籽粒莧營(yíng)養(yǎng)面包酵母菌的分離與鑒定

趙娜，程金芝（白城師范學(xué)院，吉林白城137000）

籽粒莧營(yíng)養(yǎng)面包酵母菌的分離與鑒定

趙娜，程金芝*
（白城師范學(xué)院，吉林白城137000）

摘要：從自然發(fā)酵的籽粒莧營(yíng)養(yǎng)面包的生面團(tuán)中分離得到一株具有潛在應(yīng)用價(jià)值的產(chǎn)香味酵母菌Y-21菌株。通過(guò)常規(guī)的形態(tài)和生理生化特性以及ITS rDNA鑒定為葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum），并對(duì)其菌株進(jìn)行發(fā)酵性能測(cè)試。結(jié)果表明Y-21菌株的最適發(fā)酵溫度為30℃，pH為5.5，在籽粒莧雜糧面包發(fā)酵與烘焙應(yīng)用的初步研究中，面團(tuán)發(fā)酵效果良好，可以充分發(fā)揮籽粒莧面包的獨(dú)特風(fēng)味，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：籽粒莧；面包酵母菌；分離；鑒定

籽粒莧屬于莧科（Amaranthceae），莧屬（Amaranthus）一年生草本植物，具有廣泛適應(yīng)性[1]。本文所采用的籽粒莧為粒用莧，是1991年中國(guó)農(nóng)科院從美國(guó)引進(jìn)的R104品種，該品種特性籽粒多、高產(chǎn)而質(zhì)優(yōu)[2]。籽粒莧營(yíng)養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)，氨基酸組成合理，其中富含賴氨酸、精氨酸等谷類作物的限制性氨基酸，脂類以不飽和脂肪酸為主，含有角鯊烯，同時(shí)還富含鈣、鎂、鐵等礦物質(zhì)元素[3-5]。籽粒莧籽實(shí)在國(guó)外被稱作健康食品，被作為食物使用，如籽粒莧餅干、面條、披薩、面包等烘焙食品[6-8]。由于“三高人群”的日益增多，人們?cè)絹?lái)越注重飲食健康，籽粒莧由于豐富的營(yíng)養(yǎng)在國(guó)內(nèi)也備受關(guān)注[9-10]。譬如：湖北農(nóng)科院研制的籽粒莧降糖粉[11]，白城師范學(xué)院程金芝教授研究的籽粒莧酸乳[12-13]和面包小試產(chǎn)品均在研制開發(fā)中。但在實(shí)驗(yàn)室研制開發(fā)的籽粒莧面包是利用商業(yè)活性干酵母釀制，香氣單薄，典型性不突出。為此，針對(duì)籽粒莧富纖維營(yíng)養(yǎng)面包，篩選適合的專用酵母菌菌種[14-17]，在發(fā)酵與烘焙應(yīng)用研究中可以充分發(fā)揮籽粒莧的獨(dú)特風(fēng)味意義重大，同時(shí)也為籽粒莧食品產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供理論研究參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

籽粒莧品種R104：白城師范學(xué)院程金芝教授提供。

pMD18-T Vector：寶生物工程有限公司；引物合成及測(cè)序公司：華大基因；DNA片段凝膠回收試劑盒、小提質(zhì)粒試劑盒：OMEGA公司；酵母浸膏、蛋白胨（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

HK-35A烤箱：廣州旭郎機(jī)械設(shè)備公司；HZQ-F16A型恒溫電熱培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；HZQF160全溫振蕩培養(yǎng)箱：哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；PC-818A型PCR儀：日本ASTEC；DYCP-31C瓊脂糖水平電泳儀：北京六一；型凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)伯樂；UV-2800紫外可見分光光度計(jì)：尤尼柯（上海）儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1籽粒莧自然發(fā)酵面團(tuán)的制作

取一定量成熟飽滿籽粒莧種子，水淘除雜并烘干。然后將淘凈烘干的籽粒莧與水按料液比1∶10（g/mL）的比例榨成漿，之后用紗布過(guò)濾，所得的籽粒莧籽實(shí)置于烘箱中烘干，然后粉碎機(jī)制成籽粒莧籽實(shí)纖維粉。將稱量好的籽粒莧粉和配料按一定比例放入面盆中，加水慢速攪拌，使配料充分溶解混合，直至揉成軟硬適宜的面團(tuán)。之后進(jìn)行一次、二次醒發(fā)，并進(jìn)行烘烤，最后對(duì)面包進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

