宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)變化及意義

單莉，郝春妮(煙臺(tái)山醫(yī)院，山東煙臺(tái)264001)

宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)變化及意義

單莉，郝春妮
(煙臺(tái)山醫(yī)院，山東煙臺(tái)264001)

摘要:目的觀察宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的表達(dá)變化，并探討其意義。方法108例宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者，手術(shù)切除腫瘤組織，免疫組化學(xué)染色觀察宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中、Foxp3+、GranzymeB+、細(xì)胞的分布，同時(shí)對(duì)其進(jìn)行計(jì)數(shù)。分析其與患者臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者Foxp3+細(xì)胞數(shù)量癌內(nèi)大于癌周、細(xì)胞數(shù)量癌周大于癌內(nèi)(P均＜0.05)。宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中細(xì)胞數(shù)量與臨床分期有關(guān)，F(xiàn)oxp3+細(xì)胞數(shù)量與病理分級(jí)有關(guān)和Foxp3+細(xì)胞數(shù)量與淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均＜0.05)。宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織Foxp3+細(xì)胞與患者無(wú)瘤生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)(HR: 2.217，95%CI: 1.843～2.671，P=0.012)，與總生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)(HR: 2.451，95% CI: 1.992 ～2.734，P=0.033)。結(jié)論宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織內(nèi)、細(xì)胞數(shù)量增多，F(xiàn)oxp3+細(xì)胞數(shù)量減少。Foxp3+細(xì)胞是宮頸鱗狀細(xì)胞癌術(shù)后的獨(dú)立預(yù)后因素。

關(guān)鍵詞:宮頸腫瘤;宮頸鱗狀細(xì)胞癌;免疫微環(huán)境;免疫逃逸;腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞

宮頸鱗狀細(xì)胞癌是常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅婦女的健康和生命。關(guān)于宮頸鱗狀細(xì)胞癌的預(yù)后因素研究一直聚焦于腫瘤細(xì)胞本身，較少研究與腫瘤局部免疫微環(huán)境指標(biāo)的關(guān)系。腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞是存在于腫瘤間質(zhì)內(nèi)以T細(xì)胞為主的一種異質(zhì)性淋巴細(xì)胞群體，是機(jī)體淋巴細(xì)胞浸入到腫瘤組織內(nèi)部對(duì)腫瘤的抵抗現(xiàn)象，它們的抗腫瘤免疫效應(yīng)主要是細(xì)胞免疫反應(yīng)［1，2］。本研究主要的腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的亞型有、Foxp3+細(xì)胞，暫未列入細(xì)胞［3，4］。本研究觀察了宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的表達(dá)變化，并探討其意義。

1　資料與方法

1.1臨床資料選取2010年1月～2014年12月在煙臺(tái)山醫(yī)院住院手術(shù)的宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者108例，年齡35～72(45.3±9.6)歲，均有完整的臨床病理資料。依據(jù)國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO，2000年)修訂的臨床分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期42例、Ⅱ期31例、Ⅲ期35 例;病理分級(jí): G1級(jí)30例、G2級(jí)43例、G3級(jí)35例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移41例?；颊呔惺中g(shù)完整切除腫瘤，組織學(xué)檢查切緣陰性。排除標(biāo)準(zhǔn):曾接受過(guò)放化療及免疫治療;合并免疫系統(tǒng)疾病;合并慢性消耗性疾病及傳染病;合并有其他類型惡性腫瘤。

