膽囊收縮素-8對大鼠急性腦損傷后核因子-κB活性的影響

邵恩得 張靜軒 田世文 張萬興 王恒 扈玉華

核因子-κB(NF-κB)是炎性反應(yīng)調(diào)節(jié)過程中的重要轉(zhuǎn)錄因子，其活化后可激起TNF-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和 IL-1(interleukin-1，IL-1)等一些促炎性因子的大量表達(dá)，從而促進(jìn)了一系列的炎性反應(yīng)的發(fā)生。在顱腦創(chuàng)傷的過程中炎性因子的過度表達(dá)加重了神經(jīng)元細(xì)胞的損害［1］。CCK是一種存在于胃腸道及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的腦腸肽，CCK-8在炎性反應(yīng)過程有明顯抑制作用。本研究通過觀察大鼠顱腦外傷后NF-κB的表達(dá)以及 CCK-8對其表達(dá)的影響，探討CCK-8的腦保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與動物分組 NF-κB凝膠遷移檢測分析(EMSA)試劑盒購于美國 Promega公司，γ32P-ATP購于北京亞輝生物公司。取成年雄性Wistar大鼠60只(動物合格證號:703017)，體重280～300 g，由河北醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，隨機(jī)分為對照組(n=12)、創(chuàng)傷組(n=24)、CCK-8 組(n=24)，創(chuàng)傷組及CCK-8組又平均分為術(shù)后12 h、24 h及72 h。

1.2 動物模型制作 采用液壓打擊致傷法制作大鼠腦外傷模型。CCK-8組于實驗前40 min，經(jīng)大鼠尾靜脈注射 CCK-8，40 μg/kg，每只 0.2 ml;創(chuàng)傷組在致傷前30 min注射等量0.9%氯化鈉溶液;對組大鼠只行顱骨開窗，不做液壓打擊。各組實驗動物根據(jù)不同時間點處死，取腦組織挫傷灶前緣2～3 mm處腦皮質(zhì)標(biāo)本，分別行采用免疫組化及電泳遷移率改變分析的方法，觀察NF-κB核內(nèi)外的活性情況，并檢測挫傷周圍腦水腫情況。

1.3 腦組織 NF-κB活性測定 腦組織核蛋白10 μg，γ32P 標(biāo)記的 DNA 探針 2 μl，加入緩沖液至 10 μl，在室溫下進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)30 min，電泳電壓為100 V，時間為2 h，將明膠放入-70℃冰箱中顯影，應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行光密度分析。

1.4 腦組織含水量測定 取創(chuàng)傷傷緣3 mm處腦皮質(zhì)，大小約100 mm3，電子天平稱濕重，置真空恒溫干燥箱，將溫度設(shè)置100℃烘烤24 h，稱干重，根據(jù)腦組織含水量=(濕重-干重)/濕重×100%，計算腦組織含水量。

1.5 NF-κB的表達(dá) 取創(chuàng)傷灶邊緣4 mm×4 mm×4 mm的腦組織固定、包埋制作蠟塊。免疫組化使用ABC-ELISA方法，DAB鏡下顯色，顯微鏡下細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性結(jié)果。每只大鼠隨機(jī)抽取4張切片，在高倍鏡下隨機(jī)取5個視野，計錄陽性細(xì)胞，取平均陽性細(xì)胞數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦組織NF-κB活性 對照組各時間點NF-κB的活性無明顯變化(P＞0.05)，創(chuàng)傷組大鼠在腦損傷后12 h NF-κB活性開始增高，傷后24 h達(dá)高峰，與對照組相比各時間點NF-κB的活性均明顯增加(P＜0.05)。CCK-8組與創(chuàng)傷組比較各時間點NF-κB的活性顯著下降(P＜0.05)。說明CCK-8對細(xì)胞核內(nèi)NF-κB的DNA結(jié)合活性有明顯抑制作用。見表1，圖1。

