N MR 氫譜定量測定奶酪中總共軛亞油酸的含量

(北京市食品安全監(jiān)控和風(fēng)險(xiǎn)評估中心,北京 100041)

N MR 氫譜定量測定奶酪中總共軛亞油酸的含量

李 瑋,姜 潔,路 勇,何 濤,李 龍,王 振

(北京市食品安全監(jiān)控和風(fēng)險(xiǎn)評估中心,北京 100041)

目的:建立用核磁共振定量法測定奶酪中總共軛亞油酸含量的方法，并與紫外分光光度法進(jìn)行比較。方法:以1,2,4,5-四甲基苯為內(nèi)標(biāo)，采用5 mm BBO探頭、脈沖序列noesyig1d、探頭溫度300 K、掃描次數(shù)128 次、脈沖延遲時(shí)間（D1）10 s。結(jié)果:該方法的加樣回收率為93.33%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為4.20%；精密度RSD為0.99%，重復(fù)性RSD為3.17%，穩(wěn)定性RSD為1.81%。結(jié)論:該方法前處理簡單，無需標(biāo)準(zhǔn)品做參比，在對目標(biāo)物完成定性、定量分析的同時(shí)還可以實(shí)現(xiàn)對非目標(biāo)物的定性分析。與紫外分光光度法相比，該方法具有更好的專屬性。

核磁共振定量法；奶酪；共軛亞油酸；定量測定

共軛亞油酸（conjugated linoleic acid，CLA）是一類含有共扼雙鍵的十八碳二烯酸（亞油酸）同分異構(gòu)體的總稱[1]。天然來源的CLA主要存在于反芻動物的肉及乳制品中，是人體不可缺少的脂肪酸之一。近年來的研究表明，CLA具有抗癌[2-5]、抗動脈粥樣硬化[6-11]、增強(qiáng)機(jī)體免疫力[12]、促進(jìn)骨形成等多種生理功能[13]。其中起關(guān)鍵作用的2 種主要異構(gòu)體為c9,t11-CLA和t10,c12-CLA，在乳制品中這2 種異構(gòu)體分別占總CLA的75%～90%和5%。

乳制品是人體日常攝入CLA的主要來源，而奶酪是具有極高營養(yǎng)價(jià)值的濃縮乳制品，被譽(yù)為乳品中的“黃金”。隨著國內(nèi)市場對奶酪制品消費(fèi)量的大幅增加，建立一種快速、準(zhǔn)確、簡便的奶酪等乳制品中的CLA定性和定量分析方法十分必要。目前針對CLA的分析方法主要有紫外分光光度法[14-15]、高效液相色譜法[16]、氣相色譜法[17-18]等。但這些方法存在著前處理過程操作繁瑣、費(fèi)時(shí)，樣品和試劑消耗量大，會受到其他成分信號的干擾等缺點(diǎn)。核磁共振定量（quantitative nuclear magnetic resonance，QNMR）分析方法以結(jié)構(gòu)測定為基礎(chǔ)，具有前處理過程簡單，取樣量小，專屬性強(qiáng)，無需對照品做參比即可同時(shí)定性、定量等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛的用于藥物分析[19-20]、食品科學(xué)[21-22]等研究領(lǐng)域。本研究采用1H-NMR內(nèi)標(biāo)定量法，建立了無需對照品的快速、專屬、簡單的奶酪中總CLA含量的測定方法，考察了實(shí)驗(yàn)條件的影響，用絕對定量和標(biāo)準(zhǔn)曲線模式測定了7 種市售奶酪樣品中總CLA的含量，并與紫外分光光度法進(jìn)行了比較，為奶酪等乳制品的品質(zhì)評價(jià)提供了新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

7 種奶酪樣品購于北京市超市，置于4 ℃冰箱保存。

正己烷（分析純） 北京化工廠；標(biāo)準(zhǔn)品:1,2,4,5-四甲基苯、c9,t11-CLA、t10,c12-CLA（純度≥99%）美國Sigma公司；氘代氯仿（CDCl3，氘代度:99.8%）美國CIL公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AVANCE 600MHZ超導(dǎo)傅里葉變換NMR儀（配有BBO探頭和Topspin 3.2處理軟件） 瑞士Bruker公司；Lambda 35紫外分光光度計(jì) 美國Perkin Elmer公司；XS204電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；TissueLyserⅡ均質(zhì)器 德國Qiagen公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

