響應(yīng)面法優(yōu)化草魚內(nèi)臟蛋白質(zhì)酶解工藝

叢艷君，于曉鳳，陳 澍

(1.北京工商大學(xué)食品學(xué)院,北京 100048；2.北京工商大學(xué) 北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室,北京 100048；3.北京工商大學(xué) 食品添加劑與配料北京高校工程研究中心,北京 100048)

響應(yīng)面法優(yōu)化草魚內(nèi)臟蛋白質(zhì)酶解工藝

叢艷君1,2，于曉鳳1,2，陳 澍1,3

(1.北京工商大學(xué)食品學(xué)院,北京 100048；2.北京工商大學(xué) 北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室,北京 100048；3.北京工商大學(xué) 食品添加劑與配料北京高校工程研究中心,北京 100048)

為實(shí)現(xiàn)草魚內(nèi)臟蛋白質(zhì)的高值化利用，本研究在單因素試驗基礎(chǔ)上應(yīng)用響應(yīng)面試驗優(yōu)化了木瓜蛋白酶水解脫脂草魚內(nèi)臟蛋白質(zhì)的條件，響應(yīng)面法分析得出4 個影響因素的最佳組合為加酶量33 015 U/g、酶解溫度62.35 ℃、酶解時間5.37 h、酶解pH 7.9，此時水解度為44.48%，肽得率為19.68%，水解液鮮味較明顯。

草魚內(nèi)臟；蛋白質(zhì)；水解；響應(yīng)面試驗；優(yōu)化

我國淡水魚養(yǎng)殖業(yè)雖然發(fā)達(dá)，但是水產(chǎn)品加工率不到10%[1-2]，在魚加工制品的廢棄物中，蛋白質(zhì)、脂肪和酶類含量較高的內(nèi)臟的加工尤其未得到重視[3-5]，這不僅造成了資源的浪費(fèi)，而且污染環(huán)境，給環(huán)境帶來巨大負(fù)擔(dān)[6]。草魚是四大家魚之一，草魚內(nèi)臟蛋白質(zhì)中必需氨基酸的含量占總氨基酸含量的41.56%左右，除了硫氨酸的含量較低外，其他氨基酸的含量均接近或超過全蛋蛋白，尤其以賴氨酸的含量最高為7.6%[7]。

利用酶水解技術(shù)加工魚內(nèi)臟和提取活性成分[8-9]，可減少資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[10]、提高魚內(nèi)臟的質(zhì)量、改善其營養(yǎng)價值和提升魚內(nèi)臟的加工利用率，同時滿足市場對高附加值魚類制品的需求，具有重要的經(jīng)濟(jì)和社會意義。國內(nèi)在應(yīng)用微生物發(fā)酵制備傳統(tǒng)調(diào)味品如醬油、魚露等方面工藝成熟[11]，而應(yīng)用生物技術(shù)（主要是酶技術(shù)）深加工農(nóng)產(chǎn)品起步晚，基礎(chǔ)和應(yīng)用基礎(chǔ)薄弱[12-13]。目前各種動植物原料的生物技術(shù)應(yīng)用主要集中在采用各種特異性酶探索作用效果、蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物加工功能特性研究方面，對各種呈味肽的分離純化以及功效研究尚處于初步階段，市場上國產(chǎn)的呈味肽產(chǎn)品寥寥無幾[14-16]。本課題組前期研究了木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶水解草魚內(nèi)臟蛋白質(zhì)的特性，發(fā)現(xiàn)6 種酶解液中氨基酸和多肽含量較豐富，感官評價結(jié)果表明，使用風(fēng)味蛋白酶的水解液鮮味最強(qiáng)，其次為木瓜蛋白酶，這為實(shí)現(xiàn)草魚內(nèi)臟的高值化利用提供了思路[17]。基于前期基礎(chǔ)，本課題應(yīng)用響應(yīng)面試驗優(yōu)化木瓜蛋白酶水解脫脂草魚內(nèi)臟蛋白質(zhì)的條件，以期為后續(xù)的應(yīng)用研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草魚 北京市四道口水產(chǎn)品批發(fā)市場。

