1-磷酸鞘氨醇對人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的影響及機制

苑永輝，戚勛，楊芳(遼寧省腫瘤醫(yī)院，沈陽0004;中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院;山東省地方病防治研究所)

1-磷酸鞘氨醇對人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的影響及機制

苑永輝1，戚勛2，楊芳3
(1遼寧省腫瘤醫(yī)院，沈陽110004;2中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院;3山東省地方病防治研究所)

摘要:目的觀察1-磷酸鞘氨醇(S1P)對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)增殖和遷移的影響，探討其作用機制。方法將HUVEC分為A～F組，A組只加細(xì)胞培養(yǎng)液，B～F組分別加入10－10、10－9、10－8、10－7、10－6mol/L的S1P;采用CCK-8法檢測各組培養(yǎng)48 h的OD450值，Transwell實驗計數(shù)各組穿膜細(xì)胞數(shù)。將HUVEC分為3組，空白對照組加細(xì)胞培養(yǎng)液，低濃度組和高濃度組分別加10－7、10－6mol/L的S1P;采用Western blot法檢測ERK、p-ERK蛋白，計算二者比值。結(jié)果A～F組OD450值分別為0.50±0.03、0.51±0.06、0.65±0.04、0.82±0.19、0.99± 0.06、0.99±0.02，穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(66.59±9.11)、(76.72±4.80)、(83.75±7.59)、(101.39±5.03)、(101.50 ±8.96)、(99.38±13.03)個/HP。D、E、F組與A組比較，P均＜0.05; B、C組與A組比較，P均＞0.05;d、E、F組間比較，P均＞0.05?？瞻讓φ战M、低濃度組和高濃度組p-ERK蛋白與ERK蛋白比值分別為0.39±0.03、0.94± 0.07、0.97±0.05，低濃度組和高濃度組與空白對照組比較，P均＜0.01。結(jié)論S1P可通過MAPK/ERK通路促進HUVEC的增殖和遷移。

關(guān)鍵詞:1-磷酸鞘氨醇;內(nèi)皮細(xì)胞;細(xì)胞增殖;細(xì)胞遷移;mAPK/ERK通路

Effect of sphingosine-1-phosphate onmigration and proliferation of HUVECs and itsmechanism

YUAN Yong-hui1，QI Xun，YANG Fang
(1 Liaoning Cancer Hospital＆Institute，Shenyang 110004，China)

Abstract:Objective To observe the effect of sphingosine-1-phosphate(S1P)onmigration and proliferation of human umbilicus vein endothelial cells(HUVECs)and to investigate itsmechanism.Methods HUVECs weredivided into，group A to group F，group A was only added with cell culturemedium，group B to group F were added withdifferentconcentrations of S1P(10－10，10－9，10－8，10－7and 10－6mol/L，respectively).CCK-8method was used todetect the OD450value 48 h after treatment，Transwell cellmigration assay was employed to investigate the number ofmigrated cells.HUVECs weredivided into three groups: the blank control group which was only added with cell culturemedium，low-dose group and high-dose group were added with 10－7and 10－6mol/L S1P; the protein expression levels of phospho-ERK and ERK weredetected by Western blotting，then the ratio of pERK to ERK was calculated.Results The OD450values of group A to group F were 0.50±0.03，0.51±0.06，0.65±0.04，0.82±0.19，0.99±0.06 and 0.99±0.02，and the numbers ofmigrated cells were(66.59±9.11)，(76.72±4.80)，(83.75±7.59)，(101.39±5.03)，(101.50± 8.96)and(99.38±13.03)/ HP.Significantdifference was found between group A and groupsd，E，F(xiàn)(allP＜0.05); nodifference was found between group A and groups B，C(all P＞0.05)，and nodifference was found between groupsd，E and F(all P＞0.05).The ratios of pERK to ERK in the blank control group，low-dose and high-dose groups were 0.39±0.03，0.94±0.07 and 0.97±0.05，and significantdifference was found between the blank control group and low-dose group，high-dose group(all P＜0.01).ConclusionS1P can promote themigration and proliferation ofHUVECs throughmAPK/ERK signaling pathway.

