石榴皮多酚提取方法研究進(jìn)展*

朱彩平，張艷霞，張曉，李云，鄧紅，翟希川，趙風(fēng)珠

(陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安，710062)

1 石榴研究及多酚提取概述

石榴(Punica granatum L.)為石榴科石榴屬植物，在熱帶及亞熱帶國(guó)家均有廣泛種植，不僅可食用，還被廣泛用作民間藥物［1-2］。石榴的果實(shí)主要由3部分組成:種子、果肉和果皮。石榴果汁由果肉榨得，因其被建議作為化學(xué)預(yù)防、化學(xué)治療、抗動(dòng)脈粥樣硬化、消炎等制劑，目前在全球范圍內(nèi)其銷售量呈急劇增加的態(tài)勢(shì)［3-4］;石榴籽主要用于油的提取，石榴籽油具有抗氧化［5］、抗衰老［6］、增強(qiáng)免疫力［7］等功能，目前石榴籽油在市場(chǎng)上也開(kāi)始銷售;石榴皮是石榴果汁和石榴酒等加工業(yè)的副產(chǎn)品，約占整個(gè)石榴果實(shí)鮮重的40%［8］，在我國(guó)，新鮮的石榴皮大部分被廢棄，僅有少量曬干作為藥用［9］。石榴皮中含有大量的多酚類物質(zhì)，是其發(fā)揮藥理作用的主要活性成分，包括安石榴苷、沒(méi)食子酸、原兒茶素、綠原酸、表兒茶素、咖啡酸、蘆丁、槲皮素、山萘素等多種化合物［10］，約占石榴皮干重的10% ～20%。近10余年來(lái)的研究表明，它具有抗氧化、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗衰老、抗菌、抗突變、降血脂、降血壓和潤(rùn)膚美容等多種功效［11-16］，因此，石榴皮多酚在食品、醫(yī)藥及化工用品方面具有極大的應(yīng)用價(jià)值。

多酚類物質(zhì)的提取方法主要包括:溶劑提取、微波及超聲波輔助提取，酶法提取，超臨界流體萃取，超高壓流體萃取等。石榴皮多酚屬于不穩(wěn)定性物質(zhì)，易被氧化破壞，提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、溫度過(guò)高都會(huì)增加石榴皮多酚結(jié)構(gòu)被破壞的概率，低的提取效率不僅增加生產(chǎn)成本，還會(huì)降低石榴皮多酚的生物活性，因此，對(duì)石榴皮多酚的提取方法進(jìn)行深入細(xì)致的研究，建立高效、快捷、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用的提取方法顯得尤為迫切。本文對(duì)近年來(lái)石榴皮多酚的提取方法作一綜述。

2 石榴皮多酚提取方法

2.1 溶劑提取法

溶劑提取是最為傳統(tǒng)的多酚提取方法，根據(jù)植物中不同成分在不同溶劑中的溶解度不同而分離，所采用的溶劑主要是水或有機(jī)溶劑。

孫蘭萍［17］等利用乙醇提取石榴皮多酚，確定最佳的提取條件為:提取溫度70℃，液料比25∶1(mL∶g)，提取時(shí)間1.5 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，石榴皮多酚得率為16.28%。

王曉瑜［18］等采用甲醇、乙醇、乙酸乙酯和水4種溶劑分別對(duì)新疆石榴皮總多酚進(jìn)行提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同溶劑提取效果差別較大，總多酚得率:甲醇＞乙醇＞水＞乙酸乙酯。

李國(guó)秀［19］等以石榴皮粉為原料，研究了提取溶劑濃度、浸提溫度、浸提時(shí)間和料液比對(duì)多酚提取效果的影響，通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)以上4個(gè)因素影響下的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，確定了石榴皮多酚乙醇提取的最佳工藝為:乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、浸提溫度60℃、料液比1∶20(g∶mL)、浸提時(shí)間2 h，提取2 次，以此優(yōu)化工藝進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，多酚得率為23.39%。