1.3.2酵母菌的分離和純化

將自然發(fā)酵生面團(tuán)用28℃溫水稀釋形成乳濁液，過(guò)濾，將含有酵母菌的濾液用PDA液體培養(yǎng)基進(jìn)行初步培養(yǎng)。將所培養(yǎng)混合菌液在PDA固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，選取形態(tài)不同的單菌落，進(jìn)一步劃線分離，美蘭染色，鏡檢，直至菌株為單一形態(tài)菌。最終將分離得到的酵母菌分離物進(jìn)行編號(hào)，并保存于終濃度20%的甘油中或者接種斜面培養(yǎng)基保存。

1.3.3菌株的初步鑒定

1.3.3.1菌株形態(tài)學(xué)觀察

觀察復(fù)篩得到的性狀優(yōu)良菌株的菌落形態(tài)，同時(shí)在光學(xué)顯微鏡下鏡檢細(xì)胞形態(tài)。

1.3.3.2菌株的生理生化特性鑒定

菌株的生理生化特性鑒定參照《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》一書中的方法進(jìn)行操作[18]。

1.3.4菌株分子生物學(xué)鑒定序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

參照邢福國(guó)2007年報(bào)道《酵母基因組的提取》文獻(xiàn)[19]中利用溶菌酶破壁的方法進(jìn)行酵母菌菌株基因組DNA的提取。采用真菌ITS rDNA通用引物對(duì)ITS1 和 ITS4（ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCCG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。50 μL PCR反應(yīng)體系為：2 μL模板、1 μL正反引物、1 μL（10 mol/L）dNTP、5 μL 10×PCR buffer （MgCl2）、1 μL E×TaqDNA聚合酶，無(wú)菌純水補(bǔ)齊到50 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。反應(yīng)產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用OMEGA回收試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收，并將回收DNA片段連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于氨芐抗性的LB培養(yǎng)基平皿上，挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果提交至GenBank并獲得接受號(hào)，使用BLAST程序與數(shù)據(jù)庫(kù)中已有序列進(jìn)行相似性比較分析，分析該菌株的分類地位。

1.3.5篩選酵母發(fā)酵特性研究

1.3.5.1Y-21菌株的最適溫度值測(cè)定

接種菌株至PDA液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)過(guò)夜。調(diào)節(jié)菌液濃度，以接種量為最初濃度100 cfu/μL，分別在不同的發(fā)酵溫度（22、24、26、28、30、32、34、36、38、40℃）培養(yǎng)酵母，pH自然條件下發(fā)酵30 h，分別取樣2 mL，用可見分光光度計(jì)在600 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度。

1.3.5.2Y-21菌株的最適pH測(cè)定

接種菌株至PDA液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)過(guò)夜。調(diào)節(jié)菌液濃度，以接種量為最初濃度100 cfu/μL分別接種初始pH為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0液體培養(yǎng)基中，30℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)14h取樣2mL，測(cè)定600 nm波長(zhǎng)處吸光度。

1.3.5.3Y-21菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將菌株用PDA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)14 h后，將菌液（調(diào)節(jié)菌液濃度100 cfu/μL）接種到滅菌的PDA液體培養(yǎng)基中，30℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)，觀察30 h菌株的生產(chǎn)情況，前期間隔2 h取樣，用可見分光光度計(jì)在600 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度，繪制出Y-21菌株生長(zhǎng)曲線的變化趨勢(shì)。

2　結(jié)果與分析

2.1籽粒莧面包的感官評(píng)價(jià)

籽粒莧面包感官質(zhì)量評(píng)定[20]在面包冷卻回軟，未老化前進(jìn)行，感官質(zhì)量評(píng)定結(jié)果見表1。

2.2酵母菌的初步鑒定

2.2.1酵母菌Y-21菌株的形態(tài)特征觀察結(jié)果

將Y-21菌株接種于PDA培養(yǎng)基上，于28℃培養(yǎng)2d，酵母菌Y-21菌株的形態(tài)特征觀察結(jié)果如圖1所示。

菌落形態(tài)如圖1（a）所示，均為圓形，乳白色，質(zhì)地均勻，邊緣整齊，表面光滑、濕潤(rùn)、黏稠，易挑取，并散發(fā)淡淡的酒香味道。光學(xué)顯微鏡下鏡檢，如圖1（b）所示，可見圓形或橢圓形細(xì)胞，大小為（4.0～5.0）μm×（4.5～8.7）μm，為一端出芽生殖。