Key words:sphingosine-1-phosphate; endothelial cells; cell proliferation; cellmigration;mAPK/ERK signaling pathway

治療性血管新生是下肢缺血性疾病、缺血性心臟病等局部缺血性疾病的重要治療方法［1，2］，是將外源性血管新生誘導(dǎo)因子轉(zhuǎn)入組織中，增強缺血區(qū)的側(cè)支毛細(xì)血管新生，從而加速側(cè)支循環(huán)的形成［3］。這一過程與血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)遷移和增殖密切相關(guān)［4］。1-磷酸鞘氨醇(S1P)是一種具有重要生物學(xué)活性的溶血磷脂，可作用于5種G蛋白偶聯(lián)S1P受體(S1P1、S1P2、S1P3、S1P4和S1P5)［5］。目前尚未見S1P對VEC增殖和遷移作用的相關(guān)報道。2015年3～6月，我們檢測了S1P對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)增殖和遷移的影響，并探討MAPK/ERK在其中發(fā)揮的作用?，F(xiàn)報告如下。

1　材料與方法

1.1主要試劑S1P購自Enzo Life Sciences公司，HUVEC細(xì)胞株購于凱基生物;牛血清白蛋白(BSA)、PBS及RPMI1640培養(yǎng)基均購自Sigma-Aldrich公司，胎牛血清、青—鏈霉素和胰蛋白酶購自于Life Technology公司，結(jié)晶紫購自于國藥試劑;細(xì)胞增殖—毒性檢測試劑盒購自Dojindo公司，Transwell小室購自于Millipore公司，ERK多克隆抗體及phoshpo-ERK單克隆抗體購自于Cell Signaling Technology公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)將HUVEC解凍復(fù)蘇后加入含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至80%～90%狀態(tài)進行實驗。1.3HUVEC增殖能力觀察采用CCK-8法。HUVEC細(xì)胞經(jīng)PBS清洗、胰蛋白酶消化后制成細(xì)胞懸液，按2×103/孔接種于96孔板。正常培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)液，換含有0.5% BSA的培養(yǎng)液預(yù)處理24 h，以達(dá)到細(xì)胞同步化。將細(xì)胞分為A～F組6組，A組只加細(xì)胞培養(yǎng)液，B～F組分別加入10－10、10－9、10－8、10－7、10－6mol/L的S1P 100 μL/孔;每組設(shè)5個復(fù)孔，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)48 h;每孔加入CCK-8溶液10 μL，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h后，使用酶標(biāo)儀測450 nm處的OD值，OD450值越大表示細(xì)胞增殖能力越強。

1.4 HUVEC遷移能力觀察采用Transwell實驗。取對數(shù)生長期HUVEC細(xì)胞，用含0.5% BSA的RPMI1640培養(yǎng)基血清饑餓24 h;經(jīng)PBS清洗、胰蛋白酶消化制成含0.25% BSA的RPMI1640細(xì)胞懸液(5×105/mL)，上室加細(xì)胞200 μL。將細(xì)胞分為A～F組6組，A組下室只加細(xì)胞培養(yǎng)液500 μL，B～F組分別加入10－10、10－9、10－8、10－7、10－6mol/L 的S1P 500 μL，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4.5 h;取出Transwell小室，用棉簽拭去上室面的殘余細(xì)胞，甲醛固定，結(jié)晶紫染色;風(fēng)干后于顯微鏡下觀察細(xì)胞，取上、下、左、右、中間5個視野計數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。實驗重復(fù)4次，取平均值。