國(guó)外研究學(xué)者大多采用水作為提取溶劑，認(rèn)為水與有機(jī)溶劑相比價(jià)格低廉，對(duì)環(huán)境污染小。?am［20］等在用中心組合設(shè)計(jì)優(yōu)化石榴皮多酚水法提取的研究中，從可能對(duì)得率有影響的五個(gè)因素中剔除對(duì)得率影響不大的3個(gè)因素，最后選取提取溫度和提取時(shí)間兩個(gè)影響較大的因素進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，得到最佳提取條件為:提取溫度100℃，提取時(shí)間1 min，經(jīng)HPLC定量測(cè)定石榴皮總酚含量為192.0 mg/g干基，與采用傳統(tǒng)的甲醇溶劑提取沒(méi)有顯著性差異。

Amyrgialaki［21］采用響應(yīng)面優(yōu)化石榴皮多酚的提取工藝，試驗(yàn)依據(jù)23全因子中心組合設(shè)計(jì)，以乙醇/水/檸檬酸為提取介質(zhì)，影響因素包括提取溶劑的pH，乙醇的濃度和提取時(shí)間。得到最佳提取條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，pH 2，提取時(shí)間1 h，石榴皮總酚含量為324.9 mg/g干基。

采用溶劑法進(jìn)行石榴皮多酚的提取時(shí)，可選取的溶劑主要有甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯和水等溶劑，從節(jié)能環(huán)保及食用安全的角度來(lái)講，大多數(shù)研究者一般會(huì)選用低毒且價(jià)格相對(duì)低廉的乙醇或水作為溶劑，該方法簡(jiǎn)單易行，但耗時(shí)較長(zhǎng)，效率不高。

2.2 酶解提取法

酶解提取法是根據(jù)酶反應(yīng)具有高度專一性的特點(diǎn)，選擇相應(yīng)的酶，水解或降解細(xì)胞壁組成成分，從而破壞細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)的有效成分更易于溶進(jìn)溶劑中，達(dá)到對(duì)植物有效成分提取的目的。

王華斌［22］等人研究了酶法提取石榴皮中多酚的工藝，采用單因素試驗(yàn)考察不同濃度的纖維素酶、果膠酶、復(fù)合酶(不同質(zhì)量比的纖維素酶和果膠酶)、酶解時(shí)間、酶解溫度及酶解液pH值對(duì)石榴皮多酚得率的影響，并運(yùn)用二次通用旋轉(zhuǎn)回歸組合設(shè)計(jì)優(yōu)化酶法提取石榴皮多酚的最佳工藝參數(shù)。試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)石榴皮多酚得率影響次序依次為酶解時(shí)間＞酶濃度＞pH值＞酶解溫度。當(dāng)復(fù)合酶(纖維素酶和果膠酶質(zhì)量比為2∶1)質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL，酶解時(shí)間150 min，酶解溫度50℃，初始酶解液pH 6.0時(shí)，多酚得率達(dá)23.87%。

酶法提取，條件溫和，產(chǎn)品得率較高，現(xiàn)在也越來(lái)越廣泛地應(yīng)用于食品、藥品及動(dòng)植物細(xì)胞有效成分的提取，但提取時(shí)間較長(zhǎng)。

2.3 微波輔助提取法

微波輔助提取是高頻電磁波到達(dá)物料內(nèi)部，由于吸收微波能，物料內(nèi)部迅速升溫，細(xì)胞瞬時(shí)破碎，被提取物進(jìn)入提取介質(zhì)中，提高提取效率［23-24］。微波輔助提取法近年來(lái)廣泛應(yīng)用于天然活性成分的提取，可提高目標(biāo)物從固相轉(zhuǎn)移到液相的傳質(zhì)速率，從而提高提取產(chǎn)率。