稱取適量的1,2,4,5-四甲基苯標(biāo)準(zhǔn)品，用CDCl3溶解并定容，搖勻，制得0.2 mg/mL的內(nèi)標(biāo)儲備液。稱取c9,t11-CLA、t10,c12-CLA標(biāo)準(zhǔn)品各25 mg置于同一5 mL棕色容量瓶中，用CDCl3溶解并定容，搖勻，制得10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，-20 ℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 供試品溶液的制備

稱取奶酪樣品約1 0 0 m g于離心管中，加入1 mL CDCl3后置于均質(zhì)器中均質(zhì)30 s（30 Hz），過濾。分別移取500 μL樣品濾液和100 μL內(nèi)標(biāo)儲備液于5 mm核磁管中，制得供試品。

1.3.3 NMR測定條件

1H-NMR、1D-TOCSY、1H-H COSY、HSQC、HMBC使用Bruker標(biāo)準(zhǔn)脈沖程序，檢測溫度均為300 K，掃描次數(shù)（scanning number NS）分別為128、32、8、8、80 次，1D-TOCSY的混合時(shí)間D9設(shè)為0.075 s。1D-TOCSY為一維選擇性實(shí)驗(yàn)技術(shù)，在混合物解析中發(fā)揮著重要作用，能夠得到激發(fā)核以及與其在同一個(gè)自旋體系的質(zhì)子的信號；1H-H COSY技術(shù)能夠給出相鄰碳上氫的關(guān)系，HSQC技術(shù)能給出直接相連的碳?xì)潢P(guān)系；HMBC技術(shù)能給出遠(yuǎn)程耦合的碳?xì)潢P(guān)系。

定量實(shí)驗(yàn):使用Bruker標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)參數(shù)ASSURE-1H，脈沖序列Noesyig1d，檢測溫度300 K，1H的90°脈沖寬度P110.32 μs，譜寬7 211.54 Hz，中心頻率2 700.59 Hz，脈沖延遲時(shí)間D1為10 s，混合時(shí)間D80.01 s，13C的去耦序列90°脈沖260 μs，掃描次數(shù)128次，空掃次數(shù)4次。

1.3.4 供試品溶液的測定

測定前，使用標(biāo)準(zhǔn)管（90% H2O+10% D2O）對儀器進(jìn)行3D勻場，使用ASTM標(biāo)準(zhǔn)管精確校準(zhǔn)探頭90°脈沖寬度。在1.3.2節(jié)測定條件下，測定供試品的1H-NMR譜圖。所有圖譜使用Bruker Topspin 3.2軟件處理，變換點(diǎn)數(shù)為96 000，用指數(shù)窗函數(shù)處理，LB為1.00 Hz，基線和相位校正均采用手動方式進(jìn) 行。每個(gè)供試品的積分面積取5 次積分的平均值。按以下公式計(jì)算供試品中CLA的絕對含量。

式中:W為物質(zhì)的質(zhì)量/mg；A為定量峰積分面積；N為定量峰所包含的質(zhì)子數(shù)；M為物質(zhì)相對分子質(zhì)量；下標(biāo)u及r分別為分析物和內(nèi)標(biāo)物。本實(shí)驗(yàn)中的Nu=1，Nr=2，Mu=280.44，Mr=134.22，Wr=0.02 mg。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及曲線繪制

準(zhǔn)確吸取80、50、20、10、5 μL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，分別置于已加有100 μL內(nèi)標(biāo)儲備液的5 支核磁管中，各加一定體積的CDCl3溶液至500 μL，配制成含質(zhì)量分別是0.8、0.5、0.2、0.1、0.05 mg的標(biāo)準(zhǔn)樣品，以1.3.3節(jié)中的測定條件進(jìn)行1H-NMR分析。以積分得到的標(biāo)準(zhǔn)品定量峰面積與內(nèi)標(biāo)峰峰面積比值為Y軸，以加入標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量與加入的內(nèi)標(biāo)質(zhì)量的比值為X軸做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6 紫外分光光度法測定

用正己烷配制成質(zhì)量濃度為2、5、8、10、20 μg/mL的一系列CLA對照品溶液，按照紫外-可見分光光度法，在234 nm波長[14-15]處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱取奶酪樣品約100 mg于離心管中，加入1 mL正己烷后，置于均質(zhì)器中均質(zhì)30 s（頻率為30 Hz），過濾。吸取500 μL樣品濾液于25 mL容量瓶中，加適量正己烷定容，搖勻。吸取適量溶液，在234 nm波長處測定吸光度，根據(jù)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中CLA的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 定量特征峰、定量內(nèi)標(biāo)的選擇

