沙棘果渣總黃酮提取工藝及抗氧化活性分析

白生文,湯 超,田 京,閆宏斐,許曉莎,范惠玲

(河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院,甘肅 張掖 734099)

沙棘果渣總黃酮提取工藝及抗氧化活性分析

白生文,湯 超,田 京,閆宏斐,許曉莎,范惠玲*

(河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院,甘肅 張掖 734099)

利用超聲波輔助提取技術(shù)對河西走廊沙棘榨汁提油后的果渣下腳料總黃酮提取工藝進行優(yōu)化，同時考察果渣黃酮提取液的還原力和清除羥自由基和超氧陰離子自由基的能力。通過單因素試驗和L9（34）正交試驗，得到影響黃酮得率的主要因素及其影響力大小為乙醇體積分數(shù)＞提取時間＞料液比；確定最佳提取條件為乙醇體積分數(shù)60%、提取時間40 min、料液比1∶50(g/mL)；此條件下，河西走廊沙棘果渣中總黃酮提取率為2.55%，果皮渣中總黃酮提取率為0.651%，沙棘籽粕中總黃酮提取率為1.901%。當質(zhì)量濃度大于0.151 4 mg/mL時，沙棘果渣黃酮提取液的還原力大于VC的還原力；沙棘果渣黃酮提取液對羥自由基和超氧陰離子自由基均有一定的清除作用，其對羥自由基的清除率為39.07%～42.01%，大于同等質(zhì)量濃度VC的清除作用，而對超氧陰離子自由基的清除率為47.17%～60.38%，小于同等質(zhì)量濃度VC的清除作用，說明沙棘果渣黃酮提取液對羥自由基有更強的清除能力。

沙棘果渣；黃酮；提取工藝；抗氧化性

沙棘（Hippopphae rhamnoides L.）又名醋柳、酸刺、黑刺，為胡頹子科沙棘屬落葉灌木或小喬木[1]。沙棘黃酮是沙棘的主要藥用成分[2]，具有清除超氧陰離子自由基及羥自由基[3]、防癌抗癌[4]、抗腫瘤[5]、抗心血管疾病[6]、抗骨質(zhì)疏松[7]、雌激素樣與抗雌激素樣的作用[8]以及調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)[9]，廣泛存在于沙棘果、葉、莖、根等不同器官中[10]。

甘肅省現(xiàn)有沙棘林面積416多萬畝，其中河西走廊的沙棘林主要分布在張掖市各縣區(qū)[11]。目前，甘肅省各沙棘加工企業(yè)主要是為國內(nèi)外加工沙棘濃縮汁、沙棘果醬、沙棘油等原料產(chǎn)品，同時也產(chǎn)生了大量的沙棘果渣。據(jù)測定，沙棘果渣中含有大量的營養(yǎng)物質(zhì)[12]，高玲[13]的研究表明沙棘果渣中黃酮的含量也相當高，有些品種甚至高于其在沙棘汁與沙棘油中的含量[14]。若將總黃酮含量較高的果渣棄去不用或作為飼料低價銷售，這無疑是資源浪費。至今，從沙棘果渣中提取黃酮類化合物的研究已有不少報道[15-18]，而采用超聲波輔助法分別從河西走廊沙棘籽粕和沙棘果皮渣中提取黃酮類化合物的研究至今未見報道。因此，研究沙棘果渣總黃酮的提取對延伸沙棘加工產(chǎn)業(yè)鏈，提升沙棘開發(fā)利用的經(jīng)濟價值具有積極意義。

