胰腺癌中COX-2、Her-2/neu的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系

蘇春永 楊曉光

胰腺癌是一種惡性度極高的惡性腫瘤，一經(jīng)確診僅有20%左右的患者可行根治性切除術(shù)，術(shù)后5年生存率不到25%［1］。胰腺癌的發(fā)生、增殖、侵襲以及轉(zhuǎn)移等各種生物學(xué)行為涉及到多種癌基因的激活和腫瘤抑制基因的失活。原癌基因表皮生長(zhǎng)因子(v-erb-b2 erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2，Her-2/neu)是一種具有酪氨酸蛋白激酶活性的跨膜糖蛋白，通過(guò)激活酪氨酸激酶信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)在腫瘤細(xì)胞間的信號(hào)傳遞中起重要作用［2］。環(huán)氧合酶2(cyclooxygease-2，COX-2)是介導(dǎo)前列腺素合成、細(xì)胞有絲分裂、細(xì)胞粘附等多種生理和病理功能的多效酶［3］。研究顯示，Her-2/neu、COX-2在正常組織極少表達(dá)，而在食管癌、子宮內(nèi)膜癌、膀胱癌等惡性腫瘤組織高表達(dá)，通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞增殖及新生血管形成、抑制細(xì)胞凋亡、幫助腫瘤細(xì)胞免疫逃逸等過(guò)程參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展［4-6］。但關(guān)于Her-2/neu、COX-2在胰腺癌中相互作用的機(jī)制及與預(yù)后的關(guān)系筆者所見(jiàn)國(guó)內(nèi)外研究較少。本研究應(yīng)用免疫組化法及實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)胰腺癌組織中COX-2及Her-2/neu的表達(dá)及與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系，探討其與胰腺癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2009年9月至2011年3月經(jīng)我院手術(shù)切除的原發(fā)性胰腺導(dǎo)管腺癌組織標(biāo)本50例，均經(jīng)病理確診，臨床病理資料及隨訪資料完整。其中男30例，女20例;年齡 ＜50歲6例，≥50歲44例。參照1987年國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)制定的胰腺癌病理分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ級(jí)12例，Ⅱ級(jí)18例，Ⅲ級(jí)20例。50例中低增殖活性13例，高增殖活性37例;有局部淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者31例，無(wú)轉(zhuǎn)移者19例;生存期＞1年者15例，＜1年者35例。同時(shí)選取癌旁組織36例，其中男23例，女13例;年齡＜50歲3例，≥50歲33例。

1.2 試劑 兔抗人COX-2多克隆抗體、鼠抗人Her-2/neu單克隆抗體(美國(guó)Santa cruz公司);免疫組化試劑盒(北京中杉金橋技術(shù)有限公司);Trizol、Real Time-PCR試劑盒(美國(guó)Promega公司)。

1.3 COX-2和Her-2/neu蛋白的表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化法檢測(cè)胰腺組織COX-2、Her-2/neu蛋白表達(dá)水平，參照說(shuō)明書(shū)操作。將手術(shù)切除的癌組織及癌旁正常組織置于4%多聚甲醛中固定，依次進(jìn)行脫蠟、水化、高壓鍋熱修復(fù)后加入特異性一抗(稀釋比例:COX-2:1∶200;Her-2/neu:1∶150)4℃過(guò)夜;加入生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h;加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的三抗室溫孵育45 min，DAB顯色，蘇木精染色。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn):COX-2和Her-2/neu陽(yáng)性染色的判定以細(xì)胞膜(質(zhì))中檢出棕黃色或深棕色顆粒為標(biāo)準(zhǔn)。隨機(jī)選取5個(gè)有代表性的視野進(jìn)行觀察并計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，若陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占同類細(xì)胞數(shù)的比例≥5%為陽(yáng)性，＜5%則為陰性。

