不同分析技術(shù)對(duì)不同類(lèi)型標(biāo)本的EGFR基因突變檢測(cè)分析比較*

山西省腫瘤醫(yī)院(研究所)中藥制劑室 (太原 030013)

朱秀卿 閻克里△# 史艷春△ 劉芳芳△

不同分析技術(shù)對(duì)不同類(lèi)型標(biāo)本的EGFR基因突變檢測(cè)分析比較*

山西省腫瘤醫(yī)院(研究所)中藥制劑室 (太原 030013)

朱秀卿 閻克里△#史艷春△劉芳芳△

目的： 比較DHPLC法和ARMS技術(shù)檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者3種不同類(lèi)型標(biāo)本的EGFR基因突變情況。方法：收集50例非小細(xì)胞肺癌患者的新鮮肺癌組織標(biāo)本、石蠟切片和血液標(biāo)本。分別用DHPLC法和ARMS技術(shù)同時(shí)檢測(cè)其3種不同類(lèi)型標(biāo)本的EGFR基因的突變情況。再用直接測(cè)序法來(lái)檢驗(yàn)以上3種類(lèi)型標(biāo)本的EGFR基因突變情況。結(jié)果：DHPLC法與直接測(cè)序法結(jié)果大致相同，ARMS技術(shù)檢出率明顯高于DHPLC法，兩組新鮮肺癌組織標(biāo)本的檢出率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，石蠟切片標(biāo)本和血液標(biāo)本的檢出率差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),(P<0.05)。ARMS技術(shù)中3種類(lèi)型標(biāo)本的檢出率相比，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 ：ARMS技術(shù)檢測(cè)新鮮肺癌組織EGFR基因突變的檢出率明顯高于DHPLC法和直接測(cè)序法，全血標(biāo)本的DHPLC法可作為EGFR基因的初篩檢測(cè)， ARMS技術(shù)可用于無(wú)法確認(rèn)的EGFR突變基因檢測(cè)。

表皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermal growth factor receptor，EGFR)表達(dá)于正常上皮細(xì)胞表面，但許多腫瘤中常有突變型EGFR的存在，從而導(dǎo)致EGFR的過(guò)表達(dá)，EGFR的過(guò)表達(dá)和腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、侵潤(rùn)、預(yù)后差等有關(guān)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，EGFR酪氨酸激酶區(qū)域的突變主要發(fā)生在18到21外顯子，其中以19和21號(hào)外顯子突變?yōu)橹?，覆蓋突變達(dá)90%[2]。

肺癌是我國(guó)乃至世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,其中非小細(xì)胞型肺癌(Non-smallcelllungcancer，NSCLC)約占所有肺癌的80%，NSCLC包括鱗狀細(xì)胞癌(鱗癌)、腺癌、大細(xì)胞癌等。一部分非小細(xì)胞型肺癌患者對(duì)EGFR-TKI治療敏感，由于NSCLC患者的EGFR基因突變與酪氨酸激酶區(qū)域密切相關(guān)[3]。本研究小組就DHPLC法、ARMS法和直接測(cè)序法對(duì)EGFR 基因突變的檢測(cè)及其對(duì)于不同標(biāo)本的檢出率進(jìn)行研究分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

資料與方法

1 一般資料 選取我院自2014年5月至2015年5月期間收治入院的非小細(xì)胞肺癌患者50例為研究對(duì)象(均經(jīng)我院病理科報(bào)告為病理診斷NSCLS患者)，其中男性37例(占74%)，女性13例(占26%)；年齡31～79歲，平均 49.2±12.7歲；包括鱗癌21例、腺癌18例、腺磷癌6例、細(xì)支氣管肺泡癌3例、粘液表皮樣癌2例；其中有吸煙史者38例，無(wú)吸煙史者12例。分別收集以上患者的新鮮肺癌組織標(biāo)本、石蠟切片和血液標(biāo)本各50例。

2 方 法

2.1 主要儀器設(shè)備與試劑：DNA 提取試劑盒，超凈工作臺(tái)，WAVER核苷酸片段分析儀(TRANSGENOMIC公司)，PCR儀(MJ Research公司)，移液器、低溫離心機(jī)(Eppendorf公司)，dNTP Mix(MBI Fermentas公司)，超高保真DNA聚合酶(Stratagene公司)，DNeasy Blood & Tissue Kit(Qiagen公司)，PCR引物(生工生物工程(上海)股份有限公司)；7500實(shí)時(shí)PCR操作系統(tǒng)，全自動(dòng)多功能酶標(biāo)檢測(cè)儀(Thermo 公司)，ADx?-EGFR試劑盒(廈門(mén)艾德生物醫(yī)藥科技有限公司)等等。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法：分別用DHPLC法和ARMS技術(shù)同時(shí)檢測(cè)50例非小細(xì)胞肺癌患者新鮮肺癌組織標(biāo)本、石蠟切片和血液標(biāo)本中的EGFR基因的突變情況。再用直接測(cè)序法來(lái)檢驗(yàn)以上3種類(lèi)型標(biāo)本的EGFR基因突變情況。對(duì)比分析上述3種類(lèi)型標(biāo)本的不同檢測(cè)方法的EGFR基因突變檢測(cè)結(jié)果，比較以上DHPLC法和ARMS技術(shù)兩種檢驗(yàn)技術(shù)EGFR基因突變的檢出率、比較DHPLC法和ARMS技術(shù)兩種檢驗(yàn)技術(shù)與直接測(cè)序法檢測(cè)的差異及3種不同標(biāo)本的EGFR基因突變檢出率。評(píng)估最適合臨床應(yīng)用于EGFR-TKI靶向治療前后的EGFR基因突變的檢測(cè)方法及標(biāo)本類(lèi)型。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件卡方檢驗(yàn)對(duì)以上3種方法EGFR突變檢出率的差異進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料采用c2檢驗(yàn)，以百分率(%)來(lái)表示，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