木瓜蛋白酶（酶活力4 982 U/g） 美國Sigma公司；乙醚、濃硫酸、鹽酸、硼酸、硫酸鉀、溴甲酚綠、甲基紅 北京化學(xué)試劑公司；氫氧化鈉 西隴化工股份有限公司；甲醛 天津市永大化學(xué)試劑公司；硫酸銅 天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司。實(shí)驗所用試劑均為化學(xué)純。

1.2 儀器與設(shè)備

DKB-501A超級恒溫水槽 上海精宏實(shí)驗設(shè)備有限公司；PHS-3D功能型pH計 上海三信儀表廠；TB214型電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；CR22G型離心機(jī) 日本Hitachi公司；Kejeltic 2100型凱氏定氮儀 瑞士Foss公司；D2004W電動攪拌器 上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；Spectrumlab 22pc可見分光光度計 上海棱光技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 脫脂草魚內(nèi)臟蛋白質(zhì)酶解液的制備

將去除膽囊和魚鰾的草魚內(nèi)臟清洗，絞碎，置于95 ℃水浴鍋中20 min，滅內(nèi)源酶活。冷卻后按1∶1（g/mL）加入去離子水，在4 ℃、8 000 r/min的條件下離心10 min，去除上層液體，收集下層沉淀。重復(fù)上述操作，即得到粗脫脂草魚內(nèi)臟蛋白質(zhì)，凍干備用。

1.3.2 酶解單因素試驗

以脫脂草魚內(nèi)臟蛋白質(zhì)為底物恒溫水浴酶解，控制加酶量、酶解溫度、酶解時間、酶解pH值，酶解結(jié)束時將酶解液在95 ℃水浴中滅酶15 min。

1.3.3 響應(yīng)面試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，結(jié)合單因素試驗結(jié)果，對4 個因素加酶量（X1）、酶解溫度（X2）、酶解時間（X3）、酶解pH值（X4）在-1、0、1這3 個水平上進(jìn)行優(yōu)化。試驗因素與水平設(shè)計見表1。

1.3.4 水解度的測定

以甲醛電位滴定法[18]測定氨基酸態(tài)氮含量；水解度計算如式（1）所示。

1.3.5 肽得率的測定

1.3.6 酶解液的脫色脫腥處理

酶解液在pH 4.0、溫度50 ℃、粉狀活性炭用量0.5%條件下水浴振蕩40 min進(jìn)行脫色脫腥，離心，取上清液進(jìn)行感官評價。

1.3.7 感官評價

感官評價采用排序檢驗法測定[19-21]。10 mmol/L谷氨酸鈉作為對照樣品,鮮味標(biāo)準(zhǔn)是“中”,并通過水浴加熱保持對照、樣品溫度在40 ℃左右。評定小組包含12 名感官評價員(6 男6 女,23～50 歲),評定小組人員均受過相關(guān)培訓(xùn),能夠嘗出標(biāo)準(zhǔn)品的鮮味,將酶解液作為品嘗對象,比較待測樣品與對照樣品中鮮味感差別,評價其鮮味。酶解液放入口中15 s吐出,每個樣品給兩次,打分采用五分制,取平均值。評定前用清水漱口,評定時拒絕交流,且樣品需用帶中性的文字標(biāo)明,避免主觀評價。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Design-Expert 8.0.5軟件，進(jìn)行響應(yīng)面試驗設(shè)計及數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 加酶量的確定

取凍干脫脂草魚內(nèi)臟蛋白質(zhì)，按底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%加入水，調(diào)酶解pH 7.5，分別按20 000、25 000、30 000、35 000、40 000 U/g加入木瓜蛋白酶，在60 ℃條件恒溫振蕩酶解6 h，95 ℃終止酶反應(yīng)，常溫取樣測定其水解度和肽得率。

