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    血凝抑制試驗(yàn)易出現(xiàn)的問題與糾正方法

    2015-04-04 15:43:32吳召坤陜西省丹鳳縣畜牧獸醫(yī)中心
    獸醫(yī)導(dǎo)刊 2015年10期
    關(guān)鍵詞:血凝效價環(huán)境溫度

    吳召坤/陜西省丹鳳縣畜牧獸醫(yī)中心

    本人在獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室工作十余年,最常做的就是血凝抑制試驗(yàn),血凝抑制試驗(yàn)常用于雞新城疫、禽流感等疫病的抗體檢測與流行病學(xué)調(diào)查,疫病診斷、防疫監(jiān)測、免疫程序的制定等工作中,該試驗(yàn)要求操作規(guī)范,精心細(xì)致,取量精確,判定及時準(zhǔn)確,在操作的過程中,稍有失誤,就會使試驗(yàn)出現(xiàn)偏差,導(dǎo)致試驗(yàn)失敗。本人通過長期的實(shí)際工作,總結(jié)經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn),現(xiàn)將試驗(yàn)過程中常出現(xiàn)的問題進(jìn)行列舉,分析,提出糾正方法。

    (一)在測定抗原血凝效價時,1~11孔全部百分之百凝集,判定不出抗原效價

    原因:抗原效價高,超出血凝板測定范圍,解決辦法,將抗原做倍比稀釋2~3次再測即可。

    (二)在測定抗原血凝效價或抗體抑制價時發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞即不被抗原凝集,又不被抗體抑制凝集,1~12孔全部為淡紅色

    原因:紅細(xì)胞溶血。解決的辦法:重新配制1%的紅細(xì)胞,正常的1%紅細(xì)胞懸液靜置4~6h后,紅細(xì)胞沉于溶器底部,上清液清亮透明。

    紅細(xì)胞發(fā)生溶血的原因有:

    (1)紅細(xì)胞保存時間太長,超過使用期限。

    (2)紅細(xì)胞懸液凍溶。

    (3)PBS液配制不準(zhǔn)確。

    (三)標(biāo)準(zhǔn)陽性血清的抗體效價誤差大于1個滴度

    原因1:4個血凝單位抗原配制不準(zhǔn)確,4單位抗原要現(xiàn)用現(xiàn)配,混合均勻,配好的抗原室溫下放置不超過4h,不可反復(fù)凍融。為了防止4單位抗原配制不準(zhǔn)確,在作血凝抑制試驗(yàn)前必須作回歸試驗(yàn)來測定4單位抗原是否準(zhǔn)確。方法是:在血凝板的1~4排1~5孔各加0.025mlPBS 液,取配好的 4 單位抗原0.025ml加入反應(yīng)板的第一孔內(nèi),混勻后吸取0.025ml加入第二孔,依次倍比稀釋至第4孔,從第4孔吸取0.025ml棄去,第5孔做對照,1 ~ 5 孔 各 加 0.025mlpbs液,1~5孔各加1%紅細(xì)胞懸液,震蕩混勻,20℃~25℃靜置40min后觀察結(jié)果,若1~2孔紅細(xì)胞完全凝集,3~4孔不凝集,則說明4單位抗原配制準(zhǔn)確,否則需重新測定抗原效價,配制4單位抗原,并作回歸試驗(yàn)。直至結(jié)果準(zhǔn)確。

    原因2:陽性對照血清效價降低,陽性對照血清經(jīng)反復(fù)凍融,長期保存或保存不當(dāng),就會使抗體效價降低,因此,陽性對照血清不可反復(fù)凍融,若要長期保存必須保存在-15℃以下,不得超過保質(zhì)期。

    (四)結(jié)果出現(xiàn)慢

    原因:環(huán)境溫度過低,如果環(huán)境溫度低于20℃時,結(jié)果就會出現(xiàn)慢,需延長時間才能出現(xiàn)結(jié)果,因此在作試驗(yàn)時應(yīng)將環(huán)境調(diào)到20℃~25℃。

    (五)結(jié)果出現(xiàn)快,而且整板無凝集

    當(dāng)試驗(yàn)環(huán)境溫度超過30℃時,反應(yīng)速度加快,試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)快,往往在20min左右就可讀數(shù),一旦時間過長,結(jié)果就會消失,使整板無凝集現(xiàn)象,會誤認(rèn)為抗體滴度為10log2。因而要求試驗(yàn)溫度應(yīng)控制在20℃~25℃之間,反應(yīng)40min及時讀數(shù)判定,不可長時間拖延讀數(shù)時間。

    (六)整板無紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象

    當(dāng)試驗(yàn)環(huán)境溫度在20℃~25℃時,經(jīng)40min,整板無凝集,整板無紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象有以下四種可能:一是8份血清抗體滴度均為10log2,二是試驗(yàn)過程中全板少了加4單位抗原步驟。三是4單位抗原已失效。四是環(huán)境溫度過高,反應(yīng)速度加快,讀數(shù)時間拖延。

    如果整板無紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象時,首先要查明原因,方法是用微量移液器吸取每孔內(nèi)的混懸液,當(dāng)每孔內(nèi)的混懸液容量為0.075ml時,可能是一、三、四項(xiàng)原因。當(dāng)每孔內(nèi)的混懸液容量為0.05ml時,可能是第二項(xiàng)原因。因而要對試驗(yàn)過程仔細(xì)分析,查明原因。無論那種原因引起的全板無凝集現(xiàn)象,都必須重新檢測,如果是第三項(xiàng)原因引起的,要重新配制4單位抗原,注意操作過程中專心細(xì)致,隨時檢查操作過程是否漏掉了某些步驟,規(guī)范操作,控制好試驗(yàn)過程中的環(huán)境溫度,及時判定結(jié)果。

    (七)八份被檢樣品的抗體效價均為 1log2

    原因1:可能8份被檢血清加后未進(jìn)行倍比稀釋,這種情況一般發(fā)生在使用八通道移液器時遺漏了將被檢血清作倍比稀釋這一環(huán)節(jié),第一孔由于抗體滴度高發(fā)生全部抑制凝集,而2~11孔無抗體,則完全凝集(第11孔為抗原對照孔)。原因查找:用微量移液器吸取第一孔混懸液,若容量為0.1ml,而2~10孔混懸液均為0.075ml,即為這一原因造成。

    原因2:當(dāng)排除原因1后,也可能8份被檢血清抗體效價均為1log2,這種情況很少發(fā)生。

    在作試驗(yàn)的過程中,一定要嚴(yán)格按照操作規(guī)程,規(guī)范操作,仔細(xì)專心,避免打岔干擾,從使用器具的清洗消毒到試劑的配制,以及試驗(yàn)操作過程的每個步驟都要認(rèn)真細(xì)致,不能馬虎,做到科學(xué)、認(rèn)真、準(zhǔn)確,才能把試驗(yàn)做的更精確,無誤差,正確指導(dǎo)動物疫病防控工作。

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