膠質(zhì)瘤組織中miR-200b與CD133的表達(dá)變化及意義

劉愛群，余青云，彭忠興，黃葉青，刁勝朋，程靜，王文濤，洪銘范(廣東藥學(xué)院附屬第一醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)院，廣州510008)

膠質(zhì)瘤組織中miR-200b與CD133的表達(dá)變化及意義

劉愛群，余青云，彭忠興，黃葉青，刁勝朋，程靜，王文濤，洪銘范
(廣東藥學(xué)院附屬第一醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)院，廣州510008)

摘要:目的觀察膠質(zhì)瘤組織中miR-200b和CD(133)的表達(dá)變化，并探討其意義。方法將80例膠質(zhì)瘤患者作為試驗(yàn)組、另選擇20例接受開顱手術(shù)的腦外傷或腦出血患者為對(duì)照組。采用原位雜交和免疫組化技術(shù)檢測(cè)試驗(yàn)組膠質(zhì)瘤組織及對(duì)照組正常大腦組織中的miR-200b與CD(133)，分析膠質(zhì)瘤組織中miR-200b與CD(133)的相關(guān)性及其與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果試驗(yàn)組miR-200b陽性表達(dá)率(32.65%，32/80)與對(duì)照組(80.00%，16/20)比較，P=0.001。試驗(yàn)組CD(133)陽性表達(dá)率(67.50%，54/80)與對(duì)照組(15.00%，3/20)比較，P=0.000。試驗(yàn)組miR-200b與CD(133)的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=－0.09，P=0.006)。試驗(yàn)組miR-200b和CD(133)表達(dá)與患者病理分期有關(guān)(P均＜0.05)，與性別、年齡無關(guān)。結(jié)論膠質(zhì)瘤組織中miR-200b低表達(dá)、CD(133)高表達(dá)，兩者均與膠質(zhì)瘤病理分期有關(guān)。

關(guān)鍵詞:腦腫瘤;膠質(zhì)瘤;微小RNA-200b;分化抗原簇蛋白133

微小RNA(miRNAs)是重要的調(diào)控因子，能調(diào)控細(xì)胞的增殖、分裂、分化、凋亡等過程。研究［1～4］表明，miR-200b在腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，對(duì)多種腫瘤具有抑制作用。CD133是干細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞表面特異標(biāo)志蛋白，在白血病和乳腺癌中表達(dá)上調(diào)［5，6］。研究［7］顯示，miR-200b可通過靶向調(diào)控CD133的表達(dá)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、侵襲以及干細(xì)胞的形成。本研究采用免疫組化和原位雜交技術(shù)，分析膠質(zhì)瘤組織中miR-200b和CD133的表達(dá)變化，并探討其意義。

1　資料與方法

1.1臨床資料選擇南華大學(xué)第一附屬醫(yī)院2010 年3月～2014年2月收治并確診為膠質(zhì)瘤的80例患者(試驗(yàn)組)，術(shù)前均未行放化療，手術(shù)切除腫瘤組織。其中男44例、女36例，年齡7～62歲、中位年齡42歲;根據(jù)WHO腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ級(jí)15例、Ⅱ級(jí)27例、Ⅲ級(jí)30例、Ⅳ級(jí)8例。病理診斷結(jié)果均由2名以上病理科醫(yī)生共同確診。另將20例接受開顱手術(shù)的腦外傷或腦出血患者作為對(duì)照組，其腦組織經(jīng)HE染色證實(shí)為非腫瘤組織。兩組一般資料具有可比性。

1.2主要試劑原位雜交檢測(cè)試劑盒與ElivisionTMPlus二步法免疫組化試劑盒均購自武漢博士德公司，DAB顯色劑購自北京中杉金橋公司，地高辛標(biāo)記的miR-200b探針序列購自美國Exiqon公司，CD133單克隆抗體購自CST公司。