近年來，關(guān)于氧自由基的生理功能和毒性，以及清除自由基的抗氧化劑的研究普遍受到人們的關(guān)注[19-20]，而且由于合成抗氧化劑的潛在毒副作用，使得尋找安全、高效的天然抗氧化劑已成為人們研究的熱點之一。目前有關(guān)沙棘果渣黃酮提取液抗氧化性能的研究報道很少。鑒于此，本研究利用沙棘果渣下腳料為原料，采用單因素及正交設(shè)計試驗方法，對超聲波輔助提取沙棘果渣中黃酮類化合物的提取條件進行了研究，以確定最佳的工藝條件。同時，以VC為對照，對沙棘果渣黃酮提取液的還原性和氧自由基的清除效果進行了測定，評價其在體外抗氧化活性的強弱，以期為開發(fā)新的天然抗氧化劑和合理利用沙棘資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙棘果渣 張掖市某生物科技開發(fā)有限公司。

蘆丁標準品、亞硝酸鈉、硝酸鋁、三氯化鐵、雙氧水、鐵氰化鉀、鄰苯三酚、VC、三氯乙酸、水楊酸等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-250B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；UV-1750紫外-可見分光光度計 蘇州島津儀器有限公司；TGL-16G高速臺式離心機 上海賢德實驗儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱 浙江璽袁科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準曲線的制作和回歸方程的建立

精確稱取200 mg經(jīng)120 ℃烘干至恒質(zhì)量的蘆丁標準品，用30%乙醇溶解并定容至100 mL即為標準液。

精密量取蘆丁標準溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL于7 支25 mL容量瓶中，再分別加入0.7 mL 5% NaNO2溶液，搖勻，放置6 min后加入0.7 mL 10% Al(NO3)3溶液，6 min后再加入10 mL 1 mol/L的NaOH溶液，混勻，用30%乙醇稀釋至刻度，15 min后于波長510 nm處測定吸光度，0.0 mL為空白對照，測得不同質(zhì)量濃度的吸光度。以吸光度為縱坐標，標準溶液質(zhì)量濃度為橫坐標，繪制標準曲線[21]，并以吸光度對質(zhì)量濃度進行運算，得到回歸方程:y=10.157x，R2=0.999 8。

1.3.2 沙棘果渣黃酮提取及含量測定

沙棘果渣、果皮渣和籽粕樣品的制備:張掖市某生物科技開發(fā)有限公司生產(chǎn)沙棘果汁后的果渣下腳料，分成2 份，其中一份烘干粉碎，過60 目篩，裝瓶后置干燥器中備用。另一份將果皮渣和籽粕分開，烘干粉碎，過60 目篩，裝瓶后置干燥器中備用。

準確稱取沙棘果渣干粉0.08 g于10 mL離心管中，按一定料液比的乙醇溶液，一定功率超聲和一定時間提取類黃酮。提取液在20 ℃條件下8 000×g離心10 min，濾渣以同樣條件提取、離心、合并上清液，然后用乙醇溶液定容為25 mL。取定容后樣品各0.5 mL檢測，每個實驗在相同條件下提取3 個平行樣。

用制作標準曲線同樣方法測定沙棘果類黃酮的吸光度，根據(jù)標準曲線的回歸方程計算得黃酮質(zhì)量濃度，再根據(jù)公式（1）計算類黃酮提取率:

1.3.3 單因素試驗設(shè)計

乙醇體積分數(shù)為30%、40%、50%、60%、70%和80%共6 個水平；料液比（g/mL）為l∶20、1∶30、l∶40、1∶50、1∶60和1∶70共6 個水平；超聲波浸提時間為10、20、30、40、50 min和 60 min共6 個水平；提取次數(shù)為1、2、3次和4 次共4 個水平，以沙棘果渣干粉為原料，分別進行單因素試驗。

1.3.4 正交試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇乙醇體積分數(shù)、料液比、浸提時間，分別設(shè)計3 個水平，以沙棘果渣為原料進行正交試驗，每個試驗重復(fù)3 次，確定沙棘果渣黃酮提取的最佳工藝條件。

1.3.5 沙棘果渣黃酮還原力測定[22]