測定供試品溶液的1H-NMR譜，結(jié)果見圖1。其中，δ0.50～2.50（圖1a）信號為CLA和其他脂肪酸的飽和質(zhì)子信號，δ4.10～4.36（圖1b）和δ5.27（圖1c）信號為甘油三酯中丙三醇的質(zhì)子信號，δ5.30～5.43（圖1d）信號為非共軛脂肪酸不飽和質(zhì)子信號，這些信號相互堆積重疊，不易辨識。由于共軛系統(tǒng)的存在，CLA的4 個(gè)共軛不飽和質(zhì)子出現(xiàn)在低場區(qū)（δ5.20～6.50），其中δ5.33的質(zhì)子信號被非共軛脂肪酸不飽和質(zhì)子信號覆蓋，余下3 個(gè)共軛不飽和質(zhì)子信號（δ5.67、δ5.96和δ6.30）與其他脂肪酸信號無重疊，易于辨認(rèn)。供試品及標(biāo)準(zhǔn)品的檢測結(jié)果顯示，δ5.67信號積分面積值不穩(wěn)定，并結(jié)合文獻(xiàn)[23-24]報(bào)道，選擇δ5.96（圖1e）和δ6.30（圖1f）2 個(gè)質(zhì)子信號峰作為定量峰，最終以這2 個(gè)質(zhì)子信號積分面積的均值作為計(jì)算供試品中總CLA含量的定量積分面積值。

QNMR所選內(nèi)標(biāo)應(yīng)滿足純度高，能與被測樣品溶于同一種溶劑，不與被測樣品及溶劑反應(yīng)，定量信號峰易于識別，并且至少要保證有一組峰與被測物完全分離等要求。因此，本實(shí)驗(yàn)選用1,2,4,5-四甲基苯為定量內(nèi)標(biāo)，其苯環(huán)上的2 個(gè)質(zhì)子在化學(xué)位移為δ6.92（圖1g）處有一尖銳單峰（1H-NMR CDCl3），故選定此峰為內(nèi)標(biāo)定量特征信號峰。

2.2 QNMR定量參數(shù)考察

脈沖延遲時(shí)間的考察:取1.3.5節(jié)中制備的含0.1 mg標(biāo)準(zhǔn)品核磁管，分別設(shè)D1為2、4、8、10、15、20 s，NS為48 次，余下參數(shù)按1.3.3節(jié)下條件上機(jī)檢測，考察D1對定量峰與內(nèi)標(biāo)峰積分面積比值（AS為CLA兩個(gè)定量信號積分面積的均值；AR為內(nèi)標(biāo)定量信號積分面積）的影響，結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，當(dāng)D1≥10 s時(shí)，相對積分面積穩(wěn)定，因此，確定實(shí)驗(yàn)的D1為10 s。

掃描次數(shù)的考察:取1.3.5節(jié)中制備的含0.1 mg標(biāo)準(zhǔn)品核磁管，分別設(shè)NS為8、16、32、48、64、128、256 次，余下參數(shù)按1.3.3節(jié)下條件上機(jī)檢測，考察NS對定量峰RSN的影響，結(jié)果見表2。在NMR定量實(shí)驗(yàn)中，NS較少會造成數(shù)據(jù)重復(fù)性差，較多會使數(shù)據(jù)重復(fù)性好，提高信噪比，但同時(shí)也會延長實(shí)驗(yàn)時(shí)間。綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)中取NS為128 次，此時(shí)定量峰的RSN大于100。

2.3 線性關(guān)系

以積分得到的標(biāo)準(zhǔn)品定量峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)（AS/AR）為縱坐標(biāo)，以加入的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量與加入的內(nèi)標(biāo)質(zhì)量的比值為橫坐標(biāo)做線性回歸。在標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)質(zhì)量比為2.5～40范圍內(nèi)，得回歸方程y = 3.847 9x+ 0.406 8，R2 = 0.999 9，表明本方法線性關(guān)系良好。

2.4 精密度

將按1.3.2節(jié)方法制備的供試品在1.3.3節(jié)下條件平行測定6 次，計(jì)算樣品中AS/AR的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為0.99%。確認(rèn)方法精密度良好。

2.5 重復(fù)性

按1.3.2節(jié)下方法平行制備6 份供試品溶液，在1.3.3節(jié)條件下測定1H-NMR圖譜，計(jì)算樣品中AS/AR的RSD為3.17%，確認(rèn)方法重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性