宋薇薇［25］等人采用微波輔助法提取石榴皮多酚類化合物，確定了石榴多酚提取的最優(yōu)工藝條件:40%(體積分?jǐn)?shù))乙醇作溶劑，料液比(g∶mL)1∶35，微波功率242 W，提取時(shí)間60 s，提取3次，以該優(yōu)化條件提取時(shí)，多酚粗提物的得率26.52%。

王玲［26］等人采用微波輔助水法提取石榴皮多酚，得出其粗提物的最佳提取工藝為:篩目數(shù)60～80目，提取功率385 W，料液比1∶25(g∶mL)，提取時(shí)間120 s，提取次數(shù)3次。在此條件下，石榴皮多酚得率最高達(dá)21.4%。

文春鵑［27］等人采用微波輔助乙醇提取石榴皮多酚的研究結(jié)果表明，乙醇體積分?jǐn)?shù)、微波功率、提取時(shí)間及料液比均對(duì)石榴皮多酚提取率有顯著影響。石榴皮多酚的最佳提取條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，微波功率 300 W，提取時(shí)間 120 s，料液比 1∶35(g∶mL)，該條件下石榴皮多酚提取率可達(dá)21.41%。

周安存［28］等人利用乙醇-硫酸銨雙水相體系與微波集成法對(duì)石榴皮多酚進(jìn)行提取分離，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)與正交實(shí)驗(yàn)得出提取石榴皮多酚的最佳條件為，m(料)∶V(醇)∶V(水)=1∶12∶20，(NH4)2SO4用量0.325 g/mL，微波處理溫度55℃，微波處理時(shí)間為60 s，粗多酚提取率為18.33%，粗提物中多酚含量為75.36%。

微波提取法是將微波與溶劑提取相結(jié)合，操作簡(jiǎn)單易行，大大縮短了提取時(shí)間，但需要使用專門的微波提取設(shè)備，否則提取溫度無(wú)法控制。

2.4 超聲波輔助提取法

超聲波提取分離主要是依據(jù)物質(zhì)中有效成分和有效成分群體的存在狀態(tài)、極性、溶解性的不同來(lái)進(jìn)行分離。超聲波振動(dòng)能使溶劑快速地進(jìn)入固體物質(zhì)中，將其物質(zhì)所含的有機(jī)成分盡可能完全地溶于溶劑之中，得到多成分混合提取液。超聲波還能在液體中高頻振動(dòng)并產(chǎn)生“空穴作用”，可以破壞細(xì)胞組織，有助于多酚類化合物的溶出和擴(kuò)散，具有提取時(shí)間短、效率高的優(yōu)點(diǎn)［29-30］。

Tabaraki［31］等人在超聲波輔助乙醇提取石榴皮多酚的研究中，選取對(duì)得率影響較大的3個(gè)因素提取時(shí)間、乙醇濃度和提取溫度為單因素，用響應(yīng)面法進(jìn)行提取條件優(yōu)化，研究結(jié)果表明:當(dāng)提取溫度60℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取時(shí)間30 min時(shí)，最高提取率為45.38%，較超聲輔助水法提取，其得率高3倍(Pan和Qu等人采用超聲輔助水法提取，其得率為11% ～ 14%［5，32］)。

房玉林［33］等人利用超聲波輔助甲醇法提取石榴皮多酚類物質(zhì)，結(jié)果表明:用80%酸化甲醇做溶劑、料液比1∶20(g∶mL)、30℃條件下超聲波(固定功率100 W)作用20 min，提取1次，總多酚提取率最高，為14.06 mg/g。

王華斌［34］等人以新疆石榴皮為原料，采用二次通用旋轉(zhuǎn)回歸組合設(shè)計(jì)對(duì)超聲波輔助乙醇提取石榴皮多酚工藝進(jìn)行研究，結(jié)果表明，其最佳提取工藝條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，料液比1∶25(g∶mL)，超聲時(shí)間30 min，超聲功率360 W。在此優(yōu)化條件下，石榴皮多酚得率達(dá)到(21.2±0.06)%。