普魯士蘭法測定樣品的還原力:取一定體積（0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 mL）的沙棘果渣樣品液于10 mL棕色容量瓶中，加入質(zhì)量濃度1 g/100 mL的鐵氰化鉀和磷酸鹽（pH 6.5）溶液各1.0 mL，搖勻，混合液于50 ℃水浴20 min，取出后急速冷卻。加入1.0 mL質(zhì)量濃度10 g/100 mL的三氯乙酸溶液，搖勻，靜置10 min后，再加入質(zhì)量濃度0.1 g/100mL的三氯化鐵與蒸餾水各1.0 mL，無水乙醇定容，靜置10 min，分光光度計于700 nm波長處測定吸光度。重復(fù)3 次，取平均值。

1.3.6 沙棘果渣黃酮對羥自由基清除率的測定[23]

將沙棘果渣黃酮提取液依次按1∶5、1∶10、1∶15、1∶20和1∶25稀釋，得到不同質(zhì)量濃度的樣品醇溶物。精確吸取3 mL不同質(zhì)量濃度（0.498、0.623、0.830 7、1.246、2.49 mg/L）樣品醇溶物于試管中，依次向試管中加入2 mL 0.1 mol/L FeSO4、2 mL 0.1 mol/L水楊酸、2 mL 0.1 mol/L H2O2，用蒸餾水定容至10 mL并搖勻，在37 ℃條件下恒溫加熱30 min后在510 nm波長處測定其吸光度Aa；將體系中樣品用3 mL無水乙醇代替，在相同條件下測定其吸光度A0；將體系中H2O2用蒸餾水代替在相同條件下測定其吸光度Ab。用等質(zhì)量濃度的VC代替樣品做對照，按式（2）計算清除率（E）:

1.3.7 沙棘果渣黃酮對超氧陰離子自由基清除率的測定[22]

取6 支10 mL離心管各加入pH 8.2的50 mmol/L Tris-HC1緩沖液4.5 mL，再分別加入果渣提取液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，然后依次加蒸餾水1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0.0 mL，混勻后在25 ℃恒溫水浴中保溫20 min，取出后立即加入在25 ℃預(yù)熱過的3 mmol/L鄰苯三酚溶液0.3 mL啟動反應(yīng)。5 min后加10 mol/L鹽酸溶液0.2 mL終止反應(yīng)。同時另取6 支離心管，按上述步驟依次加入Tris-HCl緩沖液、黃酮提取液和蒸餾水，然后分別加10 mmol/L鹽酸溶液0.3 mL，5 min后加10 mol/L鹽酸溶液0.2 mL終止反應(yīng)，搖勻。在325 nm波長處檢測吸光度。按照式（3）計算沙棘果渣黃酮提取液對超氧陰離子自由基的清除率:

式中:A1為不含樣品的吸光度；A2為不含樣品和鄰苯三酚的吸光度；A3為含樣品的吸光度；A4為含樣品，但不含鄰苯三酚的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙棘果渣黃酮提取單因素試驗結(jié)果

2.1.1 料液比對黃酮提取率的影響

準確稱取一定量的沙棘果渣粉末，固定乙醇體積分數(shù)60%、超聲功率250 W、提取時間30 min，分別選擇料液比為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70進行實驗。圖1顯示，當料液比小于1∶40時，黃酮提取率上升較緩慢，而當繼續(xù)增大溶劑用量比例，使其達到1∶50時，黃酮提取率達到2.004%；但當料液比超過1∶50時，隨提取液用量增大，類黃酮提取率變化很小。

料液比實際上是溶劑的用量大小。一般來說，溶劑的用量越大，提取率也越大。但當料液比增加到一定程度后，一定比例的溶劑將有效成分基本溶出，因此提取率不再上升或趨于穩(wěn)定。而且乙醇用量過多，會造成有機溶劑的浪費，并使后續(xù)樣品濃縮時間耗時過長。因此，從提取率、溶劑用量和生產(chǎn)成本等角度綜合考慮，選擇料液比1∶50～1∶70作為進一步優(yōu)化的范圍。

