機酸含量相差懸殊，實驗時要注意試材的選取。

液相色譜；蘋果；有機酸；前處理技術

蘋果是中國北方栽培規(guī)模與產量最高的大眾水果，因其味美多汁并富含多種營養(yǎng)成分而備受廣大消費者青睞，有機酸是蘋果果實中的主要營養(yǎng)成分和口感風味物質[1]，蘋果中有機酸組成與含量分析對蘋果品質評價與引導科學飲食至關重要。前人對有機酸的研究由來已久，內容含蓋了不同樹種、同一果樹不同品種與多種栽培處理條件下果樹器官尤其果實中有機酸組分及其發(fā)育生理研究等諸多方面，在此過程中逐漸摸索出了酸堿滴定法[2-4]、氣相色譜法[5-7]與液相色譜法[8-15]等多種有機酸檢測方法，為水果營養(yǎng)評價與風味描述以及形成機制研究提供理論與技術參考，但3 種方法又各有不同，酸堿滴定法只能測定樣品中的總酸含量，而且精確度較低，氣相色譜法處理樣品時需要增加衍生步驟才能完成，復雜繁瑣，相比之下，液相色譜法具有操作簡便、準確度高、重現性好等優(yōu)點[16-22]，在同一條件下可同時檢測多種有機酸，是有著廣闊發(fā)展前景的方法技術。雖然前人借助液相色譜法對有機酸的研究涉及了眾多方面并取得了深入進展，但大多是借鑒其他領域科研實驗中所應用的現成技術，有的略加改進，大多直接照搬，較為系統(tǒng)完善的實驗方法尤其前處理技術尚未見報道，導致具體實驗過程中經常出現誤差甚至錯誤。本研究計劃以‘澳洲青蘋’蘋果果實為試材，通過對破碎方式、浸提時間與溫度以及樣品貯藏條件的篩查、比對，建立利用液相色譜進行有機酸分析檢測的一整套較為科學的、行之有效的前處理技術，為蘋果中有機酸組分精準定性、定量分析提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

采用成熟的‘澳洲青蘋’蘋果果實，于2012年10月取自遼寧省果樹科學研究所實驗區(qū)。草酸、奎尼酸、蘋果酸、莽草酸、檸檬酸 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

十萬分之一電子天平 瑞士梅特勒-托利多公司；超純水系統(tǒng) 美國密理博公司；制冰機 日本三洋公司；KQ 5200型超聲波提取器 中國江蘇昆山舒美超聲儀器有限公司；離心機 上海安亭科學儀器廠；U-3000型液相色譜儀（配有紫外檢測器） 美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

取大小相似、成熟度相近的‘澳洲青蘋’蘋果果實，去除果皮、果心，縱向切成月牙形果塊，以偏磷酸為浸提液，樣液比為1∶4（g/mL），于同一果實中取材進行人工研磨和機械勻漿、超聲波處理溫度與時間、貯藏條件的研究，材料破碎后轉移至離心管中，在轉速為10 000 r/min條件下離心10 min，取上清液經0.45 μm濾頭過濾保存，待上機檢測。以上每處理重復3 次。

1.3.2 實驗設計

樣品破碎采用室溫（25 ℃）條件下人工研磨與機械勻漿兩種處理方式；超聲波功率200 W，振蕩于室溫（25 ℃）條件下分別處理15、30、60 min；浸提溫度設25 ℃和0 ℃兩個梯度；樣品貯藏設不離心25 ℃光照貯藏3 d和離心25 ℃光照貯藏3 d兩種方式，以前處理完成經離心后立即檢測為對照；樣品貯藏設置25 ℃光照、25 ℃避光和-50 ℃避光3 個條件；不同果實是由同一果園中‘澳洲青蘋’成齡樹上采集的果實中隨機抽取的樣品，可能來自于不同單株或同一單株的不同位置。

1.3.3 色譜條件

利用紫外檢測器進行有機酸定量測定，采用Agilent ZOBAX C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫20 ℃，流動相比例為0.2%的偏磷酸，檢測波長214 nm，流速1.0 mL/min，利用戴安變色龍軟件進行儀器操作程序控制與數據處理。