汝紹剛［35］等利用超聲輔助乙醇法提取石榴皮多酚的研究中，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化石榴皮多酚的最佳提取條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，石榴皮粒徑40目，提取時(shí)間50 min，提取溫度30℃，料液比為1∶15(g∶mL)，該條件下石榴皮多酚平均提取率為16.44%。

郭慶賀［36］等采用超聲波-螯合劑輔助提取石榴皮多酚，通過(guò)響應(yīng)面分析，確定超聲波-螯合劑輔助提取石榴皮多酚的最佳工藝條件:乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、提取溫度60℃、提取時(shí)間50 min、料液比1∶30(g∶mL)、螯合劑添加量0.08%，在此條件下多酚提取率可達(dá)28.03%。超聲波-螯合劑輔助提取法與普通熱回流提取相比，具有雜質(zhì)少、耗時(shí)短、效率高等優(yōu)點(diǎn)，可作為石榴皮中多酚提取的新方法，具有廣闊應(yīng)用前景。

Pan［37］等人運(yùn)用持續(xù)式超聲輔助和脈沖式超聲輔助2種方法分別提取石榴皮中的抗氧化物質(zhì)(主要是多酚類物質(zhì))，并將2種方法與傳統(tǒng)方法進(jìn)行對(duì)比，以提取率和抗氧化活性的大小為指標(biāo)判斷最佳的提取方法和工藝條件，研究結(jié)果表明，在持續(xù)式超聲輔助提取(continuous ultrasound-assisted extraction，CUAE)中，得率與超聲強(qiáng)度和提取時(shí)間的變化呈正相關(guān)，但是提取時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)嚴(yán)重影響提取物的抗氧化活性，而對(duì)于脈沖式超聲輔助提取(pulsed ultrasound-assisted extraction，PUAE)，超聲強(qiáng)度、脈沖重復(fù)次數(shù)、脈沖持續(xù)時(shí)間和脈沖間隔時(shí)間都會(huì)影響產(chǎn)品得率，但不會(huì)影響提取物的抗氧化活性，在超聲強(qiáng)度為59.2 W/cm2，提取時(shí)間60 min，溫度(25±2)℃，料液比1∶50(g∶mL)，PUAE的脈沖持續(xù)時(shí)間與間隔均為5 s的條件下，PUAE和CUAE提取得率接近(分別為14.5%和14.8%)，與傳統(tǒng)的提取方法相比，PUAE和CUAE的提取得率分別增加了22%、24%，提取時(shí)間分別縮短了87%、90%。此外，PUAE可比CUAE節(jié)約50%的電能，鑒于此，作者推薦PUAE為提取石榴皮中抗氧化物質(zhì)的最佳方法。

以上不同學(xué)者雖然都是采用超聲輔助提取石榴皮多酚，但是所用溶劑、提取條件不盡相同，因此多酚得率也存在著較大差異。

超聲波輔助提取法也是將超聲波與溶劑提取相結(jié)合，可大大節(jié)省提取時(shí)間，提高提取效率。

2.5 超臨界流體萃取法

超臨界流體萃取是一種新型的現(xiàn)代分離技術(shù)，它是利用溫度和壓力略超過(guò)或接近臨界的介于氣體和液體之間的流體作為萃取劑，從固體或液體中萃取某種高沸點(diǎn)和熱敏性成分，以達(dá)到分離和提純的目的［38］。目前，超臨界CO2萃取技術(shù)用于石榴皮多酚提取的報(bào)道還很少。

馮務(wù)群［39］等用超臨界CO2萃取，超聲提取，微波提取及甲醇浸提等不同方法提取石榴皮中沒(méi)食子酸并用HPLC法測(cè)定其含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4種方法提取所得沒(méi)食子酸含量分別為 0.498%、0.311%、0.271%和0.396%，因此超臨界CO2萃取法提取石榴皮多酚中沒(méi)食子酸是一種高效的方法。