表1 腦組織NF-κB活性比較 ±s

表1 腦組織NF-κB活性比較 ±s

注:與對照組比較，*P ＜0.05;與創(chuàng)傷組比較，#P ＜0.05

組別 傷后12 h 傷后24 h 傷后72 h對照組(n=12)19.81±5.02 17.16±4.21 18.54±4.01創(chuàng)傷組(n=24) 97.56±4.65* 143.54±8.41* 106.66±7.54*CCK-8組(n=24) 68.76±5.54*# 83.43±5.01*# 71.42±4.43*#

圖1 NF-κB的DNA結(jié)合活性

2.2 腦組織含水量 創(chuàng)傷后各時間點，創(chuàng)傷組大鼠腦組織含水量均高于對照組(P＜0.05)，24 h達(dá)高峰，72 h仍持續(xù)較高水平，CCK-8組大鼠腦含水量與對照組相比各時間點有所增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，但CCK-8組大鼠腦含水量與創(chuàng)傷組相比各時間點明顯降低(P＜0.05)。見表2。

表2 腦含水量比較%，±s

表2 腦含水量比較%，±s

注:與對照組比較，*P ＜0.05;與創(chuàng)傷組比較，#P ＜0.05

組別 傷后12 h 傷后24 h 傷后72 h對照組(n=12)16.48±2.68 18.02±2.60 16.87±3.01創(chuàng)傷組(n=24) 71.23±5.36* 90.65±5.44* 82.00±2.43*CCK-8組(n=24) 44.76±5.40*# 70.35±4.56*# 66.43±4.09*#

2.3 免疫組織化學(xué) 對照組大鼠腦組織神經(jīng)元細(xì)胞NF-κB無陽性表達(dá)。創(chuàng)傷組大鼠各時間點均有陽性表達(dá)，在損傷24 h達(dá)到高峰，之后略有所下降，顯微鏡下觀察NF-κB主要在神經(jīng)元細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，為棕黃色小顆粒，如表3所示。CCK-8組與創(chuàng)傷組比較各時間點NF-κB的表達(dá)均顯著減少(P＜0.05)。見表3，圖2。

表3 NF-κB陽性表達(dá)個，±s

表3 NF-κB陽性表達(dá)個，±s

注:與對照組比較，*P ＜0.05;與創(chuàng)傷組比較，#P ＜0.05

組別 傷后12 h 傷后24 h 傷后72 h對照組(n=12)2.34±0.79 2.25±0.21 2.04±0.40創(chuàng)傷組(n=24) 28.59±3.06* 38.00±1.76* 29.44±4.12*CCK-8組(n=24) 6.31±1.61*# 7.34±3.00*# 5.22±1.07*#

圖2 NF-κB的免疫組化染色

3 討論

NF-κB是一種多效性的轉(zhuǎn)錄因子，它與多種啟動因子的κB序列結(jié)合從促進(jìn)其表達(dá)，與炎性反應(yīng)、免疫應(yīng)答及細(xì)胞的增生、轉(zhuǎn)化和凋亡等一系列的病理生理過程密切關(guān)聯(lián)［2］。NF-κB的激活對細(xì)胞因子及趨化因子組織的免疫應(yīng)答尤為重要，腦組織損傷后細(xì)胞內(nèi)TNF-α、IL-1、IL-6等因子的表達(dá)急劇增加，而這些因子的激活均依賴于NF-κB的活化［3］。在炎性反應(yīng)啟動后，生成的TNF-α、IL-1同時又是 NF-κB 的激活物，從而使炎性反應(yīng)成瀑布式級聯(lián)放大，所以NF-κB激活在指導(dǎo)炎性起始過程中發(fā)揮了重要作用，在顱腦創(chuàng)傷過程中，NF-κB的過度表達(dá)通過啟動炎性反應(yīng)加重了二次損傷［4］。