2 結果與分析

2.1 液相色譜分析譜圖

圖1、2分別為標準及樣品中有機酸液相色譜分析譜圖，保留時間分別為:草酸2.47 min、奎尼酸2.92 min、蘋果酸3.87 min、莽草酸4.23 min、檸檬酸9.07 min。

2.2 破碎處理方式對有機酸提取效果的影響

實驗采用了人工研磨與機械勻漿兩種破碎處理方式，檢測結果（表1）表明，經研磨處理的樣品草酸含量顯著高于勻漿處理樣品，但數值相差不是很大，而其他4 種有機酸含量雖也存在差別，但互有大小，相差微弱，并不顯著。人工研磨與機械勻漿均為樣品破碎處理的有效方法，總體來看，二者沒有明顯的優(yōu)劣之分，實驗中應依具體情況選擇確定。本研究后續(xù)實驗都采用機械勻漿。

2.3 超聲波振蕩時間對有機酸提取效果的影響

表2顯示，在室溫自然光照條件下，處理間各種有機酸獲得量數值相近，不存在顯著性差異，說明在本實驗中，超聲波提取時間對目標物質提取效果沒有影響。樣品前處理過程中選擇室溫（25 ℃）自然光照條件下超聲波振蕩提取15 min，既可以保證各類有機酸的獲得量，又能夠提高實驗效率。

2.4 超聲波浸提溫度對有機酸提取效果的影響

實驗選取了室溫（25 ℃）和0 ℃兩個較為常用的溫度條件，表3結果顯示，二處理間草酸、奎尼酸、蘋果酸、莽草酸與5 種有機酸總量極為相近，相差甚微，而檸檬酸含量不是很高，但不同溫度獲得量相差很大，存在極顯著差異。由此表明，前處理過程中，溫度會對檸檬酸獲得量產生很大影響，在具體實驗當中應盡量選擇在室溫條件下超聲波振蕩浸提處理方法，這樣既能夠使檸檬酸取得盡大的獲得量而使其更接近真實值，也確保了其他各種有機酸含量的科學性，同時能夠降低實驗當中因提供低溫條件而增加的成本，還可以節(jié)省時間，提高實驗效率。

2.5 貯藏適宜條件篩選

2.5.1 樣品貯藏形式對有機酸檢測結果的影響

果實經機械勻漿處理后，經過離心處理與未進行離心處理的樣品經過72 h貯藏，以破碎經離心再用0.45 μm超微濾膜過濾后立即檢測樣品作為對照，表4表明，兩種處理方法中，奎尼酸與莽草酸均以經過離心貯藏的樣品含量高，而且奎尼酸含量在兩種處理間存在顯著性差異，但二者大小均極顯著低于對照；草酸含量以漿液共存在樣品中含量最高，極顯著高于漿液分離與對照樣品，離心處理后貯藏與立即檢測樣品草酸含量幾乎相同；而蘋果酸、檸檬酸在三者之間含量相當，不存在顯著差異，說明二者極易溶出且性質十分穩(wěn)定，同時，含量極高且處理間含量相當的蘋果酸也使三者間有機酸總量相近，沒有顯著差異。因此，利用液相色譜分析‘澳洲青蘋’蘋果有機酸含量，樣品前處理后，最好立即進行分析，如檢測不能立即實施，可以對樣品進行離心分離處理，然后再進行短期貯藏。

2.5.2 貯藏條件對有機酸檢測結果的影響

樣品經離心分離處理，在不同溫度與光照條件下保存3 d，由表5可看出，在條件變化過程中，除草酸含量在冷凍避光條件下稍高一些，其他4 種有機酸均存在由上至下的遞減規(guī)律，即含量值均為常溫光照貯藏最高，常溫避光次之，以冷凍避光最低，而且降低幅度很小，奎尼酸、莽草酸、檸檬酸在3 個處理間均不存在顯著性差異，僅蘋果酸在25 ℃光照與-50 ℃避光處理間存在顯著性差異，這是溫度與光照共同作用的結果。綜上說明貯藏過程中溫度與光照條件是影響各類有機酸獲得量的主要因素，但影響不大，樣品如需保存，應選擇常溫、光照條件下做短期貯藏。