2.1.2 乙醇體積分數(shù)對黃酮提取效果的影響

準確稱取一定量的沙棘果渣粉末，固定料液比1∶50、超聲功率250 W、提取時間30 min，分別選擇乙醇體積分數(shù)30%、40%、50%、60%、70%和80%進行試驗。圖2顯示，當乙醇體積分數(shù)較低時，沙棘果渣黃酮提取率隨著乙醇體積分數(shù)的增大而逐漸增加；當乙醇體積分數(shù)為60%時，提取率達到最大（1.942%）；而后隨著乙醇體積分數(shù)的繼續(xù)增大，黃酮提取率緩慢降低。

沙棘果渣黃酮提取率隨乙醇體積分數(shù)的增大先增加后降低，其原因可能在于乙醇溶解性好，細胞穿透力強，當用較高體積分數(shù)的乙醇處理材料時，組織細胞內(nèi)外的濃度差變大，有利于黃酮的溶出。但是，當乙醇體積分數(shù)過高時，會使有些醇溶性的色素，親脂性強的成分溶出量增加，這些成分會競爭同乙醇-水分子結(jié)合，導(dǎo)致黃酮與乙醇-水分子結(jié)合的可能性下降，使提取率呈現(xiàn)出降低的趨勢。綜上，在正交試驗中應(yīng)選擇50%～70%的乙醇作為優(yōu)化的參考范圍。

2.1.3 浸提時間對黃酮提取效果的影響

準確稱取一定量的沙棘果渣粉末，固定乙醇體積分數(shù)60%、料液比1∶50、超聲功率250 W，分別選擇10、20、30、40、50、60 min進行試驗。

從圖3可知，隨著提取時間的延長，黃酮提取率逐漸增加，且增幅明顯。當浸提時間為30 min時，黃酮提取率達到1.674%。當繼續(xù)延長浸提時間，提取率以平緩的幅度增加，在浸提50 min時的提取率比30 min的僅提高了0.104%。這可能是由于:1）在提取的初始階段，由于原料和提取液2個體系間存在濃度差，提取率隨浸提時間的延長而增加，當達到一定時間后，原料內(nèi)外黃酮質(zhì)量濃度達到相對平衡的狀態(tài)，原料內(nèi)的黃酮不容易被繼續(xù)浸出，提取率趨于穩(wěn)定。2）由于提取時間的延長，造成其他醇溶性物質(zhì)的溶解，從而影響了黃酮類化合物的提取。綜上，考慮到浸提時間越長，能耗及經(jīng)濟成本越大，因此在進行正交試驗時，選擇30～50 min進行優(yōu)化。

2.1.4 提取次數(shù)對提取效果的影響

在以上最佳單因素條件下，將原料進行多次浸提比較黃酮提取率。由圖4可知，隨著提取次數(shù)的增多，沙棘果渣黃酮提取率逐漸上升。當提取2 次后，提取率隨提取次數(shù)的增加上升幅度緩慢，浸提3、4 次的黃酮提取率分別比2 次的僅提高了0.028%、0.009%。這可能是由于隨著提取次數(shù)的增加沙棘果渣中黃酮類物質(zhì)已基本溶出。同時，提取次數(shù)過多會給后續(xù)的濾液濃縮帶來困難。因此，正交試驗中采用2 次浸提。

2.2 沙棘果渣黃酮提取正交試驗結(jié)果及分析

由表1的極差分析結(jié)果可知，各因素對沙棘果渣黃酮提取率的影響程度各不相同，主次順序為B＞C＞A，即乙醇體積分數(shù)對黃酮提取率的影響最大，其次是提取時間，而料液比對黃酮提取率的影響最小。由直觀分析確立的最佳組合為A1B2C2，即料液比1∶50、乙醇體積分數(shù)60%、浸提時間40 min，最大提取率可達2.472%。由表1還可知，當采用同樣的提取條件時，沙棘籽粕中黃酮提取率近乎是果皮渣中的2 倍，說明河西走廊沙棘果渣中的黃酮類化合物主要在沙棘籽中存在。