1.2腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞檢測(cè)及其與宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后的關(guān)系分析方法采用免疫組化法檢測(cè)108例宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者腫瘤組織中NK細(xì)胞、Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)、GranzymeB+活化的細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞、CD45RO+記憶T細(xì)胞、細(xì)胞毒T細(xì)胞的數(shù)量。用不同的單克隆抗體［鼠抗人CD45RO、鼠抗人CD57、兔抗人CD8、鼠抗人GranzymeB購(gòu)自Maixin-Bio(邁新生物)，F(xiàn)oxp3+抗體購(gòu)自BioLegend(USA)］對(duì)上述細(xì)胞行免疫組化染色。二抗為L(zhǎng)eica-二抗套裝試劑。采用Leica公司的全自動(dòng)免疫組化染色一體機(jī)，所有步驟由Bond-Max自動(dòng)完成。在400倍高倍顯微鏡下觀察陽(yáng)性細(xì)胞(細(xì)胞膜或細(xì)胞核呈棕色或棕黑色顆粒者判定為陽(yáng)性細(xì)胞)。采用電腦圖像采集系統(tǒng)隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野拍照，再用圖像分析軟件(NIH Image 1.46 bundled with 64-bit Java)計(jì)算總陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。由2位高年資病理科醫(yī)師讀片，采取雙盲交叉讀片，取平均值?；颊吲R床病理資料包括年齡、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤分化程度、術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移情況等。生存期從手術(shù)當(dāng)天計(jì)算，終止日期為死亡日期或末次隨訪日，所有病例截止日期為2014年6月31日。對(duì)可疑復(fù)發(fā)者進(jìn)行強(qiáng)化CT和(或) MR掃描來(lái)確診復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移。分析上述免疫細(xì)胞與患者臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以珋x±s表示，多組間比較采用one-way ANOVA，兩組間比較用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料比較用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn);相關(guān)分析采用Spearman相關(guān);累積生存時(shí)間和累積生存率計(jì)算采用Kaplan-Meier法，生存檢驗(yàn)采用Log-rank檢驗(yàn);用Cox回歸模型作單因素和多因素與預(yù)后關(guān)系的分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的分布、數(shù)量除Foxp3+陽(yáng)性染色細(xì)胞為細(xì)胞核棕色著色外，其余細(xì)胞均呈細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞膜棕色染色。細(xì)胞呈圓形或橢圓形，散在分布于腫瘤細(xì)胞和周圍間質(zhì)中，沒(méi)有明顯的密集趨勢(shì)。GranzymeB+陽(yáng)性染色呈顆粒狀的細(xì)胞質(zhì)著色，細(xì)胞無(wú)密集趨勢(shì)，均散在分布于癌組織、周圍增生的纖維組織中，棕色陽(yáng)性顆粒可環(huán)繞細(xì)胞呈圓形或半圓形。CD45RO+陽(yáng)性細(xì)胞呈細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜棕褐色，細(xì)胞體積較小，大部分彌散性分布。細(xì)胞為細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色染色的小圓細(xì)胞。宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者癌內(nèi)、癌旁組織中細(xì)胞分別為30.15±細(xì)胞分別為340.53±50.11、430.29±38.74，GranzymeB+細(xì)胞分別為29.03±1.53、40.37±3.42細(xì)胞分別為128.71 ±22.73、240.38±37.97，F(xiàn)oxp3+細(xì)胞分別為31.03 ±2.41、19.32±3.56，兩者比較，P均＜0.05。

2.2宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中細(xì)胞數(shù)量與患者臨床分期有關(guān)(P均＜0.05)，腫瘤臨床分期越高細(xì)胞局部浸潤(rùn)越少。宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中Foxp3+和細(xì)胞數(shù)量與患者病理分級(jí)有關(guān)(P均＜0.05)，腫瘤分化越差患者Foxp3+細(xì)胞越多，腫瘤分化越好患者細(xì)胞越多。宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中細(xì)胞數(shù)量與患者淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均＜0.05)，有淋巴轉(zhuǎn)移的患者Foxp3+細(xì)胞越多，無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移的細(xì)胞越多。詳見(jiàn)表1。

表1　宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞數(shù)量與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系(個(gè)，±s)

臨床病理參數(shù)　n　CD+57　CD45RO+　GranzymeB+　CD+8　Foxp3+年齡≤40歲　35　29.65±2.56　346.78±98.54　28.43±6.21　126.65±23.97　30.23±4.56 ＞40歲　73　30.42±6.16　334.53±65.11　29.85±3.47　130.91±31.17　31.77±7.23臨床分期Ⅰ42　28.32±3.61　394.28±64.14　29.72±5.33　149.83±25.14　28.41±4.34 Ⅱ31　31.77±2.79　336.43±23.77　28.63±2.37　124.74±35.36　30.28±5.16 Ⅲ35　29.32±1.57　287.24±71.35　29.09±3.24　96.23±13.42　30.13±3.75病理分級(jí)G1　30　27.57±9.47　380.79±31.11　30.41±2.31　121.37±13.41　36.24±5.6 G2　43　29.91±3.04　326.88±26.12　29.04±4.27　128.43±13.54　30.27±1.02 G3　35　28.97±1.45　286.27±24.41　28.78±3.44　128.17±12.87　25.97±3.47淋巴轉(zhuǎn)移有41　31.22±3.82　328.59±79.31　27.13±1.25　106.43±18.64　39.27±3.86 無(wú)67　28.89±2.63　357.64±81.35　29.23±3.51　147.59±18.17　22.23±4.76