2.6 ‘澳洲青蘋’蘋果果實有機酸組分含量

選擇常溫條件下浸提15 min，前處理后立即檢測。圖3表明，‘澳洲青蘋’果實中含有草酸、奎尼酸、蘋果酸、莽草酸和檸檬酸5 種有機酸，以蘋果酸含量最高，為7.370 4 mg/g，占各類有機酸總量（8.003 3 mg/g）的92.09%，極顯著高于其他4 種有機酸，其他4 種有機酸含量均較低，依次為奎尼酸（0.368 9 mg/g）、檸檬酸（0.154 0 mg/g）、草酸（0.102 8 mg/g），含量最低的為莽草酸（0.007 2 mg/g），僅接近蘋果酸含量的1%?！闹耷嗵O’蘋果果實有機酸由草酸、奎尼酸、蘋果酸、莽草酸和檸檬酸5 種有機酸組成，含量順序為蘋果酸＞奎尼酸＞檸檬酸＞草酸＞莽草酸，含量差別大，蘋果酸是最為主要的有機酸。

2.7 ‘澳洲青蘋’蘋果不同果實有機酸組分含量

從表6可以看出，‘澳洲青蘋’蘋果不同果實中均含有草酸、奎尼酸、蘋果酸、莽草酸和檸檬酸5 種有機酸，且含量均為蘋果酸＞奎尼酸＞檸檬酸＞草酸＞莽草酸；不同果實中有機酸含量不同，甚至相差較大，總量較高的果實中奎尼酸、蘋果酸、檸檬酸含量也比較高，只有莽草酸含量不符合該規(guī)律，總量最高的果C中莽草酸含量卻最低，草酸在不同單果間含量差異并不明顯。本實驗當中，4 個不同果實有機酸總量以果C最高，為9.949 0 mg/g，以果B最低，為6.987 5 mg/g，相差2.961 5 mg/g，占果B有機酸總量的42.38%，其中蘋果酸相差2.829 9 mg/g，占果B蘋果酸含量的44.18%，奎尼酸相差0.092 0 mg/g，占果B奎尼酸含量的27.57%，均存在極顯著性差異。由此可見，‘澳洲青蘋’不同果實中均含有草酸、奎尼酸、蘋果酸、莽草酸和檸檬酸5 種有機酸，而且蘋果酸＞奎尼酸＞檸檬酸＞草酸＞莽草酸，同時各類有機酸含量差異較大，實驗時要注意試材的選取。

3 討 論

不斷優(yōu)化、創(chuàng)新實驗樣品前處理技術，客觀、靈活把握具體方法與時間，能夠提高實驗科學性。前處理是指樣品在通過大型儀器設備進行指標分析檢測前，對樣品進行的令目標物質盡大量溶解在浸提劑中使其含量更接近原始實驗材料中真實含量的處理過程，包括樣品采集與選擇、破碎浸提去雜以及貯藏保存等步驟，從本項研究分析來看，每一環(huán)節(jié)均會對實驗結果產生影響，都至關重要。

首先，本實驗中，在管理方式相同的同一果園中樹齡相同的‘澳洲青蘋’樹上選擇大小相近、顏色相似的果實作為試材進行有機酸含量的分析，結果表明，有機酸含量高低仍然相差40%以上，這可能是由于試材來自于不同單株或樹上不同位置存在同化代謝的不同導致果實營養(yǎng)積累的差異而造成的，景延秋等[23]在不同葉位烤煙葉片有機酸含量分析中也得到了相似的結論，可以想象，如果材料是來自不同產地、不同管理方式的不同果園中不同外觀質量的果實，單個試材間的有機酸含量還將會存在更大差距，這種差異很可能超過實驗所允許的誤差范圍甚至超出處理間的差異，至使誤導科學判斷甚至得到相反結論，實驗選材是每項科研工作的前提和基礎，每個科學工作者都應該十分注意。