根據(jù)獲得的最佳提取工藝條件，首先對沙棘果渣中的黃酮進行了提取，提取率達2.55%，均大于表1中9 個試驗的提取結(jié)果。然后采用上述最佳提取工藝分別提取了沙棘籽粕、果皮渣中的黃酮，提取率分別為1.901%、0.651%。

2.3 沙棘果渣黃酮提取液的還原力和抗氧化活性

2.3.1 沙棘果渣黃酮提取液鐵離子還原力分析

由圖5可知，沙棘果渣黃酮提取液與VC的吸光度都隨質(zhì)量濃度的增大而上升，吸光度越高，說明這種反應(yīng)混合物的還原性越強。當質(zhì)量濃度很低（0.075 7 mg/L）時，沙棘果渣黃酮提取液的鐵離子還原力小于VC的，但當質(zhì)量濃度介于0.151 4～0.605 6 mg/L范圍內(nèi)時，沙棘果渣黃酮還原力較VC還原力強。

2.3.2 沙棘果渣黃酮提取液清除羥自由基能力分析

羥自由基是最活潑、毒性最大的自由基，可與活細胞中的任何分子發(fā)生反應(yīng)，引發(fā)組織細胞病變，導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生和機體衰老，且反應(yīng)速度非?？靃24]。黃酮類抗氧化作用是通過酚羥基與自由基反應(yīng)，形成共振穩(wěn)定的半錕式自由基而中斷鏈式反應(yīng)[25]。由圖6可知，在所選質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，沙棘果渣黃酮提取液和VC清除羥自由基的能力均與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，黃酮提取液對羥自由基的清除率為39.07%～42.01%，大于VC對羥自由基的清除率（37.78%～39.25%）。在0.498～0.831 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，沙棘果渣黃酮清除率增幅緩慢，當其質(zhì)量濃度為2.49 mg/L時，清除率達到42.01%，明顯大于同等質(zhì)量濃度VC的清除率（39.25%）。

2.3.3 沙棘果渣黃酮提取液清除超氧陰離子自由基能力分析

生物體內(nèi)的氧化還原反應(yīng)中，大致有2%～5%的氧會產(chǎn)生超氧陰離子自由基，其是機體內(nèi)壽命最長的自由基，通常作為自由基鏈式反應(yīng)的引發(fā)劑，產(chǎn)生活性更強的羥自由基，進一步對機體造成危害[24]。由圖7可知，在所選質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，體系中加入不同質(zhì)量濃度的沙棘果渣黃酮提取液、VC后，清除率均呈現(xiàn)上升趨勢。這說明沙棘果渣黃酮提取液對超氧陰離子自由基有抑制作用，抑制率與質(zhì)量濃度有關(guān)，加入樣品的質(zhì)量濃度越大，對超氧陰離子自由基的抑制作用越強。沙棘果渣黃酮提取液對超氧陰離子自由基的清除率為47.17%～60.38%，明顯小于同等質(zhì)量濃度VC對超氧陰離子自由基的清除率（64.78%～87.42%）。

圖6和圖7的結(jié)果還表明，沙棘果渣黃酮提取液對兩種自由基的清除率明顯不同，其對超氧陰離子自由基的清除能力明顯大于對羥自由基的清除能力。

3 結(jié) 論

通過沙棘果渣黃酮提取單因素試驗，確定比較好的因素水平為料液比1∶50、乙醇體積分數(shù)60%、浸提時間30 min、提取2 次。

采用超聲波輔助提取法對沙棘果渣黃酮進行了提取，通過正交試驗，得到影響黃酮提取率的提取因素的影響力大小為:乙醇體積分數(shù)＞提取時間＞料液比。通過單因素試驗和正交試驗對沙棘果渣黃酮超聲輔助提取工藝進行優(yōu)化，得到最佳提取條件為料液比為1∶50、乙醇體積分數(shù)60%、提取時間40 min。在此條件下得到河西走廊沙棘果皮渣中黃酮提取率為0.651%，沙棘籽粕中黃酮提取率為1.901%。