1.4 COX-2和Her-2/neu mRNA表達(dá)的檢測(cè) 采用Real Time-PCR(qPCR)方法檢測(cè)胰腺組織COX-2、Her-2/neu mRNA表達(dá)水平，參照說(shuō)明書(shū)操作。Gene Bank網(wǎng)站獲取COX-2和Her-2/neu基因序列，使用Primer Premier5.0設(shè)計(jì)引物，有上海生工生物工程有限公司合成。Trizol提取組織總RNA，將2.0 μg總RNA用于后續(xù)的 Real Time-PCR反應(yīng)。PCR擴(kuò)增完畢后，以GAPDH為內(nèi)參照基因，目的基因Her-2/neu表達(dá)的相對(duì)定量值(RQ值)用于統(tǒng)計(jì)分析。見(jiàn)表1。

1.5 腫瘤MVD值計(jì)數(shù) 采用CD105標(biāo)記的MVD(CD105-MVD)法計(jì)數(shù)腫瘤MVD值:100倍光鏡下觀察整個(gè)切片，選取3個(gè)最有代表性的組織切片，排除存在出血和邊緣反應(yīng)區(qū)的切片。低倍鏡下選出每張切片中3個(gè)血管密度最高區(qū)(熱區(qū))，400倍光鏡下計(jì)數(shù)熱區(qū)中被抗CD105抗體染成棕色的單個(gè)或成簇微血管數(shù)，取3個(gè)視野的平均值即為該例切片的MVD值。

表1 COX-2、Her-2/neu內(nèi)參基因GAPDH的PCR引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 COX-2、Her-2/neu蛋白在胰腺癌及癌旁組織的表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示，COX-2、Her-2/neu蛋白主要定位于胰腺癌細(xì)胞膜(質(zhì))中，呈棕黃色或深棕色顆粒。COX-2蛋白在胰腺癌和癌旁組織的陽(yáng)性表達(dá)率分別為72.0%(36/50)、8.3%(3/36)，Her-2/neu 蛋白在胰腺癌和癌旁組織的陽(yáng)性表達(dá)率分別為46.0%(23/50)、11.1%(4/36)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

表2 COX-2及Her-2/neu在胰腺癌及對(duì)照組織中蛋白表達(dá)例(%)

2.2 COX-2、Her-2/neu mRNA在胰腺癌及癌旁組織的表達(dá) RT-QPCR結(jié)果顯示，COX-2 mRNA在胰腺癌和癌旁組織的表達(dá)水平分別為(3.51±0.91)、(0.93±0.25)，Her-2/neu mRNA在胰腺癌及癌旁組織的表達(dá)水平分別為(4.24±0.78)、(1.03±0.16)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說(shuō)明COX-2、Her-2/neu mRNA在胰腺癌組織的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織。見(jiàn)表3。

表3 COX-2和Her-2/neu在胰腺癌及對(duì)照組織中的mRNA表達(dá)±s

表3 COX-2和Her-2/neu在胰腺癌及對(duì)照組織中的mRNA表達(dá)±s

注:與癌旁組織比較，*P＜0.05

類別COX-2 Her-2/neu胰腺癌(n=50) 3.51±0.91* 4.24±0.78*癌旁組織(n=36)0.93±0.25 1.03±0.16

2.3 COX-2、Her-2/neu蛋白表達(dá)與胰腺癌臨床病理特征的關(guān)系 免疫組化結(jié)果顯示，COX-2在低增殖活性組和高增殖活性組的陽(yáng)性表達(dá)率分別為38.46%、83.78%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);COX-2在TNM分期Ⅰ～Ⅱ期組和Ⅲ～Ⅳ組的陽(yáng)性表達(dá)率分別為45.00%、90.00%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);COX-2在有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組和無(wú)轉(zhuǎn)移組的陽(yáng)性表達(dá)率分別為90.32%、42.11%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Her-2/neu在低分化組、中分化組和高分化組的陽(yáng)性表達(dá)率分別為25.00%、38.89%、65.00%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);COX-2在TNM分期Ⅰ～Ⅱ期組和Ⅲ～Ⅳ組的陽(yáng)性表達(dá)率分別為30.0%、56.67%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);COX-2在有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組和無(wú)轉(zhuǎn)移組的陽(yáng)性表達(dá)率分別為58.06%、26.32%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。COX-2、Her-2/neu蛋白表達(dá)均與胰腺癌患者的年齡、性別、腫瘤位置無(wú)關(guān)(P＞0.05)。見(jiàn)表4。

表4 胰腺癌組織中COX-2和Her-2/neu表達(dá)及臨床和生物學(xué)參數(shù)