用DHPLC法檢測(cè)50例非小細(xì)胞肺癌患者新鮮肺癌組織標(biāo)本、石蠟切片和血液標(biāo)本中的EGFR基因的突變情況，其陽(yáng)性檢出率分別為新鮮肺癌組織標(biāo)本12例(占24%)、石蠟切片12例(占24%)和血液標(biāo)本11例(占22%)；用ARMS技術(shù)檢測(cè)50例非小細(xì)胞肺癌患者3種類(lèi)型標(biāo)本的EGFR基因的突變情況，其陽(yáng)性檢出率分別為新鮮肺癌組織標(biāo)本22例(占44%)、石蠟切片18例(占36%)和血液標(biāo)本19例(占38%)；用直接測(cè)序法檢測(cè)50例非小細(xì)胞肺癌患者3種類(lèi)型標(biāo)本的EGFR基因的突變情況，其陽(yáng)性檢出率分別為新鮮肺癌組織標(biāo)本13例(占26%)、石蠟切片12例(占24%)和血液標(biāo)本12例(占24%)；DHPLC法檢測(cè)結(jié)果與直接測(cè)序法一致，ARMS技術(shù)檢出率明顯高于DHPLC法，兩組新鮮肺癌組織標(biāo)本的檢出率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(c2=4.46，P=0.035)，石蠟切片標(biāo)本的檢出率差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(c2=1.71，P=0.19), 血液標(biāo)本的檢出率差異也不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(c2=3.05，P=0.05)。ARMS技術(shù)中3種類(lèi)型標(biāo)本的檢出率相比，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(c2=0.73，P=0.05)。

討 論

表皮生長(zhǎng)因子受體對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化等生理過(guò)程發(fā)揮著重要的作用[4]。有研究表明[5]，實(shí)體腫瘤中存在EGFR的高表達(dá)或異常表達(dá)，EGFR與腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成、腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及細(xì)胞凋亡的抑制有關(guān)。可能是由于EGFR的高表達(dá)引起下游信號(hào)傳導(dǎo)的增強(qiáng)，也可能是突變型EGFR受體或配體表達(dá)的增加導(dǎo)致EGFR的持續(xù)活化都有待進(jìn)一步證實(shí)。

非小細(xì)胞型肺癌生長(zhǎng)分裂較慢,擴(kuò)散轉(zhuǎn)移相對(duì)較晚，但75%的患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期，5年生存率很低。EGFR酪氨酸激酶區(qū)域的突變使得非小細(xì)胞型肺癌的治療與酪氨酸激酶抑制劑息息相關(guān)，表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)是目前被普遍接受的用于EGFR 基因突變的NSCLC 患者的靶向治療藥物。關(guān)于EGFR-TKI治療晚期非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的國(guó)內(nèi)外報(bào)道也屢見(jiàn)不鮮，因此對(duì)于EGFR 基因突變的檢測(cè)顯得尤為重要。目前醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室常用的幾種EGFR 基因突變的檢測(cè)方法有直接測(cè)序法(Direct sequencing)、Sanger雙脫氧鏈終止法 (Sanger測(cè)序法)、突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)(Amplification refractory mutation system，ARMS技術(shù))、變性高效液相色譜原理(DHPLC技術(shù))、熒光原位雜交技術(shù)(Fluorescence in situ hybridization ，F(xiàn)ISH)，本研究小組就此進(jìn)行研究分析，得出以下結(jié)論：ARMS技術(shù)檢測(cè)新鮮肺癌組織EGFR基因突變的檢出率明顯高于DHPLC法和直接測(cè)序法，而DHPLC法隨與直接測(cè)序法檢出率無(wú)太大差異，但DHPLC法操作更簡(jiǎn)便，成本較低。全血標(biāo)本的DHPLC法檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌的EGFR基因可作為初篩檢測(cè)，對(duì)于無(wú)法確認(rèn)的EGFR突變基因可采用ARMS技術(shù)檢測(cè)患者的新鮮肺癌組織EGFR基因。

[1] 王孟昭，陳閩江. 表皮生長(zhǎng)因子受體-酪氨酸激酶抑制劑對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移的療效[J]. 中華結(jié)核和呼吸雜志,2014,37(3):169-171.

[2] 張永奎，竺王玉，何劍營(yíng)，等. 舟山海島地區(qū)非小細(xì)胞肺癌EGFR基因19和21外顯子突變與臨床病理特征的關(guān)系[C]. 2012.

[3] 王生海. HSP90α在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)與EGFR基因突變?cè)诜蜗侔┲嘘P(guān)系的研究[D]. 河北醫(yī)科大學(xué),2014.

[4] Huang Z, Wang Y, Nayak PS,etal. Stretch-induced fetal type II cell differentiation is mediated via ErbB-ErbB4 interactions,” e[J]. Journal of Biological Chemistry,2012,287,(22):18091-18102.

[5] Kumar A, Kumar M, Jaiswal R,etal. Presence of Human papilloma virus and EGFR expression does not predict response to Neoadjuvant chemotherapy in oral cancer[J]. World Journal of Surgical Medical & Radiation Oncology,2012,1(20):103-110.

(收稿：2015-06-20)

*山西省衛(wèi)生廳科研課題(201201007)

肺腫瘤 @EGFR基因 基因轉(zhuǎn)變

R734.2

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.12.051

△山西省腫瘤醫(yī)院(研究所)藥理研究室

#通訊作者