多酚與蛋白質(zhì)、消化酶相互作用的研究進(jìn)展*

劉嬋，何志勇，秦昉，曾茂茂，陳潔

(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫，214122)

在食品工業(yè)中，提高食品的營(yíng)養(yǎng)和功能品質(zhì)是產(chǎn)品研發(fā)和加工制造的主要目標(biāo)，例如通過結(jié)合2種具有生物活性的化合物來開發(fā)新型功能性食品，現(xiàn)在許多營(yíng)養(yǎng)食品就同時(shí)含有多酚和乳蛋白，如奶茶、果奶、可可奶和咖啡奶等產(chǎn)品。多酚具有抗癌、消炎和抑菌的功效，也可促進(jìn)血管生成、預(yù)防慢性疾病和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生，降低糖尿病、心血管疾病和癌癥的發(fā)病率［1］。乳蛋白包括酪蛋白和乳清蛋白，含有人類全部必需氨基酸，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，生物學(xué)價(jià)值較高，消化率可達(dá)98%［2］。許多研究表明多酚與乳蛋白的相互作用會(huì)破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而降低蛋白質(zhì)的溶解度和消化性，同時(shí)也降低了多酚的抗氧化性，影響食品的感官和功能特性［3］，因而探究多酚與蛋白質(zhì)相互作用對(duì)食品營(yíng)養(yǎng)學(xué)和生命科學(xué)具有重要意義。由于消化酶對(duì)于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收具有關(guān)鍵作用，但是對(duì)于復(fù)合體系在機(jī)體消化環(huán)境中消化酶存在下的競(jìng)爭(zhēng)作用以及消化酶對(duì)復(fù)合物營(yíng)養(yǎng)性和功能性的影響尚不太清楚。因此，研究人體消化環(huán)境中在消化酶存在下，多酚與乳蛋白、消化酶相互作用及其對(duì)多酚生物利用性和抗氧化性的影響狀況，對(duì)于提高產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)健康功能具有十分重要的指導(dǎo)意義。

1 多酚和蛋白質(zhì)相互作用

1.1 相互作用機(jī)理

多酚類物質(zhì)具有與蛋白質(zhì)選擇性結(jié)合的能力，不同多酚對(duì)不同蛋白質(zhì)親和力具有一定差異［4］。多酚是植物的次級(jí)代謝產(chǎn)物，由多個(gè)羥基基團(tuán)連接到芳香環(huán)上構(gòu)成［5］。蛋白質(zhì)包含20種不同的氨基酸，而氨基酸是由一個(gè)α-碳原子共價(jià)結(jié)合一個(gè)氫原子、一個(gè)氨基、一個(gè)羧基和側(cè)鏈基團(tuán)［6］。酚類小分子化合物通過滲入蛋白質(zhì)分子的內(nèi)部與肽鏈交聯(lián)。多酚與蛋白質(zhì)的結(jié)合分為可逆性和不可逆性，可逆性的結(jié)合就是一些非共價(jià)作用，包括氫鍵作用、靜電吸附和疏水作用等［7-8］。氫鍵的形成主要是通過多酚中的氫原子與蛋白質(zhì)中的電負(fù)性離子如N、O或S結(jié)合;靜電吸附是酚類小分子通過正負(fù)離子交換而吸附到蛋白質(zhì)分子表面，作用力較弱;疏水作用是非極性基團(tuán)間形成的較強(qiáng)的作用力［4］。不可逆性結(jié)合則包括了共價(jià)鍵和離子鍵的結(jié)合［9-10］。目前，對(duì)于多酚與蛋白質(zhì)間非共價(jià)鍵結(jié)合的研究較多，而對(duì)于共價(jià)鍵結(jié)合作用研究較少。