2.4 胰腺癌組織COX-2與Her-2/neu表達(dá)的相關(guān)性

50例胰腺癌組織中，COX-2蛋白表達(dá)陽(yáng)性的有36例，Her-2/neu蛋白表達(dá)陽(yáng)性的有23例，COX-2與Her-2/neu蛋白表達(dá)均呈陽(yáng)性的有20例。Speaman相關(guān)分析顯示，COX-2與Her-2/neu表達(dá)具有正相關(guān)性(r=0.336，P＜0.05)。見(jiàn)表5。

表5 胰腺癌組織中COX-2和Her-2/neu表達(dá)的相關(guān)性 例

2.5 胰胰腺癌組織COX-2、Her-2/neu表達(dá)與MVD的相關(guān)性 COX-2陽(yáng)性表達(dá)的胰腺癌組織和COX-2陰性表達(dá)的胰腺癌組織MVD值分別為(52.62±9.36)、(36.43±5.29)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);Speaman相關(guān)分析顯示，COX-2表達(dá)與MVD具有正相關(guān)性(r=0.563，P＜0.05)。Her-2/neu陽(yáng)性表達(dá)的胰腺癌組織和Her-2/neu陰性表達(dá)的胰腺癌組織MVD值分別為(45.24±9.77)、(30.54±5.02)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);Speaman相關(guān)分析顯示，Her-2/neu表達(dá)與 MVD具有正相關(guān)性(r=0.526，P＜0.05)。見(jiàn)表6、7。

表6 COX-2表達(dá)陰性與陽(yáng)性的胰腺癌組織微血管密度分析±s

表6 COX-2表達(dá)陰性與陽(yáng)性的胰腺癌組織微血管密度分析±s

注:與COX-2+比較，*P ＜0.05

COX-2 MVD+(n=36)52.62±9.36-(n=14) 36.43±5.29*

表7 Her-2/neu表達(dá)陰性與陽(yáng)性的胰腺癌組織微血管密度分析±s

表7 Her-2/neu表達(dá)陰性與陽(yáng)性的胰腺癌組織微血管密度分析±s

注:與Her-2/neu+比較，*P ＜0.05

Her-2/neu MVD+(n=23)45.24±9.77-(n=27) 30.54±5.02*

2.6 COX-2、Her-2/neu表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 通過(guò)對(duì)50例患者術(shù)后隨訪發(fā)現(xiàn)，預(yù)后＞1年和≤1年的患者 COX-2陽(yáng)性表達(dá)率分別為40.00%(6/15)、85.71%(30/35)，平均生存時(shí)間分別為(21.12±2.11)個(gè)月、(9.24±1.35)個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。預(yù)后＞1年和≤1年的患者Her-2/neu陽(yáng)性表達(dá)率分別為33.33%(5/15)、51.43%(18/35)，平均生存時(shí)間分別為(22.17±2.46)個(gè)月、(10.32±1.76)個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。說(shuō)明COX-2、Her-2/neu表達(dá)陰性的患者平均生存時(shí)間明顯高于COX-2、Her-2/neu表達(dá)陽(yáng)性的患者。

3 討論

胰腺癌是一種惡性程度很高、診斷和治療都非常困難的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率近年來(lái)明顯上升，因胰腺位于腹膜后，位置隱匿導(dǎo)致臨床表現(xiàn)不典型及早期診斷困難而致使預(yù)后極差。近年來(lái)，影像技術(shù)的迅猛發(fā)展對(duì)篩選、鑒定惡性腫瘤具有重要診斷價(jià)值，但仍對(duì)早期胰腺癌診斷效果不佳。因此，尋找能夠早期診斷胰腺癌的新技術(shù)對(duì)于疾病治療至關(guān)重要?？紤]到該病發(fā)病的隱匿性，腫瘤生物標(biāo)記物的檢測(cè)已經(jīng)成為早期診斷胰腺癌等惡性腫瘤的新興技術(shù)，該方法具有簡(jiǎn)便快速的優(yōu)點(diǎn)［7］。然而，腫瘤生物標(biāo)記物的檢測(cè)對(duì)診斷早期胰腺癌未能取得理想效果，原因在于針對(duì)單一腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)敏感性和特異性不高，因此多種腫瘤標(biāo)志物的聯(lián)合檢測(cè)方法越來(lái)越受到人們的重視，其既可彌補(bǔ)單一指標(biāo)的局限性，又可互補(bǔ)各指標(biāo)的優(yōu)缺點(diǎn)，是提高診斷敏感性和特異性的重要方法。