2.3宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞與患者預(yù)后的關(guān)系108例患者整體的5年無(wú)瘤生存率分別為53.70%，總生存率為47.22%。中位隨訪時(shí)間為28個(gè)月(3～80個(gè)月)。主要死于腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。使用X-tile軟件計(jì)算出的最小P值作為cutoff值將各腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞分成高浸潤(rùn)組、低浸潤(rùn)組。CD5+7細(xì)胞cut-off值為29.36，高浸潤(rùn)組45例、低浸潤(rùn)組63例; CD45RO+細(xì)胞cut-off值為310.58，高浸潤(rùn)組68例、低浸潤(rùn)組40例; CD8+細(xì)胞cut-off值為115.71，高浸潤(rùn)組60例、低浸潤(rùn)組48例; GranzymeB+細(xì)胞cut-off值為28.47，高浸潤(rùn)組57例、低浸潤(rùn)組51例; Foxp3+細(xì)胞cut-off值為27.17，高浸潤(rùn)組49例、低浸潤(rùn)組59例。COX單因素生存分析顯示，患者無(wú)瘤生存時(shí)間(DFS)與宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織CD8+細(xì)胞(HR: 0.997，95% CI: 0.684～1.314，P=0.028)呈正相關(guān)、Foxp3+細(xì)胞(HR: 2.217，95%CI: 1.843～2.671，P=0.012)呈負(fù)相關(guān);患者總生存時(shí)間(OS)與宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織CD8+細(xì)胞(HR: 1.057，95%CI: 0.792～1.372，P=0.046)呈正相關(guān)、Foxp3+細(xì)胞(HR: 2.451，95% CI: 1.992～2.734，P=0.033)呈負(fù)相關(guān);患者DFS、OS與癌組織CD5+7、CD45RO+、GranzymeB+細(xì)胞無(wú)關(guān)。COX多因素生存分析顯示，宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織Foxp3+細(xì)胞與患者DFS呈負(fù)相關(guān)(HR: 2.217，95% CI: 1.843～2.671，P=0.012)，與OS呈負(fù)相關(guān)(HR: 2.451，95%CI: 1.992～2.734，P=0.033)。

3　討論

作為腫瘤與機(jī)體作用的主要部位，腫瘤局部免疫反應(yīng)在一定程度上反映了機(jī)體抗腫瘤免疫的總體水平。腫瘤局部的免疫以特異性的細(xì)胞免疫為主導(dǎo)，其效應(yīng)細(xì)胞為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞。NK細(xì)胞具有無(wú)需抗原刺激即能殺傷腫瘤細(xì)胞的能力。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞被一致認(rèn)為是最主要的免疫效應(yīng)細(xì)胞［1，5］?；罨募?xì)胞毒性T細(xì)胞以GranzymeB+為標(biāo)志物?？乖禺愋杂洃汿淋巴細(xì)胞可以在特定細(xì)胞因子的作用下分化為效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，也可以像干細(xì)胞一樣自我更新、繼續(xù)分化為記憶/效應(yīng)細(xì)胞，因此記憶T細(xì)胞可以作為T(mén)細(xì)胞活化標(biāo)志［3，4］。Foxp3+Treg具有免疫無(wú)能性和免疫抑制性兩大功能。以上細(xì)胞均在局部免疫微環(huán)境中發(fā)揮著免疫監(jiān)視、免疫效應(yīng)、殺傷腫瘤細(xì)胞的作用［6，7］。

本研究發(fā)現(xiàn)宮頸鱗狀細(xì)胞癌周圍的、細(xì)胞數(shù)量明顯多于癌內(nèi)部，這表明機(jī)體在腫瘤周圍的免疫反應(yīng)明顯強(qiáng)于腫瘤內(nèi)部。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，宮頸鱗狀細(xì)胞癌的臨床分期越晚，細(xì)胞局部浸潤(rùn)越少;腫瘤分化越差，CD45RO+細(xì)胞越少，這說(shuō)明隨著病情進(jìn)展，腫瘤晚期內(nèi)部微環(huán)境的免疫抑制狀態(tài)越來(lái)越嚴(yán)重。同時(shí)，細(xì)胞在有淋巴轉(zhuǎn)移的宮頸鱗狀細(xì)胞癌中數(shù)量少于無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移者，提示腫瘤是否發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移與局部免疫反應(yīng)有密切關(guān)系。