1.5 HUVEC中p-ERK及ERK蛋白表達(dá)檢測采用Western blot法。取對數(shù)生長期HUVEC，按3× 105/孔接種于6孔板，待90%融合后分為3組。空白對照組加細(xì)胞培養(yǎng)液2.5mL，低濃度組和高濃度組分別加10－7、10－6mol/L的S1P 2.5mL; 4 h后加入100 μL裂解液中冰上裂解5min，收集蛋白于離心管后超聲破碎，繼續(xù)4℃冰上裂解40min。4℃離心15min，取上清液;用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，蛋白樣本99℃高溫水浴變性。取50 μg蛋白樣品，用10%的SDS-PAGE分離蛋白，通過電泳將蛋白印跡轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉。加入ERK多克隆抗體及p-ERK單克隆抗體，4℃孵育過夜，BCIP/NBT顯色。計算p-ERK與ERK蛋白比值。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法采用GraphPad Prism6.0統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)以珋x±s表示，比較采用單向方差分析。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1 S1P對HUVEC增殖能力的影響A～F組OD450值分別為0.50±0.03、0.51±0.06、0.65± 0.04、0.82±0.19、0.99±0.06、0.99±0.02。D、E、F組與A組比較，P均＜0.05; B、C組與A組比較，P均＞0.05;d、E、F組間比較，P均＞0.05。

2.2 S1P對HUVEC遷移能力的影響A～F組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(66.59±9.11)、(76.72±4.80)、(83.75±7.59)、(101.39±5.03)、(101.50± 8.96)、(99.38±13.03)個/HP。D、E、F組與A組比較，P均＜0.05; B、C組與A組比較，P均＞0.05;d、E、F組間比較，P均＞0.05。

2.3 S1P對HUVEC中p-ERK與ERK蛋白表達(dá)的影響空白對照組、低濃度組和高濃度組p-ERK蛋白與ERK蛋白比值分別為0.39±0.03、0.94± 0.07、0.97±0.05，低濃度組和高濃度組與空白對照組比較，P均＜0.01。

3　討論

在生理條件下，完整的單層VEC系統(tǒng)是血管壁發(fā)揮正常功能的必要條件。而在許多血管病變的病理過程中，包括動脈粥樣硬化和血管再狹窄等，由于血管損傷導(dǎo)致內(nèi)皮功能的喪失和失去完整性。因此，促進和恢復(fù)VEC完整性的研究極為重要。血管新生是指從已有的毛細(xì)血管或毛細(xì)血管后靜脈發(fā)展

而形成新的血管，主要包括血管基底膜降解，VEC的激活、增殖、遷移，重建形成新的血管和血管網(wǎng)三大步驟，是一個涉及多種細(xì)胞和多種分子的復(fù)雜過程［6］。血管新生在生長或發(fā)育上扮演重要角色，例如傷口愈合、女性經(jīng)期、胎兒生長發(fā)育。在血管新生過程中，首要步驟是VEC在趨化因子的作用下發(fā)生遷移、增殖［7，8］。要達(dá)到治療性血管新生的目的，血管新生誘導(dǎo)因子必須作用于微血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性受體，引起微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，形成毛細(xì)血管樣管腔結(jié)構(gòu)，然后經(jīng)過血管的重構(gòu)形成新的毛細(xì)血管網(wǎng)［9，10］。

S1P是一種具有重要生物學(xué)活性的溶血磷脂，主要來源于細(xì)胞膜鞘磷脂的分解代謝。有研究表明，S1P1受體和S1P3受體通過G蛋白偶聯(lián)受體Gi來上調(diào)Rac引起細(xì)胞的趨化作用，S1P2受體通過G蛋白偶聯(lián)受體G12/13來激活Rho，從而下調(diào)Rac，進而抑制細(xì)胞的趨化作用［11，12］。內(nèi)皮細(xì)胞大量表達(dá)S1P1和S1P3受體，而平滑肌細(xì)胞大量表達(dá)S1P2 和S1P3受體。因此，內(nèi)皮細(xì)胞主要是通過G蛋白偶聯(lián)受體Gi來上調(diào)Rac引起細(xì)胞的趨化作用［13］，G蛋白偶聯(lián)受體可以激活MAPK/ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［14］。MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路存在于大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)，在將細(xì)胞外刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞及其核內(nèi)，并引起細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)(如細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡等)的過程中具有至關(guān)重要的作用。MAPK/ERK是參與血管新生的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［15］，但目前尚未見S1P對VEC增殖和遷移的作用及與MAPK/ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)機制的研究報道。本實驗Western blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與A組相比，D、E、F組p-ERK/ERK上調(diào)，提示S1P可能在ERK信號通路的激活過程中發(fā)揮作用，促進VEC血管生成，從而增加局部組織的血流灌注量，有效改善微循環(huán)功能障礙。