1.2 相互作用測(cè)定方法

多酚與蛋白質(zhì)相互作用的親和力、化學(xué)計(jì)量學(xué)、動(dòng)力學(xué)、熱動(dòng)力學(xué)和構(gòu)象變化等特征參數(shù)通常用毛細(xì)管電泳法、電噴霧質(zhì)譜法(ESI-MS)、高性能親和色譜法(HPAC)、核磁共振光譜和多光譜法等方法測(cè)定［11］。多光譜法［12］包括熒光光譜法、紅外光譜法、紫外光譜法和圓二色譜法，是測(cè)定多酚-蛋白質(zhì)相互作用的常見方法，在這些方法中，熒光猝滅技術(shù)可以確定多酚和蛋白質(zhì)之間的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目，方法較為簡(jiǎn)單因而得到廣泛應(yīng)用。Wu等［13］利用熒光猝滅法、圓二色譜法研究發(fā)現(xiàn)EGCG和β-乳球蛋白間通過氫鍵和疏水作用緊密結(jié)合，同時(shí)破壞了β-乳球蛋白的空間結(jié)構(gòu)。Moser等［14］通過熒光猝滅法研究發(fā)現(xiàn)乳蛋白與黃烷-3-醇相互作用可以改變黃烷-3-醇的生物有效性，但在胃腸消化環(huán)境中會(huì)降低特定蛋白質(zhì)與其相互作用的影響。

1.3 多酚與乳蛋白的相互作用

多酚與乳蛋白的相互作用可改變食品中乳蛋白的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和多酚的功能性質(zhì)，主要影響多酚的抗氧化性。Dubeau［15］采用不同的抗氧化性測(cè)定方法發(fā)現(xiàn)，在溶液和固液體系中牛奶將抑制茶多酚的抗氧化性，相反在油濁液中，牛奶會(huì)增強(qiáng)茶多酚的抗氧化性，從而認(rèn)為牛奶中蛋白質(zhì)對(duì)茶多酚的抗氧化性具有雙重影響。Ryan［16］研究表明牛奶可降低茶多酚的抗氧化性，其中脫脂奶對(duì)多酚抗氧化性的降低程度高于全脂奶和半脫脂奶。同時(shí)Sharma［17］分析發(fā)現(xiàn)加入牛奶的黑茶中多酚的抗氧化活性低于黑茶的抗氧化活性。

另外，多酚與乳蛋白的結(jié)合會(huì)破壞乳蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而影響乳蛋白的功能性質(zhì)如乳化性、熱穩(wěn)定性和抗氧化性。Hasni，Kanakis等［18-19］分別對(duì) α、β-酪蛋白和β-乳球蛋白與茶多酚兒茶素衍生物的相互作用進(jìn)行了研究，利用紅外光譜，紫外可見光，圓二色譜和熒光光譜方法以及分子模型對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析表明，多酚與酪蛋白的結(jié)合會(huì)減少酪蛋白分子的α螺旋和β-折疊，增加其無規(guī)則卷曲和回轉(zhuǎn)，從而改變酪蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。Wang等［20］研究發(fā)現(xiàn)在pH 8.0，60℃的條件下，EGCG與α-乳清蛋白結(jié)合可降低溶液的渾濁度，同時(shí)也可提高α-乳清蛋白的乳化性，從而增強(qiáng)體系的穩(wěn)定性。O'Connell等［21］向脫脂奶中分別添加綠茶、黑茶、可可粉和咖啡，發(fā)現(xiàn)茶類富含的多酚物質(zhì)可與乳蛋白相互作用，增強(qiáng)酪蛋白膠束的穩(wěn)定性，從而增強(qiáng)了脫脂奶在140℃高溫下的熱穩(wěn)定性。