黃酮類化合物存在于沙棘的所有部位，其中果汁為365 mg/100 g，沙棘葉為876 mg/100 g，沙棘油為1 065.2 mg/100 g，沙棘果泥中黃酮含量達到2 080 mg/100 g[26]，含量極其豐富。本實驗的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，河西走廊沙棘果渣中的總黃酮提取率達到了2.55%，與已有研究結(jié)果相比，達到了提取沙棘果渣中黃酮的目的。

張穎等[27]的研究結(jié)果表明，泰山沙棘黃酮能有效清除羥自由基和超氧陰離子自由基，且隨著黃酮質(zhì)量濃度的升高，對羥自由基的清除率和對超氧離子自由基的抑制率也增大。本研究通過還原力和自由基清除率測定實驗，表明河西走廊沙棘果渣黃酮類化合物對生物體內(nèi)常見的2 種氧自由基都具有一定的清除作用，隨著黃酮質(zhì)量濃度的增大，對自由基的清除能力也增強；研究結(jié)果還表明其對超氧陰離子自由基的清除作用強于對羥自由基的清除作用，這可能與黃酮對2 種氧自由基的作用機理不一樣有關(guān)。

總之，本研究結(jié)果表明，河西走廊沙棘果渣中含有較豐富的黃酮類化合物。由于黃酮類化合物既能作為食品添加劑延緩脂肪的氧化，又可用于防治自由基引發(fā)的多種疾病。因此，河西走廊沙棘果渣在天然抗氧化劑和功能食品的開發(fā)方面，醫(yī)學(xué)產(chǎn)品的研制方面都有良好的應(yīng)用前景，這將為利用該資源進行工業(yè)化生產(chǎn)黃酮類藥物提供參考依據(jù)，也為進一步深入研究河西走廊沙棘的應(yīng)用價值提供理論支持。

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Extraction and Antioxidant Activity of Total Flavonoids from Sea Buckthorn Pomace

BAI Shengwen, TANG Chao, TIAN Jing, YAN Hongfei, XU Xiaosha, FAN Huiling*
(College of Agriculture and Biotechnology, Hexi University, Zhangye 734099, China)

The aim of the current study was to optimize the extraction conditions for total ?avonoids from sea buckthorn (Hippopphae rhamnoides L.) pomace (the leftover residue from juice making) by orthogonal array design. The antioxidant activity of the total flavonoids extracted was assessed by hydroxyl radical and superoxide anion radical scavenging, and reducing power assays, respectively. Ethanol concentration, extraction time and the ratio of material to solvent were identi?ed as three main variables that affect extraction ef?ciency by signal factor experiments, and these factors were further optimized to be 60%, 40 min and 1:50 (g/mL), respectively, using orthogonal array design. Under the optimized conditions, the predicted extraction yield of total flavonoids from sea buekthom pomace was 2.55%. The total ?avonoids had strong reducing power, and exhibited a more powerful scavenging effect against superoxide anion radical than against hydroxyl radical.

sea buckthorn pomace; flavonoids; extraction process; antioxidation

Q586

A

10.7506/spkx1002-6630-201510012

2014-09-24

河西學(xué)院大學(xué)生科技創(chuàng)新項目(2013-124)

白生文(1975—),男,副教授,碩士,研究方向為植物抗性生理生化、生物質(zhì)資源開發(fā)與利用。

E-mail：bsw4588384@163.com

*通信作者：范惠玲(1980—),女,副教授,碩士,研究方向為生物化學(xué)。E-mail：qianjing05@163.com