本研究發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷組大鼠在顱腦創(chuàng)傷后12 h NF-κB陽性細(xì)胞明顯增加，24 h達(dá)高峰，一直持續(xù)到72 h，陽性細(xì)胞主要為膠質(zhì)細(xì)胞，對照組腦組織無陽性細(xì)胞表達(dá)。創(chuàng)傷組大鼠在傷后12 h腦水腫開始出現(xiàn)，24 h達(dá)最高峰，72 h水腫仍較明顯。NF-κB的活性檢測顯示其表達(dá)規(guī)律與免疫組化研究結(jié)果及腦水腫的發(fā)生在時間上具有明顯的一致性，波峰重合，這一現(xiàn)象說明，NF-κB的表達(dá)啟動了級聯(lián)擴(kuò)大的炎性反應(yīng)，在顱腦的創(chuàng)傷的繼發(fā)性損傷過程中起到了至關(guān)重要的作用。

膽囊收縮素是一種氨基酸多肽，它既具有一般胃腸激素的作用，還可以神經(jīng)遞質(zhì)的形式在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮作用。叢斌等［5］在實驗中發(fā)現(xiàn)CCK-8有抑制NF-κB的活性的作用。扈玉華等［6］首次將 CCK-8應(yīng)用于脊髓損傷實驗大鼠后發(fā)現(xiàn)NF-κB的表達(dá)明顯受到抑制，有效的減輕了脊髓損傷后的二次損傷，給CCK-8應(yīng)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的保護(hù)作用提供了有力的理論依據(jù)。本實驗發(fā)現(xiàn)，CCK-8組大鼠NF-κB活性較創(chuàng)傷組顯著減少(P＜0.05)，這一結(jié)果與各時間點NF-κB的表達(dá)及腦水腫結(jié)果相一致。由此我們可以得出CCK-8可通抑制NF-κB活化，從而阻止了炎性反應(yīng)的起始環(huán)節(jié)，極大減輕了受損神經(jīng)組織的繼發(fā)性損傷。

CCK-8通過抑制NF-κB活化在顱腦外傷中的腦保護(hù)機(jī)制還在進(jìn)一步的研究中，其主要作用機(jī)制是阻斷NF-κB的上游激活系統(tǒng)，如抗氧化作用及抑制IκB的降解，氧化應(yīng)激作用是使NF-κB激活的一個重要途徑，目前已知CCK-8可促進(jìn)超氧化物酶歧化酶的活性，從而加強(qiáng)抗氧化作用［7］，這樣就一定程度上間接的抑制了NF-κB的激活。NF-κB分子之所以能穩(wěn)定的存在于胞漿中是因為有NF-κB抑制劑IκB的存在，這樣NF-κB就不能進(jìn)入胞核而穩(wěn)定的在胞質(zhì)中存在，而CCK-8可以通過 p38 MAPK、cAMP-PKA及 DAGPKC信號通路抑制IκB蛋白降解，從而加強(qiáng)了對NF-κB 激活的抑制作用［8-10］。

此外，CCK-8還可從通過抑制TNF-a的表達(dá)，從而減弱其與NF-κB形成的正反饋激活系統(tǒng)，通過在中間環(huán)節(jié)的抑制作用而減輕繼發(fā)炎性反應(yīng)，破壞級聯(lián)式的炎性反應(yīng)系統(tǒng)［11］。

1 Jung KJ，Go Ek，Kim JY，et al.Suppression of age-related renal changes in NF-κB and its target gene expression by dietary ferulate.J Nutr Biochem，2009，20:378-388.

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5 叢斌，凌亦凌，谷振勇，等.八肽膽囊收縮素對脂多糖誘導(dǎo)大鼠肺組織NF-κB活性增高的抑制作用.中國病理生理雜志，2002，18:615-618.

6 扈玉華，張慶俊，叢斌，等.膽囊收縮素-8對大鼠急性脊髓損傷核因子-κB活性的影響.中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志，2001，23:345-347.

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8 Jung KJ，Go Ek，Kim JY，et al.Suppression of age-related renal changes in NF-κB and its target gene expression by dietary ferulate.J Nutr Biochem，2009，20:378-388.

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