取同一供試品溶液，分別在制備后0、2、4、8、12、24、48 h，在1.3.3節(jié)條件下測定1H-NMR圖譜，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)圖譜AS/AR的RSD為1.81%，確認(rèn)供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 加標(biāo)回收率

平行稱取同一品牌的奶酪樣品9 份，其中3 份作為對照，另外6 份各加入10 μL質(zhì)量濃度為10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。按1.3.2節(jié)下方法制備供試溶液，在1.3.3節(jié)條件下測定1H-NMR圖譜，計(jì)算回收率和RSD，結(jié)果見表3。

2.8 樣品測試結(jié)果

稱取不同品牌的奶酪樣品,每個(gè)品牌3 個(gè)平行(n=3),制備供試品溶液,測定1H-NMR圖譜,并計(jì)算樣品中CLA的含量。再采用紫外分光光度法測定樣品中CLA的絕對含量,結(jié)果見表4。

結(jié)果顯示，NMR絕對定量法和NMR標(biāo)準(zhǔn)曲線法所得到的結(jié)果基本相符（RSD在4%以內(nèi)）；所有樣品的紫外分光光度法的檢測值均大于NMR絕對定量法的檢測值，其中1、3、5號樣品的紫外分光光度法的測定值明顯大于對應(yīng)的NMR絕對定量法測定值（RSD大于20%）。通過對比1號樣品和2號樣品的1H-NMR圖譜（圖2），發(fā)現(xiàn)1號樣品在δ5.20～7.40范圍有幾組多出信號，其中δ7.32（dd, 10.8, 15.2 Hz）、δ5.80（d, 15.2 Hz）耦合常數(shù)在15 Hz左右，具有典型的反式雙鍵上質(zhì)子特征。1D-TOCSY技術(shù)能夠得到激發(fā)核以及與其在同一個(gè)自旋體系的質(zhì)子的信號，而非該自旋體系的其他質(zhì)子信號則不出現(xiàn)在譜圖中。對1號樣品采用1D-TOCSY技術(shù)，選擇性照射δ7.32的質(zhì)子，得出δ7.32、δ6.21、δ5.80、δ1.88信號質(zhì)子處于同一自旋體系內(nèi)（圖3）。1H-NMR譜δ6.21處的信號為多重峰，不易辨識，通過HSQC，得出此處的多重峰為2 個(gè)質(zhì)子譜峰的重疊，化學(xué)位移分別為δ6.22和δ6.20（圖4），并且進(jìn)一步得出δ146.8、δ129.8、δ139.8、δ117.75、δ18.6碳原子分別與δ7.32、δ6.22、δ6.20、δ5.80、δ1.88質(zhì)子直接相連。通過1H-1H COSY圖譜，可以觀察到δ7.32處信號分別與δ6.22及δ5.80兩個(gè)信號峰相關(guān)，δ6.20信號峰和δ1.88信號峰相關(guān)（圖5），得出5 個(gè)質(zhì)子的連接順序。HMBC譜中，δ7.32、δ5.80 2 個(gè)質(zhì)子均與δ169.8的碳信號相關(guān)（圖6），結(jié)合δ5.80質(zhì)子信號的峰形，推斷此雙鍵中δ117.75的碳與羧基相連。結(jié)合質(zhì)譜測定結(jié)果，確認(rèn)此成分為山梨酸（2,4-己二烯酸，圖7）。3、5號樣品的1H-NMR圖譜與1號樣品相似，說明其中也含有山梨酸成分。

紫外分光光度法是利用CLA中存在的共軛雙鍵在234 nm波長處有特征吸收，而非共軛亞油酸及其他脂肪酸在該波長處沒有吸收的原理來測定樣品中CLA含量的。由于山梨酸分子中也含有共軛雙鍵結(jié)構(gòu)，在234 nm波長處同樣有吸收，所以最終導(dǎo)致1、3、5號樣品紫外分光光度法測定的CLA值顯著偏高。2、4、6、7號樣品的紫外分光光度法的檢測值也均大于NMR絕對定量法的檢測值，考慮到檢測樣品成分復(fù)雜性，并結(jié)合紫外分光光度法的特點(diǎn)，推測可能是樣品中也含有在測定波長處具有紫外吸收的雜質(zhì)。