1.3miR-200b與CD133檢測(cè)及分析方法①原位雜交檢測(cè)膠質(zhì)瘤組織與正常大腦組織中的miR-200b。切片后脫蠟至水。3%胃蛋白酶消化20～30 min，水洗后4%甲醛固定。按miRNAs原位雜交說明，探針用無酶水稀釋，稀釋比例為1∶500，先用預(yù)雜交液于55℃預(yù)雜交2 h后再用地高辛標(biāo)記的miR-200b探針于55℃進(jìn)行雜交過夜。次日于不同濃度SSC緩沖液中徹底洗滌干凈。室溫封閉30 min。生物素化鼠抗地高辛室溫孵育2 h。DAB顯色并于鏡下控制顯色時(shí)間，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，充分水洗，中性樹膠封片保存。②免疫組化檢測(cè)膠質(zhì)瘤組織與正常大腦組織中的CD133。采用ElivisionTMPlus二步法，切片后脫蠟至水。按需要對(duì)切片進(jìn)行高壓修復(fù)，冷卻至室溫，PBS液洗凈。每張切片加50 μL一抗體，室溫下孵育4℃過夜，PBS洗凈后每張切片加50 μL生物素標(biāo)記的二抗體，室溫下孵育10 min。PBS洗凈，每張切片加50 μL鏈霉菌抗生物素蛋白—過氧化物酶溶液，室溫下孵育10 min，PBS洗凈后DAB溶液顯色，鏡下控制顯色時(shí)間，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，充分水洗，中性樹膠封片保存。③免疫組化和原位雜交結(jié)果分析。miR-200b 與CD133呈棕黃色顆粒的陽性信號(hào)定位于膠質(zhì)細(xì)胞與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中。綜合陽性信號(hào)的染色強(qiáng)度和分布范圍進(jìn)行半定量，陽性強(qiáng)弱按以下標(biāo)準(zhǔn)判斷［1］。每個(gè)標(biāo)本于高倍光鏡下觀察5個(gè)具有代表性的視野，對(duì)陽性染色的細(xì)胞比例和染色程度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。組織細(xì)胞陽性染色程度計(jì)分:陰性計(jì)1分;+ 計(jì)2分;++計(jì)3分;+++計(jì)4分;組織細(xì)胞陽性細(xì)胞分布比例計(jì)分:染色細(xì)胞小于10%計(jì)1分;染色細(xì)胞10%～50%計(jì)2分;染色細(xì)胞51%～75%計(jì)3分;染色細(xì)胞大于75%計(jì)4分。兩種得分相乘，＜8為低表達(dá)，≥8為高表達(dá)。顯微攝像后運(yùn)用病理圖像分析系統(tǒng)對(duì)光密度值進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以珋x±s表示，組間比較用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料比較用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析用Spearman檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

試驗(yàn)組miR-200b陽性表達(dá)率(32.65%，32/80)與對(duì)照組(80.00%，16/20)比較，χ2=10.26，P=0.001。試驗(yàn)組CD133陽性表達(dá)率(67.50%，54/80)與對(duì)照組(15.00%，3/20)比較，χ2=17.99，P=0.000。試驗(yàn)組miR-200b與CD133的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=－0.09，P=0.006)。試驗(yàn)組miR-200b與CD133的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系見表1。miR-200b和CD133表達(dá)與與患者病理分期有關(guān)(P均＜0.05)，與性別、年齡無關(guān)。

3　討論

miRNAs通過調(diào)控其靶基因影響一系列mRNAs的表達(dá)，從而在生理和病理學(xué)過程中發(fā)揮重要作用。越來越多的研究［8］表明，大量的miRNAs在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程(細(xì)胞的增殖、干細(xì)胞自我更新以及分化)中發(fā)揮癌基因或抑癌基因作用。大量miRNAs的異常表達(dá)與膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)，如miR-34a［9］、miR-203［10］、miR-22［11］在膠質(zhì)瘤中表達(dá)下調(diào); miR-372［12］、miR-17［13］、miR-221/222［14］在膠質(zhì)瘤中表達(dá)上調(diào)，為膠質(zhì)瘤患者不良預(yù)后的重要標(biāo)志物。由此可見，具有癌基因或抑癌基因樣作用的miRNAs可能與人類膠質(zhì)瘤的發(fā)生密切相關(guān)。最近的研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs的表達(dá)與多形性膠質(zhì)瘤母細(xì)胞瘤(GBM)患者的總生存期和疾病進(jìn)展的時(shí)間相關(guān)。Srinivasan等［15］分析了222例同時(shí)進(jìn)行了放化療再輔以TMZ治療的GBM患者的10個(gè)miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-20a、miR-106a和miR-17-5p在長期存活的患者中高表達(dá)，而miR-221/222、miR-148a、miR-31、miR-146b和miR-193a在短期存活的患者中高表達(dá)。一些miRNAs如miR-181c、miR-21、miR-221/222、miR-195、miR-146a與膠質(zhì)瘤細(xì)胞放化療抵抗相關(guān)，表明這些miRNAs具有預(yù)測(cè)特性。

miR-200家族成員包括miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429，其中miR-200b-200a-429簇位于1p36染色體，而miR-200c-141簇位于12p13染色體［16］。在功能上，miR-200家庭成員可以調(diào)控一系列轉(zhuǎn)錄因子，包括Zeb1、Ets-1、Suz12［17］。在膠質(zhì)瘤中，miR-200b通過靶向CREB1抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖［18］。Tang等［1］研究顯示，miR-200b在胃癌組織中表達(dá)下調(diào)，并且其表達(dá)狀態(tài)與胃癌患者的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及預(yù)后生存相關(guān)。然而Cao等［19］顯示，miR-200b在卵巢癌中表達(dá)上調(diào)，并且與患者的臨床分期、組織分化程度以及預(yù)后生存相關(guān)。CD133是一種常見的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物，最初在造血干細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)。CD133在多種實(shí)體腫瘤中高表達(dá)，如乳腺癌［6］、結(jié)腸癌［20］、肺癌［21］，并可作為腫瘤患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。本研究結(jié)果表明，膠質(zhì)瘤組織中miR-200b低表達(dá)、CD133高表達(dá)，miR-200b的陽性表達(dá)率隨著膠質(zhì)瘤惡性程度的增加而降低、CD133的陽性表達(dá)率隨著膠質(zhì)瘤惡性程度的增加而增高。可見，膠質(zhì)瘤組織中miR-200b與CD133的表達(dá)與患者病情程度有關(guān)。

參考文獻(xiàn):

［1］Tang H，Deng M，Tang Y，et al.miR-200b and miR-200c as prognostic factors and mediators of gastric cancer cell progression ［J］.Clin Cancer Res，2013，19(20) : 5602-5612.