2.2.2酵母菌的生理生化特性鑒定結(jié)果

酵母菌的生理生化特性鑒定結(jié)果如表2所示。

由表2結(jié)果所示，參照《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》檢索表可知，碳源中葡萄糖能被菌株Y-21同化；麥芽糖、乳糖、D-甘露醇、乳酸和可溶性淀粉均不能被同化。氮源中硝酸鉀和肌酸均不能被該菌株同化；尸胺和賴氨酸能被該菌株同化。并且，菌株在30℃培養(yǎng)試驗(yàn)中生長(zhǎng)良好，由此可以看出 Y-21菌株與Hanseniaspora屬的Hanseniaspora uvarum的特征極為相似。

2.3菌株的ITS通用引物的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果及進(jìn)化分析

以溶菌酶破壁法提取菌株的基因組DNA，以通用引物ITS rDNA擴(kuò)增酵母菌整個(gè)ITS區(qū)域，擴(kuò)增出的片段長(zhǎng)度大約為750 bp，結(jié)果如圖2所示。

將PCR擴(kuò)增片段連接pMD18-T，將陽(yáng)性質(zhì)粒送華大基因進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序得到的結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源序列搜索，得到與其親緣關(guān)系相近的已知酵母菌的相關(guān)信息，并采用MEGA 5.0軟件，利用鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，Y-21菌株與葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）相似度非常高，結(jié)合形態(tài)學(xué)的特征，可得知Y-21菌株為的葡萄汁有孢漢遜酵母不同菌種。

2.4Y-21菌株特性研究

2.4.1溫度對(duì)Y-21菌株生長(zhǎng)的影響

Y-21在不同溫度的PDA培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線如圖4。

由圖4可知，Y-21菌株在溫度為30℃進(jìn)行培養(yǎng)14 h后，菌量OD值可以達(dá)到最大值，并且可以達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)。

2.4.2pH對(duì)Y-21菌株生長(zhǎng)的影響

Y-21在不同pH的PDA培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線如圖5所示。

由圖5可知，當(dāng)pH≤4時(shí)，酵母菌的生長(zhǎng)相對(duì)較為緩慢；而當(dāng)pH≥4.5時(shí)，酵母菌的吸光值明顯增長(zhǎng)；當(dāng)pH=5.5時(shí)，菌株OD值達(dá)到最大值，說(shuō)明酸度對(duì)Y-21菌株的生長(zhǎng)有一定的影響，該菌株的最適pH為5.5。

2.4.3Y-21菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

Y-21在PDA培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線如圖6所示。

綜上圖4、5、6可知，Y-21菌株最適培養(yǎng)溫度是30℃，最適pH為5.5，且在培養(yǎng)8 h左右開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)至12 h～14 h時(shí)，OD值達(dá)到最大。

3　結(jié)論

通過(guò)對(duì)自然發(fā)酵的籽粒莧富纖維面包中酵母菌的定向分離、初篩、復(fù)篩以及生理生化的鑒定，獲得一株具有優(yōu)良產(chǎn)香能力的酵母菌菌株Y-21。通過(guò)分子生物學(xué)鑒定，該菌株ITS rDNA片段總長(zhǎng)為747 bp，將測(cè)得的序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，并利用鄰接法構(gòu)建該菌株的進(jìn)化樹表明，Y-21菌株與葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）相似度非常高，結(jié)合形態(tài)學(xué)的特征，最終鑒定Y-21菌株為葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）。本研究側(cè)重于適合于籽粒莧面包發(fā)酵的菌株的篩選與鑒定，以更能發(fā)酵籽粒莧的獨(dú)特味道，開發(fā)籽粒莧富纖維營(yíng)養(yǎng)面包。有關(guān)該菌株對(duì)籽粒莧富纖維面包的發(fā)酵特性，還有待進(jìn)一步的試驗(yàn)研究。日?qǐng)?bào),2014-06-05(15)

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.24.044

收稿日期：2015-10-26

基金項(xiàng)目：白城師范學(xué)院青年基金項(xiàng)目（2014C30號(hào)）

作者簡(jiǎn)介：趙娜（1985—），女（漢），講師，博士在讀研究生，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)。

*通信作者

Screening and Identification of Yeast for Production of Bread from Grain Amaranth

ZHAO Na，CHENG Jin-zhi*
（Baicheng Normal University，Baicheng 137000，Jilin，China）

Abstract：A aroma-producing yeast of strain named as strain Y-21 was screened from sourdough of Grain amaranth Bread by spontaneous fermentation.Morphological characteristics，physiological and biochemical tests and ITS rDNA sequence analysis revealed that it belonged to the species Hanseniaspora uvarum.In addition，the properties of strains Y-21 were also studied.The results showed that the optimal pH were 5.5. Preliminary studies on bread fermentation using Y-21strain indicated that bread products showed good and unique aroma，This aroma-producing yeast will have potential applications in baked products.

Key words：grain amaranth；baker's yeast；isolation；identification