癌基因的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及侵襲有密切關(guān)系，是決定腫瘤患者預(yù)后的重要指標(biāo)［8］。COX-2是花生四烯酸合成前列腺素的限速酶，其主要是通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡、抑制機(jī)體免疫功能、促進(jìn)腫瘤組織新生血管形成及增加腫瘤的侵襲能力而參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移［9］。研究證實(shí)，胰腺癌組織中COX-2的表達(dá)明顯升高，其表達(dá)與腫瘤大小、分化程度、臨床分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有相關(guān)性［10］。本研究結(jié)果顯示，COX-2在胰腺癌組織的陽(yáng)性表達(dá)率(72.0%)顯著高于癌旁正常組織(0)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)，與前人研究一致;其表達(dá)與胰腺癌的臨床分期、增殖活性、一年期生存率及腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征相關(guān)(P＜0.05)，而與年齡、性別、發(fā)病部位、病理組織分級(jí)無(wú)關(guān)，表明COX-2過(guò)表達(dá)可能和胰腺癌的發(fā)生及預(yù)后密切相關(guān)。

Her-2/neu是表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)家族的一員，為一具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白。正常情況下Her-2/neu基因處于失活狀態(tài)，僅在少數(shù)組織中低表達(dá)，當(dāng)細(xì)胞受到致癌因素刺激后，Her-2/neu的結(jié)構(gòu)或其轉(zhuǎn)錄和表達(dá)調(diào)控失常，造成細(xì)胞異常增殖及惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［11］。有研究［11］顯示，乳腺癌、肺腺癌等惡性腫瘤組織中Her-2/neu高表達(dá)，與惡性腫瘤的發(fā)病及進(jìn)展密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌組織中Her-2/neu mRNA的表達(dá)明顯高于癌旁組織(P＜0.05)，與王彩蓮等［12］研究結(jié)果一致。Her-2/neu的表達(dá)與胰腺癌的病理組織分級(jí)、臨床分期、腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移和一年期生存率關(guān)系密切(P＜0.05)，與胰腺癌患者的年齡、性別、發(fā)病部位、增殖活性無(wú)關(guān)。

研究表明COX-2、Her-2/neu信號(hào)通路之間存在交互作用。Kotha等［13］研究顯示，乳腺癌組織高表達(dá)COX-2、Her-2/neu，Her-2/neu 能夠激活 Ras-Raf-MAPK信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而上調(diào) COX-2表達(dá)水平。Wang等［14］研究顯示Her-2/neu通過(guò)與COX-2基因啟動(dòng)子結(jié)合促進(jìn)COX-2的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。本研究顯示，胰腺癌組織 COX-2、Her-2/neu表達(dá)具有正相關(guān)性(r=0.596，P＜0.05)，與以上研究結(jié)果一致。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)COX-2、Her-2/neu均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況及預(yù)后密切相關(guān)(P＜0.05)。有研究顯示，COX-2能夠上調(diào)凋亡抑制因子bcl-2、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過(guò)程［13］。因此，COX-2、Her-2/neu 可作為判斷胰腺癌預(yù)后的重要參考指標(biāo)。

本研究中我們觀察了COX-2、Her-2/neu在胰腺癌中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示二者表達(dá)具有明顯的正相關(guān)性，提示COX-2和Her-2/neu發(fā)揮協(xié)同作用，共同參與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展。此外，COX-2、Her-2/neu與胰腺癌組織分級(jí)、臨床分期、淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移狀況及預(yù)后密切相關(guān)。因此，對(duì)COX-2和Her-2/neu表達(dá)水平的聯(lián)合檢測(cè)對(duì)早期診斷胰腺癌、判斷病情進(jìn)展及預(yù)后有重要的指導(dǎo)價(jià)值，二者有可能成為胰腺癌生物治療的新靶點(diǎn)。

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