其次，樣品破碎、浸提、去雜過程中，要注意把握好處理的力度與時間長短和指標穩(wěn)定性的關系。處理力度大、時間長、指標穩(wěn)定性好的樣品，實驗結果指標檢測獲得量越高，越接近真實存在，而如果指標穩(wěn)定性較差，處理力度越大、時間越長，指標檢測獲得量可能反而會降低，本實驗中草酸和檸檬酸在研磨破碎方法及高溫浸提條件下有較高的獲得量，因此，實驗當中要合理把握樣品前處理的方法、力度、時間的搭配，高玉龍等[24]在不同處理方式的煙葉樣品中測定出有機酸含量的差異較大。

再次，處理后樣品最好立即完成儀器檢測過程，更為科學、真實，否則，一定經過離心去雜后再進行保存，保存時要注意貯藏條件與時間長短的搭配。貯藏過程中，不同貯藏形式樣品中草酸、奎尼酸、莽草酸含量的巨大差異以及蘋果酸與檸檬酸含量的幾近相同，可能是由于這些酸在前處理實驗過程中溶解性與穩(wěn)定性不同，奎尼酸與莽草酸在樣品貯藏過程中容易轉化或降解，在漿、液共存的環(huán)境中發(fā)生更為嚴重，而貯藏過程可能有利于草酸的盡大量溶出和生成，這與人工研磨的樣品中有極高草酸含量可能存在相同的原因，研磨能夠使果肉破碎更細而使草酸能夠盡大量的溶出，而蘋果酸、檸檬酸二者極易溶出且性質十分穩(wěn)定。本實驗中經離心分離后的樣品中去除了大量果肉碎塊，使得樣品中物質組分基本保持了上機檢測前的原貌，因此，樣品溶液內部在貯藏過程中物質間相互轉化、降解的較少，各類指標含量與立即檢測樣品指標含量應該最為相近，是一種比較理想的貯藏形式，而未經離心處理的樣品中含有大量的果肉碎塊，在這種環(huán)境體系中，化學反應與變化的發(fā)生可能更為復雜和多樣。因此，在蘋果有機酸定量分析實驗當中，如不能立即進行檢測，一定要將樣品離心分離，使檢測結果趨近客觀、真實。

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Optimization of Pretreatment Conditions for Determination of Organic Acid Contents in ‘Granny Smith’ Apple Fruit Pulp by Liquid Chromatography

YANG Wei1, GAO Wenmin2, MA Haizhong3, WANG Baisong1, HE Yang1, L? Chunjing1, WEI Xiao1, ZHANG Sumin1,*
(1. Liaoning Institute of Pomology, Xiongyue 115009, China; 2. Songjianghe Town Agricultural Technology Promotion Station, Fusong 134504, China; 3. Changbai Mountain Forestry Group Antu Forestry Co. Ltd., Antu 133600, China)

This study was a systematic investigation into the effects of pulping methods, extraction conditions and storage conditions before analysis by liquid chromatography on the organic acid composition and contents of ‘Granny Smith’ apple pulp. The results showed that manual grinding and mechanical homogenization were both effective means to crush apples, and the selection depended on the test purpose and requirements and the specific circumstances. Extraction temperature and oscillation time had no significant effects on extraction efficiency. We found extraction at 25 ℃ for 15 min with ultrasonic oscillation to be optimal immediately followed by the liquid chromatographic analysis; otherwise, the crushed sample was centrifuged before short-term storage at room temperature under light conditions. ‘Granny Smith’ apples were detected to contain oxalic acid, quinic acid, malic acid, shikimic acid and citric acid. Their relative contents were in the following descending order: malic acid ＞ quinic acid ＞ citric acid ＞ oxalic acid ＞ shikimic acid. Malic acid was the main organic acid in all samples although there were tremendous differences in the content of each of the organic acids among different apple fruits and among the contents of the organic acids in the same apple fruit. Thus, attention should be paid to selection of the test material.

liquid chromatography; apple; organic acids; pretreatment technologies

S661.1

A

10.7506/spkx1002-6630-201510028

2014-08-18

遼寧省百千萬人才工程項目；遼寧省自然科學基金項目(20102223)

楊巍(1972—),男,副研究員,碩士,研究方向為果樹資源品質生理。E-mail：ywsys@yeah.net

*通信作者：張素敏(1972—),女,副研究員,碩士,研究方向為果品加工工藝與產品創(chuàng)制。E-mail：yangchunyue@163.com