1.4 多酚與消化酶的相互作用

多酚有多種有益作用，通過清除體內(nèi)金屬離子或激活抗氧化酶的活性達(dá)到保護(hù)機(jī)體的功能。許多研究表明，多酚中的某些種類還可以通過改變消化酶的活性來對(duì)人體產(chǎn)生其他有益效果［22］。多酚可以通過抑制消化酶對(duì)脂類和淀粉的分解從而減少熱量的攝入，起到預(yù)防肥胖以及維持血糖穩(wěn)定的作用，達(dá)到調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)成分生物利用性的有益效果。同時(shí)某些多酚如原花青素對(duì)人體還有抗?fàn)I養(yǎng)作用，該抗?fàn)I養(yǎng)作用也是由于原花青素與消化酶之間相互作用的結(jié)果。原花青素與消化酶的相互作用主要包括對(duì)脂肪酶、蛋白酶以及葡萄糖苷酶的抑制［23］。

多酚對(duì)消化酶的抑制作用主要是因?yàn)槎喾优c消化酶的結(jié)合，使消化酶分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，致使酶活性降低。Wu等［24］利用熒光光譜法、圓二色譜法和分子對(duì)接研究方法測(cè)定苦茶中苯丙素苷類化合物與胃蛋白酶、胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶等消化酶的相互作用。由于消化酶分子中疏水基團(tuán)與苯丙素苷類化合物的疏水作用從而使酶分子中極性基團(tuán)(如-OH、-SH和-NH2基團(tuán))與苯丙素苷類化合物中的-OH基團(tuán)形成氫鍵結(jié)合，改變了消化酶的極性，從而抑制消化酶的活性。

多酚對(duì)消化酶的抑制作用強(qiáng)弱與多酚含量和種類以及消化酶的種類密切相關(guān)。Goncalves等［25］利用分光光度法研究葡萄籽中花青素和不同葡萄酒中單寧對(duì)胰蛋白酶的抑制作用，結(jié)果表明，多酚的平均聚合程度與對(duì)胰蛋白酶的抑制作用有直接關(guān)系。此外，不同類型葡萄酒中，因酚類物質(zhì)含量不同，對(duì)胰蛋白酶活性的抑制程度也不同，隨著酚類物質(zhì)含量的增加對(duì)胰蛋白酶活性的抑制作用增強(qiáng)，并且證實(shí)了縮合單寧作為抗?fàn)I養(yǎng)因子，可抑制蛋白質(zhì)的消化作用，減少營(yíng)養(yǎng)素的吸收。McDougall等［26］利用體外實(shí)驗(yàn)研究不同漿果中多酚物質(zhì)對(duì)α-淀粉酶的抑制作用，通過測(cè)定其IC50值得出樹莓和花楸漿果的抑制效果最好，并利用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析樹莓和花楸漿果中起抑制作用的成分主要為原花青素，花楸漿果中原花青素與淀粉酶通過疏水作用結(jié)合，從而抑制淀粉酶的活性。原花青素對(duì)淀粉酶的抑制作用減少了對(duì)阿卡波糖(降低血糖的藥)的分解，達(dá)到控制人體餐后血糖濃度和預(yù)防肥胖的作用。He等［27］測(cè)定茶多酚對(duì)不同消化酶如α-淀粉酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和脂肪酶的抑制作用，發(fā)現(xiàn)茶多酚對(duì)α-淀粉酶的抑制作用最強(qiáng)，其次是脂肪酶，最后為胃蛋白酶和胰蛋白酶。