超臨界萃取是近年來(lái)研究較多的一種新的先進(jìn)的提取方法，主要適合提取非極性和弱極性的低分子成分，對(duì)于極性成分的提取，可通過(guò)加極性?shī)A帶劑的方式改善和提高提取率。沒(méi)食子酸(3，4，5-三羥基苯甲酸)含多個(gè)極性基團(tuán)，是強(qiáng)極性化合物，適合使用極性溶劑作為夾帶劑提取，甲醇是常用的極性溶劑，馮務(wù)群［39］等人采用甲醇作夾帶劑，提取得到的沒(méi)食子酸含量在4種提取方法中最高。

超臨界流體萃取是一種高效而環(huán)保的提取方法，已被廣泛運(yùn)用于實(shí)驗(yàn)室研究，但是它在萃取過(guò)程中成本較為昂貴［40-42］。目前最新研究發(fā)現(xiàn)，亞臨界水萃取可將其替代［43］。

2.6 亞臨界水萃取

亞臨界水又稱超加熱水、高壓熱水或熱液態(tài)水，是指在一定的壓力下，將水加熱到100℃以上，374℃以下的臨界溫度高溫，水體仍然保持在液體狀態(tài)。亞臨界狀態(tài)下流體微觀結(jié)構(gòu)的氫鍵、離子水合、離子締合、簇狀結(jié)構(gòu)等發(fā)生了變化，因此亞臨界水的物理、化學(xué)特性與常溫常壓下的水在性質(zhì)上有較大差別。常溫常壓下水的極性較強(qiáng)，亞臨界狀態(tài)下，隨著溫度的升高，亞臨界水的氫鍵被打開(kāi)或減弱，從而使水由高到低萃取出來(lái)。這樣就可以通過(guò)控制亞臨界水的溫度和壓力，使水的極性在較大范圍內(nèi)變化，從而實(shí)現(xiàn)天然產(chǎn)物中有效成分從水溶性成分到脂溶性成分的連續(xù)提取，并可實(shí)現(xiàn)選擇性提取。此外，由于亞臨界水萃取是以價(jià)廉、無(wú)污染的水作為萃取劑，因此，亞臨界水萃取技術(shù)被視為綠色環(huán)保、前景廣闊的一項(xiàng)變革性技術(shù)［43］。

He［44］等人在用亞臨界水提取石榴渣多酚物質(zhì)的研究中，以提取時(shí)間、料液比和溫度作為單因素，研究結(jié)果表明最佳的提取條件為:提取時(shí)間30 min，料液比1∶40(g∶mL)，溫度220℃，溫度對(duì)提取率的影響最大，在溫度100～220℃內(nèi)，多酚含量在651.7～4 854.7(mg/100g干基)內(nèi)變化。

亞臨界水提取一種先進(jìn)的新型提取技術(shù)，較傳統(tǒng)提取方法的優(yōu)點(diǎn)有:提取時(shí)間短，工藝簡(jiǎn)單，成本低廉，提取率高，環(huán)保［43］。

2.7 超高壓提取法

超高壓提取也稱超高冷等靜壓提取，是指在常溫下用100～1 000 MPa的流體靜壓力作用于提取溶劑和中藥的混合液上，并在預(yù)定壓力下保持一段時(shí)間，使植物細(xì)胞內(nèi)外壓力達(dá)到平衡后迅速卸壓。由于細(xì)胞內(nèi)外滲透壓力忽然增大，細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使得細(xì)胞內(nèi)的有效成分能夠穿過(guò)細(xì)胞的各種膜而轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外的提取液中，達(dá)到提取有效成分的目的。最新研究表明在天然產(chǎn)物的提取中應(yīng)用它可大大縮短提取時(shí)間，減少雜質(zhì)溶出，提高有效成分的得率，避免因熱效應(yīng)引起的有效成分的變化，并且不會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染［45］。