本研究還發(fā)現(xiàn)宮頸鱗狀細(xì)胞癌內(nèi)的Foxp3+細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量較腫瘤周圍多。說(shuō)明腫瘤內(nèi)微環(huán)境中，T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)受到了抑制。類似的差異也見(jiàn)于許多實(shí)體腫瘤，如胃癌、肺癌等。腫瘤局部Foxp3+Treg細(xì)胞數(shù)量反映了在腫瘤內(nèi)部宿主與腫瘤之間的免疫活動(dòng)。有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)能抑制腫瘤細(xì)胞的潛在侵襲性，具有免疫抑制能力的Foxp3+Treg細(xì)胞則可能放任腫瘤侵襲［8，9］。這也進(jìn)一步可以解釋，在較差臨床分期的宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中有高浸潤(rùn)的Foxp3+Treg細(xì)胞?？梢?jiàn)，宮頸鱗狀細(xì)胞癌局部微環(huán)境中免疫抑制與免疫效應(yīng)作用的力量對(duì)比關(guān)系決定了局部的免疫狀態(tài)，并影響甚至決定了腫瘤的進(jìn)展方向，局部免疫效應(yīng)作用越強(qiáng)越不利于腫瘤生長(zhǎng)侵襲，局部免疫抑制作用越強(qiáng)越有利于腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。

通過(guò)Cox單因素和多因素生存分析發(fā)現(xiàn)，宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織內(nèi)Foxp3+Treg細(xì)胞數(shù)量的多少是宮頸鱗狀細(xì)胞癌術(shù)后的獨(dú)立預(yù)后因素。有研究［10］曾報(bào)道Foxp3+Treg細(xì)胞高浸潤(rùn)是胃癌的獨(dú)立預(yù)后因素。可見(jiàn)，Treg對(duì)免疫環(huán)境起負(fù)性作用，局部高浸潤(rùn)Treg細(xì)胞可能直接導(dǎo)致宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者有較差的預(yù)后。其可能的機(jī)制主要是通過(guò)各種途徑直接或間接抑制效應(yīng)性T細(xì)胞的增殖，活化及抑制T細(xì)胞和NK細(xì)胞對(duì)腫瘤的殺傷作用［11］;引起DC細(xì)胞的凋亡［12］;競(jìng)爭(zhēng)抑制IL-2［8］等影響效應(yīng)T細(xì)胞對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答。

參考文獻(xiàn):

［1］Zubieta MR，F(xiàn)urman D，Barrio M，et al.Galectin-3 expression correlates with apoptosis of tumor-associated lymphocytes in human melanoma biopsies［J］.Am J Pathol，2006，168(5) : 1666-1675.

［2］Lee HE，Chae SW，Lee YJ，et al.Prognostic implications of type and density of tumour-infiltrating lymphocytes in gastric cancer ［J］.Br J Cancer，2008，99(10) : 1704-1711.

［3］Zou W.Regulatory T cells，tumour immunity and immunotherapy ［J］.Nat Rev Immunol，2006，6(4) : 295-307.

［4］Wada Y，Nakashima O，Kutami R，et al.Clinicopathological study on hepatocellular carcinoma with lymphocytic infiltration［J］.Hepatology，1998，27(2) : 407-414.

［5］Naito Y，Saito K，Shiiba K，et al. T cells infiltrated within cancer cell nests as a prognostic factor in human colorectal cancer ［J］.Cancer Res，1998，58(16) : 3491-3494.

［6］Ling KL，Pratap SE，Bates GJ，et al.Increased frequency of regulatory T cells in peripheral blood and tumour infiltrating lymphocytes in colorectal cancer patients［J］.Cancer Immun，2007，(7) :7.

［7］Bates GJ，F(xiàn)ox SB，Han C，et al.Quantification of regulatory T cells enables the identification of high-risk breast cancer patients and those at risk of late relapse［J］.J Clin Oncol，2006，24(34) : 5373-5380.

［8］Perrone G，Ruffini PA，Catalano V，et al.Intratumoural FOXP3-positive regulatory T cells are associated with adverse prognosis in radically resected gastric cancer［J］.Eur J Cancer，2008，44 (13) : 1875-1882.

［9］張家麗，任秀寶.小細(xì)胞肺癌組織微環(huán)境中VEGF與DC成熟及Treg關(guān)系的探討［J］.中國(guó)癌癥雜志，2012，22(7) : 25-28.

［10］Xia M，Zhao MQ，Wu K，et al.Investigations on the clinical significance of FOXP3 protein expression in cervical oesophageal cancer and the number of Foxp3+tumour-infiltrating lymphocytes ［J］.J Int Med Res，2013，41(4) : 1002-1008.

［11］Grossman WJ，Verbsky JW，Barchet W，et al.Human T regulatory cells can use the perforin pathway to cause autologous target cell death［J］.Immunity，2004，21(4) : 589-601.

［12］Ichihara F，Kono K，Takahashi A，et al.Increased populations of regulatory T cells in peripheral blood and tumor-infiltrating lymphocytes in patients with gastric and esophageal cancers［J］.Clin Cancer Res，2003，9(12) : 4404-4408.

(收稿日期:2015-01-21)

文章編號(hào):1002-266X(2015) 19-0061-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:B

中圖分類號(hào):R737.33

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.19.022