［2］Manavalan TT，Teng Y，Litchfield LM，et al.Reduced expression of miR-200 family members contributes to antiestrogen resistance in LY2 human breast cancer cells［J］.PLoS One，2013，8 (4) : e62334.

［3］Toiyama Y，Hur K，Tanaka K，et al.Serum miR-200c is a novel prognostic and metastasis-predictive biomarker in patients with colorectal cancer［J］.Ann Surg，2014，259(4) : 735-743.

［4］Xu S，Xu P，Wu W，et al.The biphasic expression pattern of miR-200a and E-cadherin in epithelial ovarian cancer and its correlation with clinicopathological features［J］.Curr Pharm Des，2014，20(11) : 1888-1895.

［5］周余，孟恒星，于珍，等.CD133在急性白血病中的表達(dá)及其意義［J］.中華血液學(xué)雜志，2004，25(7) : 401-404

［6］Han Z，Chen Z，Zheng R，et al.Clinicopathological significance of CD133and CD44 expression in infiltrating ductal carcinoma and their relationship to angiogenesis［J］.World J Surg Oncol，2015，13(1) : 486.

［7］趙文健，楊亮，何漢江.miR-200b通過靶向CD133抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞和膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的生長［J］.腫瘤，2014，34(3) : 231-237.

［8］Ling H，Zhang W，Calin GA.Principles of microRNA involvement in human cancers［J］.Chin J Cancer，2011，30(11) : 739-748.

［9］Gao H，Zhao H，Xiang W.Expression level of human miR-34a correlates with glioma grade and prognosis［J］.J Neurooncol，2013，113(2) : 221-228.

［10］He J，Deng Y，Yang G，et al.MicroRNA-203 down-regulation is associated with unfavorable prognosis in human glioma［J］.J Surg Oncol，2013，108(2) : 121-125.

［11］李榮國，王劍，楊少陵.miR-22通過靶向MTDH抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長［J］.中國癌癥雜志，2014，24(6) : 401-405.

［12］Li G，Zhang Z，Tu Y，et al.Correlation of microRNA-372 upregulation with poor prognosis in human glioma［J］.Diagn Pathol，2013，(8) : 1.

［13］Lu S，Wang S，Geng S，et al.Increased expression of microRNA-17 predicts poor prognosis in human glioma［J］.J Biomed Biotechnol，2012，(2012) : 970761.

［14］Zhang C，Zhang J，Hao J，et al.High level of miR-221/222 confers increased cell invasion and poor prognosis in glioma［J］.J Transl Med，2012，(10) : 119.

［15］Srinivasan S，Patric IRP，Somasundaram K.A ten-microRNA expression signature predicts survival in glioblastoma［J］.PloS One，2011，6(3) : e17438.

［16］Park SM，Gaur AB，Lengyel E，et al.The miR-200 family determines the epithelial phenotype of cancer cells by targeting the E-cadherin repressors ZEB1 and ZEB2［J］.Genes Dev，2008，22 (7) : 894-907.

［17］Gregory PA，Bert AG，Paterson EL，et al.The miR-200 family and miR-205 regulate epithelial to mesenchymal transition by targeting ZEB1 and SIP1［J］.Nat Cell Biol，2008，10(5) : 593-601.

［18］Peng B，Hu S，Jun Q，et al.MicroRNA-200b targets CREB1 and suppresses cell growth in human malignant glioma［J］.Mol Cell Biochem，2013，379(1-2) : 51-58.

［19］Cao Q，Lu K，Dai S，et al.Clinicopathological and prognostic implications of the miR-200 family in patients with epithelialovarian cancer［J］.Int J Clin Exp Pathol，2014，7(5) : 2392-2401.

［20］Horst D，Kriegl L，Engel J，et al.CD133expression is an independent prognostic marker for low survival in colorectal cancer［J］.Br J Cancer，2008，99(8) : 1285-1289.

［21］Wu S，Yu L，Wang D，et al.Aberrant expression of CD133in nonsmall cell lung cancer and its relationship to vasculogenic mimicry ［J］.BMC Cancer，2012，(12) : 535.

(收稿日期:2015-01-29)

通信作者:洪銘范

基金項(xiàng)目:廣東省醫(yī)學(xué)科研基金立項(xiàng)課題(A2013321) ;省企業(yè)技術(shù)研發(fā)與升級(jí)改造專項(xiàng)基金項(xiàng)目(B2013B0218011251)。

文章編號(hào):1002-266X(2015)19-0053-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:B

中圖分類號(hào):R739.41

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.19.019