嚴(yán)隴兵［45］等人以提取石榴皮多酚為目的，以總酚得率為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化超高壓溶劑提取工藝參數(shù)，試驗(yàn)結(jié)果表明:影響超高壓提取石榴皮多酚得率的因素主次順序?yàn)?料液比＞壓力＞乙醇濃度＞保壓時(shí)間。最佳提取工藝條件為提取壓力582.7 MPa，保壓時(shí)間 2.3 min，料液比1∶41(g∶mL)，乙醇體積分?jǐn)?shù)52.8%，在此條件下，多酚得率超過(guò)26%。

除超高壓外，也有采用一般高壓溶劑提取的，?am［8］等人在高壓水提取石榴皮多酚的研究中，提取容器內(nèi)壓力保持在102.1個(gè)大氣壓(約10 MPa)，發(fā)現(xiàn)石榴皮原料粒徑大小、高壓處理溫度和靜電干擾時(shí)間是影響石榴皮多酚提取率的主要因素，研究結(jié)果表明，最佳的提取溫度為40℃，靜電干擾時(shí)間為5 min，粒徑可盡量小但不宜小于65 μm，其安石榴苷含量為(116.6±12.2)mg/g干基。同時(shí)作者還將高壓水提取與采用不同溶劑在常壓下提取(甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮及水)進(jìn)行比較，結(jié)果顯示甲醇提取得到的總酚含量(252.4 mg/g干基)顯著高于其他溶劑提取(3.9～96.8 mg/g干基)，而高壓水方法提取的總酚含量與甲醇提取的總酚含量相當(dāng)(258.2 mg/g干基)。

在常壓溶劑提取中，甲醇提取雖然總酚提取率高，但甲醇試劑具有一定毒性，用量大，成本高，且產(chǎn)品中殘留的溶劑不易徹底去除，而常壓水提取，雖無(wú)溶劑殘留污染，但耗時(shí)長(zhǎng)，且因水溫偏高，多酚為熱敏性成分，其結(jié)構(gòu)易被破壞，而導(dǎo)致總酚提取率較低，若采用高壓水提取，則能很好的彌補(bǔ)以上方法的不足，因此采用高壓或超高壓的方法提取石榴皮多酚具有較大的優(yōu)勢(shì)。

3 結(jié)語(yǔ)

石榴皮多酚因具有多種生物活性，其開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景被看好。充分利用石榴資源，建立一種高效低廉的石榴皮多酚提取工業(yè)化生產(chǎn)工藝，既能為開(kāi)發(fā)石榴皮多酚這一天然活性成分在食品、保健品和化工用品等領(lǐng)域的新用途提供物質(zhì)基礎(chǔ)，也能為石榴皮資源的再利用提供一條可行途徑，提高石榴加工業(yè)的附加值，促進(jìn)石榴種植和加工的協(xié)調(diào)發(fā)展。

傳統(tǒng)的溶劑提取法及酶法提取研究較為成熟，但溶劑的耗費(fèi)量較大，成本高，提取時(shí)間長(zhǎng)，提取率低，已成為阻礙我國(guó)石榴皮多酚資源開(kāi)發(fā)利用的瓶頸。近幾年采用較多的是微波和超聲波輔助溶劑浸提來(lái)提取石榴皮多酚，以此達(dá)到節(jié)省提取時(shí)間、提高提取率的目的。最新的方法如超臨界流體萃取、超高壓萃取、亞臨界水提取等技術(shù)，比現(xiàn)有方法具有更大的優(yōu)越性，為工業(yè)化提取石榴皮多酚開(kāi)辟了新的途徑。然而這些技術(shù)目前多限于實(shí)驗(yàn)室研究，還不適宜大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。因此，為了加快我國(guó)豐富的石榴資源的綜合開(kāi)發(fā)利用，尋求新的快速、高效、節(jié)能減排的提取方法，改進(jìn)現(xiàn)有的能夠適應(yīng)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的提取工藝顯得極為重要。

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