由圖1可知，水解度隨著加酶量的增加升高速率較為緩慢，差異不顯著（P＞0.05），這主要是由于隨著加酶量的增加，酶已逐漸被底物所飽和，酶促反應(yīng)速率趨向最大值。肽得率在加酶量為30 000 U/g達(dá)到最大值20.99%，隨后有下降的趨勢，原因在于酶量的增加使得酶與底物的接觸更加充分，底物被進(jìn)一步酶解為小分子肽和游離氨基酸，不同加酶量條件下肽得率差異顯著（P＜0.05）。綜合考慮，30 000 U/g的加酶量水解程度和肽得率都較佳。

2.2 酶解溫度的確定

取凍干脫脂草魚內(nèi)臟蛋白質(zhì)，按底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%加入水，調(diào)酶解pH 7.5，按30 000 U/g加入木瓜蛋白酶，分別在50、55、60、65、70 ℃條件下，恒溫振蕩酶解6 h，95 ℃終止酶反應(yīng)，常溫取樣測定其水解度和肽得率。

由圖2可知，酶解溫度50～60 ℃，水解度和肽得率都不斷升高，但超過60 ℃之后，水解度和肽得率明顯下降，不同酶解溫度條件下水解度和肽得率差異均顯著（P＜0.05）。溫度是影響酶促反應(yīng)的一個重要因素，隨著溫度的升高會加快酶促反應(yīng)，但是當(dāng)溫度超過了酶的最適反應(yīng)溫度時會降低反應(yīng)的速率，木瓜蛋白酶的最適反應(yīng)溫度是60 ℃。

2.3 酶解時間的確定

取凍干脫脂草魚內(nèi)臟蛋白質(zhì)，按底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%加入水，調(diào)酶解pH 7.5，按30 000 U/g加入木瓜蛋白酶，分別恒溫振蕩酶解4、5、6、7、8 h終止酶反應(yīng)，常溫取樣測定其水解度和肽得率。

由圖3可知，隨著酶解時間的延長，水解度不斷的提高，酶解5 h的效果較酶解4 h的有明顯的提高，5 h之后水解度的增加比較緩慢。而肽得率在酶解5 h時達(dá)到最大值23.19%，而后有明顯的下降趨勢，7～8 h下降趨于平緩，不同時間水解度和肽得率差異均顯著（P＜0.05），因此確定最適酶解時間為5 h。

2.4 酶解pH值的確定

取凍干脫脂草魚內(nèi)臟蛋白質(zhì)，按底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%加入水，分別調(diào)酶解pH 6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，按30 000 U/g加入木瓜蛋白酶，在60 ℃條件恒溫振蕩酶解6 h，95 ℃終止酶反應(yīng)，常溫取樣測定其水解度和肽得率。

由圖4可知，當(dāng)pH值小于7.5時，水解度與肽得率較低，pH 7.5時水解度和肽得率均達(dá)到最大值，分別是41.86%和20.99%，當(dāng)pH值達(dá)到7.5以后水解度與肽得率不再增加，開始逐漸降低，不同pH值條件下水解度、肽得率差異均顯著（P＜0.05）。因此木瓜蛋白酶反應(yīng)的最適pH 7.5。

2.5 響應(yīng)面分析法優(yōu)化草魚內(nèi)臟蛋白質(zhì)的水解條件

以加酶量(X1)、酶解溫度(X2)、酶解時間(X3)、酶解pH值(X4)為自變量,以水解度、肽得率為響應(yīng)值,響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果見表3。

2.5.1 水解度為響應(yīng)值的響應(yīng)面試驗優(yōu)化

方差分析和酶解各因素的顯著性比較結(jié)果見表4 。

利用Design-Expert軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，對各因素回歸擬合后，得到回歸方程為:

用上述回歸方程描述各因素與水解度之間的關(guān)系時，其因素和全體自變量之間的線性關(guān)系顯著（R2=0.814 6），模型達(dá)極顯著水平（P＜0.01）。模型中X1、X32、X1X3對水解度的影響極顯著，X2、X3、X4對水解度的影響顯著。而失擬項P=0.103 9＞0.05，不顯著，說明方程對試驗擬合較好，因此用此方程模型來模擬四因素與響應(yīng)值的關(guān)系是可行的。

圖5顯示了6 組試驗參數(shù)以水解度為響應(yīng)值的趨勢圖。由圖5B、5D、5F的等高線圖可以看出，酶解時間與加酶量、酶解溫度、酶解pH值的交互作用顯著。只有在加酶量、酶解溫度、酶解時間和酶解pH值適宜的情況下，脫脂草魚內(nèi)臟的水解度才會達(dá)到最大值。

2.5.2 肽得率為響應(yīng)值的響應(yīng)面試驗優(yōu)化

方差分析和酶解各因素的顯著性比較結(jié)果見表5。

利用Design-Expert軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，對各因素回歸擬合后，得到回歸方程為:

用上述回歸方程描述各因素與肽得率之間的關(guān)系時，其因素和全體自變量之間的線性關(guān)系顯著（R2=0.919 8），模型達(dá)極顯著水平（P＜0.01）。模型中X1、X3、、、、、X1X3、X3X4對肽得率的影響極顯著，X2、X4、X1X2對肽得率的影響顯著。而失擬項P=0.261 6＞0.05，不顯著，說明方程對試驗擬合較好，因此用此方程模型來模擬四因素與響應(yīng)值的關(guān)系是可行的。

圖6中各圖分別顯示了6組試驗參數(shù)以肽得率為響應(yīng)值的趨勢圖。由圖6B、D、F的等高線圖可以看出，酶解時間與加酶量、酶解溫度、酶解pH值的交互作用顯著。只有在加酶量、酶解溫度、酶解時間和酶解pH值都適宜的情況下，脫脂草魚內(nèi)臟的肽得率才會達(dá)到最大值。

2.5.3 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果及驗證

經(jīng)響應(yīng)面法分析得出4 個影響因素的最佳組合為加酶量33 015 U/g、酶解溫度62.35 ℃、酶解時間5.37 h、酶解pH 7.9，此時的水解度達(dá)到44.65%，肽得率為18.49%，感官評分為2.16。為了檢驗?zāi)Ｐ皖A(yù)測的準(zhǔn)確性，在最佳酶解條件下進(jìn)行實(shí)驗，實(shí)際測得的水解度為44.48%，肽得率為19.68%，感官評分為2，即總體風(fēng)味柔和，鮮味強(qiáng)度適中?？梢娫撃Ｐ湍茌^好的預(yù)測草魚內(nèi)臟蛋白質(zhì)的酶解情況。