本研究顯示，S1P能通過上調(diào)p-ERK，促進VEC增殖和遷移，由此推測S1P在缺血性疾病血管新生的發(fā)生和發(fā)展中具有一定作用，有利于缺血部位側(cè)支循環(huán)的形成，為治療性血管新生奠定理論基礎(chǔ)。

參考文獻:

［1］LosordodW，Dimmeler S.Therapeutic angiogenesis and vasculogenesis for ischemicdisease.Part I: angiogenic cytokines［J］.Circulation，2004，109(21): 2487-2491.

［2］LosordodW，Dimmeler S.Therapeutic angiogenesis and vasculogenesis for ischemicdisease: part II: cell-based therapies［J］.Circulation，2004，109(22): 2692-2697.

［3］Simonsm，Ware JA.Therapeutic angiogenesis in cardiovasculardisease［J］.Nat Revdrugdiscov，2003，2(11): 863-871.

［4］TonnesenmG，F(xiàn)eng X，Clark RA.Angiogenesis in wound healing ［J］.J Investigdermatol Symp Proc，2000，5(1): 40-46.

［5］Takuwa Y，Okamoto Y，Yoshioka K，et al.Sphingosine-1-phosphate signaling in physiology anddiseases［J］.Biofactors，2012，38(5): 329-337.

［6］Battegay EJ.Angiogenesis:mechanistic insights，neovasculardiseases，and therapeutic prospects［J］.Jmolmed(Berl)，1995，73(7): 333-346.

［7］Marcelo KL，Goldie LC，Hirschi KK.Regulation of endothelial celldifferentiation and specification［J］.Circ Res，2013，112(9): 1272-1287.

［8］戴國華，馬培澤，宋憲波，等.缺氧對大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞血管新生能力的影響［J］.山東醫(yī)藥，2014，54(18): 10-13.

［9］DeCicco-Skinner KL，Henry GH，Cataisson C，et al.Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis［J］.J Vis Exp，2014，1(91): 51312.

［10］Korn C，Augustin HG.Mechanisms of Vessel Pruning and Regression［J］.Dev Cell，2015，34(1): 5-17.

［11］Takuwa Y，Okamoto Y，Yoshioka K，et al.Sphingosine-1-phosphate signaling and biological activities in the cardiovascular system ［J］.Biochim Biophys Acta，2008，1781(9): 483-488.

［12］Arikawa K，Takuwa N，Yamaguchi H，et al.Ligand-dependent inhibition of B16melanoma cellmigration and invasion via endogenous S1P2 G protein-coupled receptor.Requirement of inhibition of cellular RAC activity［J］.J Biol Chem，2003，278(35): 32841-32851.

［13］李方方，李文慶，荊清.G蛋白偶聯(lián)受體在血管發(fā)育中的作用［J］.遺傳，2013，35(4): 459-467.

［14］Okamoto Y，Yoshioka K，Takuwa N，et al.Cardiovascular function of sphingosine 1-phosphate signaling［J］.Seikagaku，2011，83(6): 536-544.

［15］Thomas CJ，Lim NR，Kedikaetswe A，et al.Evidence that themEK/ERK but not the PI3K/Akt pathway is required for protection frommyocardial ischemia-reperfusion injury by 3'，4'-dihydroxyflavonol［J］.Eur J Pharmacol，2015(758): 53-59.

收稿日期:( 2015-07-24)

作者簡介:第一苑永輝(1978-)，男，主管檢驗技師，博士學(xué)位，博士后在讀。研究方向為感染癥制御學(xué)與分子生物學(xué)。E-mail: yyxhdh@126.com

基金項目:遼寧省博士科研啟動基金計劃資助項目(20141183);遼寧省教育廳一般項目(L2012282)。

文章編號:1002-266X(2015)34-0011-03

文獻標(biāo)志碼:A

中圖分類號:R331

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.34.004