2 消化環(huán)境中多酚與乳蛋白的變化及相互作用

2.1 多酚在消化環(huán)境中的變化

許多研究表明，多酚在體內(nèi)代謝吸收過程中對(duì)于降低冠狀動(dòng)脈心臟疾病、癌癥以及胃腸道疾病發(fā)病率［28］等方面發(fā)揮了重要作用，目前普遍認(rèn)為多酚的消化吸收主要發(fā)生在小腸部位［29］。消化環(huán)境中對(duì)多酚影響較大的是胃腸道的pH值。綠茶中兒茶素的穩(wěn)定性與溶液pH密切相關(guān)，在pH為3和4時(shí)相對(duì)穩(wěn)定，但它在 pH值為5和6時(shí)很容易降解［30］。Andrew等［31］在體外模擬消化環(huán)境的實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)證明，兒茶素在模擬酸性胃環(huán)境中較穩(wěn)定，在模擬腸道的近中性或堿性pH環(huán)境下大幅度降解。而在模擬小腸環(huán)境中EGCG和EGC最敏感，ECG較為穩(wěn)定，EC和C最穩(wěn)定。消化過程中，兒茶素類衍生物的降解大多發(fā)生在小腸環(huán)境中，在腸液環(huán)境中的損失量通常比胃環(huán)境中的損失量高10～20倍。同時(shí)，Record等［32］在研究不同品種茶葉在消化環(huán)境中的變化也發(fā)現(xiàn)，各種茶葉中兒茶素在酸性胃環(huán)境的培養(yǎng)幾乎沒有影響，然而在小腸中微堿性pH環(huán)境下培養(yǎng)，綠茶和紅茶中兒茶素的濃度迅速下降，且綠茶中兒茶素的損失量高于紅茶。

在消化環(huán)境中，多酚的抗氧化性、生物可及性和生物利用率都會(huì)受到影響，并且不同種類的多酚經(jīng)過消化環(huán)境，其功能性變化不同。Fereidoon等［33］通過模擬體外消化和微生物發(fā)酵研究消化過程對(duì)5種不同谷物中酚類物質(zhì)的抗氧化能力和生物利用性的影響，發(fā)現(xiàn)經(jīng)消化酶的水解作用，谷物抗氧化活性增強(qiáng)，谷物中多酚的生物可及性提高，這是因?yàn)橄傅淖饔糜欣诙喾訌暮胁蝗苄岳w維的谷物中釋放。Tagliazucchi等［34］發(fā)現(xiàn)食物中的酚類物質(zhì)在胃腸消化環(huán)境中釋放而被吸收，在胃消化過程中總酚、黃酮類和花青素類的生物可及性增加，而在腸道環(huán)境中酚酸和白藜蘆醇降解，兒茶素、槲皮素則相對(duì)較穩(wěn)定。Bermudez-Soto等［35］也對(duì)阿龍尼亞苦味果汁中主要多酚化合物在體外胃腸消化環(huán)境中的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)胃的消化對(duì)酚類化合物無顯著影響，而酚類在小腸消化過程中的變化較為顯著，其中花青素?fù)p失最多(大約43%)，黃酮類和黃烷-3-醇含量分別下降26%和19%，而綠原酸含量增加了24%，并認(rèn)為食物多酚在小腸消化中的顯著變化主要是因?yàn)槎喾宇惢衔镌谛∧c堿性條件中轉(zhuǎn)變成其他具有不同生物有效性、生物利用度和生物活性的未知化合物。Gian等［36］通過模擬胃腸消化環(huán)境，研究血漿蛋白與白茶、綠茶和紅茶中茶多酚的相互作用，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于紅茶和綠茶，白茶中兒茶素衍生物含量最豐富，在腸道中，白茶中兒茶素也具有較高的生物有效性和生物利用度，白茶中EGCG、EGC和ECG的積累量高于綠茶和紅茶，而白茶中EGCG和EGC比ECG和EC更容易消化。

2.2 多酚與乳蛋白在消化環(huán)境中的相互作用

有研究提出，食品多酚在消化過程中抗氧化性、生物可及性和生物利用率的變化與多酚和蛋白質(zhì)相互作用的強(qiáng)弱有很大關(guān)系。Xie等［37］利用模擬體外消化環(huán)境和Caco-2細(xì)胞模型，探究綠茶中添加牛奶對(duì)綠茶中兒茶素衍生物有效性和腸道吸收的影響，發(fā)現(xiàn)綠茶中ECG和EGCG與牛奶中的蛋白質(zhì)結(jié)合力較強(qiáng)，而EC和EGC的蛋白質(zhì)親和力較弱，綠茶與牛奶混合液中兒茶素衍生物在Caco-2細(xì)胞中的回收率顯著高于無乳的綠茶溶液，并認(rèn)為是由于乳蛋白與兒茶素的相互作用促進(jìn)了兒茶素的吸收，從而提高了兒茶素的生物利用度。Green等［38］研究發(fā)現(xiàn)茶與谷物奶的混合可使茶中總兒茶素的回收率增加69%，茶中加入50%的大米乳也可使EGC和EGCG的回收率分別達(dá)到74.0%和69.7%，而在消化實(shí)驗(yàn)中，觀察到EGC和EGCG顯著下降，而EC和ECG保持其穩(wěn)定性，Green等認(rèn)為蛋白質(zhì)的消化，將破壞兒茶素與蛋白質(zhì)相互作用使兒茶素衍生物暴露于消化環(huán)境中，從而促進(jìn)了兒茶素衍生物的降解。