3 討論與結(jié)論

近年來，我國食品工業(yè)面臨著來自資源和環(huán)境的雙重壓力，對現(xiàn)有蛋白質(zhì)資源，特別是對大宗低值蛋白資源的精深加工，是解決長期以來嚴(yán)重制約我國食品工業(yè)發(fā)展問題的必要途徑。國內(nèi)關(guān)于低值魚加工副產(chǎn)物綜合利用的研究不斷增多，也相應(yīng)取得了較為突出的進(jìn)展，但綜合利用整體水平并未顯著提高，未能在大范圍深層次內(nèi)實(shí)現(xiàn)高值化綜合利用。魚腥味的殘留已經(jīng)成為阻礙低值魚加工副產(chǎn)物產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的重要因素，因此未來的研究應(yīng)進(jìn)一步的完善，以解決這些問題為目的[22]。喬路等[23]研究了中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶制備鮑魚臟器呈味肽及呈味氨基酸的最佳條件，中性蛋白酶酶解產(chǎn)物的水解度和肽得率最大，鮮味氨基酸含量最高且口味最好。Benjakul等[2]利用堿性蛋白酶酶解太平洋白魚下腳料得到了高含量的蛋白質(zhì)（79.97%）。余杰等[24]酶解鰻魚下腳料得到的蛋白提取物具有營養(yǎng)價值高、海鮮風(fēng)味濃郁的特點(diǎn)。Bhaskar等[5]對印度一種淡水魚Catla魚內(nèi)臟蛋白質(zhì)用中性蛋白酶進(jìn)行酶解，找到了酶解的最佳條件，在自然pH值、料液比1.25% （g/mL）、溫度55 ℃、水解時間165 min條件下，水解度大于48%。Bhaskar等[25]對Catla魚內(nèi)臟蛋白質(zhì)用堿性蛋白酶進(jìn)行酶解得到了酶解的最佳條件即pH 8.5、料液比1.5%（g/mL）、溫度50 ℃、水解時間135 min時水解度接近50%。何莉萍等[26]在草魚內(nèi)臟資源的綜合利用技術(shù)研究中發(fā)現(xiàn)水解溫度、時間、pH值、加酶量是影響草魚內(nèi)臟蛋白水解的關(guān)鍵因素，通過實(shí)驗分析，可得到高的蛋白質(zhì)溶出率。本研究探索了木瓜蛋白酶酶解草魚內(nèi)臟蛋白質(zhì)的特性，以脫脂草魚內(nèi)臟蛋白為底物，以感官評分為指標(biāo)，通過響應(yīng)面試驗確定加酶量33 015 U/g、酶解溫度62.35 ℃、酶解時間5.37 h、酶解pH 7.9為最佳反應(yīng)條件，本研究通過酶解的技術(shù)使鮮味多肽與鮮味氨基酸更多的釋放，并且利用活性炭對水解液進(jìn)行了脫腥處理，提高了草魚內(nèi)臟蛋白質(zhì)的滋味品質(zhì)，此時水解物水解度為44.48%，肽得率為19.68%，感官評分為2。

酶水解技術(shù)在魚內(nèi)臟加工的應(yīng)用將越來越廣泛，但是仍然存在一些問題，如酶解產(chǎn)物的不確定性及后期分離純化的復(fù)雜性，過度酶解時產(chǎn)品有苦味，如何更加有效脫除苦腥味提高其可食性等將是魚內(nèi)臟深加工技術(shù)未來研究的重點(diǎn)內(nèi)容。

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Optimization of Enzymatic Hydrolysis Conditions of Grass Carp Visceral Proteins by Response Surface Methodology

CONG Yanjun1,2, YU Xiaofeng1,2, CHEN Shu1,3
(1. College of Food Science, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China; 2. Beijing Key Laboratory for Flavor Chemistry, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China; 3. Beijing Higher Institution Engineering Research Center for Food Additives and Ingredients, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

The hydrolysis conditions of defatted visceral waste proteins of grass carp with papain were optimized by the combined use of single factor method and response surface methodology. An enzyme dosage of 33 015 U/g, a hydrolysis temperature of 62.35 ℃, a hydrolysis time of 5.37 h and initial pH 7.9 were found to be optimal for the hydrolysis of visceral proteins of grass carp. Under these conditions, the degree of hydrolysis (DH) was 44.48% with a peptide yield of 19.68%, and the hydrolysate had a medium umami taste.

grass carp viscera; protein; hydrolysis; response surface methodology; optimization

S254.9

A

10.7506/spkx1002-6630-201510009

2014-10-19

北京市自然科學(xué)基金項目(6132004)；北京市科技新星計劃項目(Z131102000413005)

叢艷君(1978—),女,副教授,博士,研究方向為食品蛋白質(zhì)化學(xué)與工程。E-mail：cyj_win@sina.com