3 結(jié) 論

目前的文獻(xiàn)報(bào)道多見以QNMR內(nèi)標(biāo)法對藥物制劑或化學(xué)對照品進(jìn)行含量測定[25-26]，少見對食品中的營養(yǎng)成分進(jìn)行絕對含量測定的文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以1,2,4,5-四甲基苯為內(nèi)標(biāo)，建立了奶酪中總CLA含量的QNMR分析方法。9c,11t-CLA、10t,12c-CLA標(biāo)準(zhǔn)品的1H-NMR（CDCl3）測定結(jié)果顯示，兩者所含的4 個(gè)共軛質(zhì)子信號完全相同，并且乳制品中的CLA以這2 種異構(gòu)體為主，因此，本實(shí)驗(yàn)中選取的定量峰能夠代表樣品中總CLA的含量。結(jié)果表明，本方法精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性良好，專屬性高，樣品前處理簡單，無需高純度標(biāo)準(zhǔn)品做參比，可同時(shí)完成定性和定量分析。

與NMR定性圖譜相比，QNMR實(shí)驗(yàn)對圖譜的質(zhì)量要求更高。由于13C自然豐度遠(yuǎn)低于1H，所以在1H-NMR圖譜中13C對1H的耦合作用較小。因此，在對藥物制劑、化學(xué)對照品這類基質(zhì)簡單，分析物的相對含量較高的樣品進(jìn)行分析時(shí)，常采用zg、zg30等不對碳去耦的脈沖序列進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。但本實(shí)驗(yàn)中的分析對象的基質(zhì)復(fù)雜，目標(biāo)分析物CLA的相對含量較低，對圖譜的峰形、基線、相位的質(zhì)量要求更高。因此，本實(shí)驗(yàn)采用Noesyig1d脈沖序列，對13C去耦，能夠消除樣品1H-NMR信號的衛(wèi)星峰，增加定量準(zhǔn)確性，同時(shí)還能提高基線平滑度，更適合復(fù)雜基質(zhì)中微量成分的QNMR定量。

紫外光譜儀器較NMR儀價(jià)格便宜，普及率高，但易受其他成分的干擾，專屬性較差。NMR測定結(jié)果與紫外分光光度法測定結(jié)果的比較顯示，NMR的抗干擾能力明顯優(yōu)于紫外法。因此在進(jìn)行CLA分析時(shí)，應(yīng)充分考慮樣品的性質(zhì)和各分析方法的特點(diǎn)等來選擇佳的檢測方法。特別是對使用山梨酸作為防腐劑的食品樣品進(jìn)行CLA含量測定時(shí)，要避免使用紫外分光光度法。同時(shí)，由于QNMR法以結(jié)構(gòu)測定為基礎(chǔ)，除了能完成對目標(biāo)物的分析外，還能夠結(jié)合多種1D、2D-NMR技術(shù)，進(jìn)一步給出非目標(biāo)物的結(jié)構(gòu)信息，完成對待測樣品中非目標(biāo)物的篩查和定性分析，使被動檢測風(fēng)險(xiǎn)變?yōu)橹鲃拥陌l(fā)現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)，為食品安全監(jiān)控工作提供了一條新思路。

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Determination of Total Conjugated Linoleic Acid Content in Cheeses by Quantitative Nuclear Magnetic Resonance (QNMR)

LI Wei, JIANG Jie, LU Yong, HE Tao, LI Long, WANG Zhen
(Beijing Municipal Center for Food Safety Monitoring and Risk Assessment, Beijing 100041, China)

Objective: To establish a method for the determination of total conjugated linoleic acid (CLA) content in cheeses by quantitative nuclear magnetic resonance (QNMR) and to compare its effectiveness with that of ultraviolet spectrophotometry. Methods: The analysis employed 1,2,4,5-tetramethylbenzene as internal standard, and a 5-mm Bruker broadband observe (BBO) probe, working at 300 K with a pulse sequence of Noesyig1d, 128 scans and a pulse delay time (D1) of 10 s. Results: The recovery rate was 93.33% with relative standard deviation (RSD) of 4.20%. The precision RSD was 0.99%, the reproducibility RSD was 3.17% and the stability RSD was 1.81%. Conclusion: This method enables direct determination of target and non-target compounds in foods without using standard reference. Compared with ultraviolet spectrophotometry, it had a higher specifi city.

quantitative nuclear magnetic resonance (QNMR); cheeses; conjugated linoleic acid (CLA); quantitation

TS201.2

A

10.7506/spkx1002-6630-201510027

2014-09-15

首都食品安全科技創(chuàng)優(yōu)培育專項(xiàng)(Z141100002614013)；北京市優(yōu)秀人才培養(yǎng)資助項(xiàng)目(20140000204400001)

李瑋(1984—),女,高級工程師,博士,研究方向?yàn)槭称窢I養(yǎng)與安全。E-mail：liwei@bjmu.edu.cn