食品多酚與乳蛋白相互作用不僅會(huì)影響多酚的抗氧化性和生物利用率，也會(huì)影響乳蛋白的消化性，進(jìn)而影響食品復(fù)合體系的營(yíng)養(yǎng)和功能特性。He等［39］研究果奶體系在消化環(huán)境中乳清蛋白的消化性，得出在胃消化階段，兒茶素和綠原酸對(duì)乳清蛋白的消化性影響不大。在小腸階段，多酚可顯著降低乳清蛋白的消化性，隨多酚濃度的增加抑制效果增強(qiáng)，并且兒茶素對(duì)乳清蛋白水解度的抑制作用大于綠原酸。Marija等［40］認(rèn)為膳食多酚和β-乳球蛋白的結(jié)合可降低蛋白質(zhì)的消化率和體系的抗氧化活性，多酚與蛋白的非共價(jià)鍵結(jié)合延遲β-乳球蛋白的消化，促使β-乳球蛋白β-折疊向α-螺旋轉(zhuǎn)變。苑博等［41］也發(fā)現(xiàn)酚類物質(zhì)通過與乳清蛋白以及蛋白酶的相互作用使乳清蛋白的消化率降低，酚類物質(zhì)濃度越大對(duì)蛋白質(zhì)消化率的影響越大。體外消化過程中，乳清蛋白及乳清蛋白與酚類物質(zhì)混合物的ABTS自由基清除能力提高，鐵離子還原能力降低，酚類物質(zhì)與乳清蛋白相互作用對(duì)抗氧化性的影響通常不變，蛋白酶對(duì)柚皮苷和綠原酸的抗氧化性影響不大，卻降低了兒茶素抗氧化性。

3 展望

在食品工業(yè)中，奶茶和果奶是多酚類物質(zhì)作為功能性配料在含乳食品中應(yīng)用的典型產(chǎn)品，多酚的加入既可以改善含乳食品的口感，也可以增強(qiáng)其抗氧化活性。本文介紹了近年來乳蛋白與食品多酚相互作用、多酚與消化酶的作用以及多酚、乳蛋白和多酚-乳蛋白復(fù)合體系在體外消化環(huán)境中變化的研究進(jìn)展情況。然而目前研究?jī)H僅局限在多酚和乳蛋白、多酚與消化酶、乳蛋白與消化酶兩者之間的作用，而對(duì)于在消化環(huán)境下食品多酚與蛋白質(zhì)、消化酶之間到底存在怎樣的競(jìng)爭(zhēng)相互作用關(guān)系，這種競(jìng)爭(zhēng)相互作用強(qiáng)弱對(duì)食品體系抗氧化性、消化性、生物利用性及健康功能會(huì)產(chǎn)生什么樣的影響尚不清楚。所以，今后需要進(jìn)一步從分子水平上分析研究蛋白-多酚、多酚-消化酶在消化環(huán)境條件下相互作用的類型、大小及相互競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，并探尋三者相互作用對(duì)食品體系蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)性及多酚功能性的影響規(guī)律，這對(duì)于提高產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和健康功能品質(zhì)具有重要意義，將為蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合類功能性食品的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)和重要理論基礎(chǔ)。

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