喹諾酮類(lèi)抗菌藥物耐藥機(jī)制

王寧

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喹諾酮類(lèi)抗菌藥物耐藥機(jī)制

王寧

（山東省泰安市岱岳區(qū)畜牧獸醫(yī)局 271000）

喹諾酮類(lèi)抗菌藥物屬化學(xué)合成藥物，主要通過(guò)抑制菌體內(nèi)DNA旋轉(zhuǎn)酶及拓?fù)洚悩?gòu)酶IV活性，最終抑制DNA合成而發(fā)揮抗菌作用。依據(jù)藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)、抗菌作用以及體內(nèi)過(guò)程可將此類(lèi)藥物分為一、二、三及四代。第一代為萘啶酸，第二代代表藥物為吡哌酸，氟奎諾酮類(lèi)藥物為第三代，第四代又稱為新奎諾酮類(lèi)。依據(jù)嗜水性又可分為親水性和疏水性兩類(lèi)。各代之間抗菌譜、抗菌強(qiáng)度以及作用對(duì)象存在不同[1]。整體上看，奎諾酮類(lèi)藥物抗菌譜廣、對(duì)革蘭陰性菌抗菌活性強(qiáng)、體內(nèi)部分廣且劑型多樣化，在臨床抗感染過(guò)程中、尤其是多重耐藥菌治療中得到廣泛應(yīng)用。但近年來(lái)，臨床分離菌株，尤其是大腸埃希菌對(duì)其耐藥率顯著提高。從分子水平上看，靶基因及非靶基因的多點(diǎn)突變，是大腸埃希菌針對(duì)奎諾酮類(lèi)藥物耐藥的主要分子事件。從生化機(jī)理上看，細(xì)菌體內(nèi)藥物累積濃度降低、藥物作用的靶酶或靶位點(diǎn)改變以及質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥，是耐藥的主要機(jī)制[2]。

1 細(xì)菌體內(nèi)藥物累積濃度降低

Nikaido等人于1994年研究報(bào)道，大腸埃希菌針對(duì)奎諾酮類(lèi)藥物耐藥，與菌體內(nèi)藥物累積濃度減少有關(guān)[9]。國(guó)內(nèi)方治平等人于2005年采用葡萄糖與能量抑制劑氰氯苯蹤分別作用于敏感及耐藥菌株后，通過(guò)熒光測(cè)定法檢測(cè)菌體內(nèi)奎諾酮類(lèi)藥物濃度，亦發(fā)現(xiàn)敏感菌株體內(nèi)藥物濃度顯著高于耐藥菌株，且MIC差異為160-1280倍，亦證明累積濃度下降，是大腸埃希菌耐藥的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。此種機(jī)制主要涉及細(xì)菌胞膜結(jié)構(gòu)的改變以及外排系統(tǒng)的存在。

1.1 大腸埃希菌外膜通透性改變 膜孔蛋白為大腸埃希菌菌體外膜蛋白(outer membrane protein，OMP)的一種，以三聚體鑲嵌在細(xì)胞外膜的脂質(zhì)層中并和胞外相通，形成胞內(nèi)胞外物質(zhì)交換的通道。大腸埃希菌存在5種不同的膜孔蛋白，即ompC、ompF、PhoE、lamB及蛋白K，前三者孔徑大小分別為1.3nrn、2.4nm和1.2nm，其氨基酰序列及核苷酸序列非常相似，氨基酰序列中沒(méi)有連續(xù)10個(gè)以上的親水性氨基酰出現(xiàn)。耐藥性大腸埃希菌中常出現(xiàn)ompF減少或缺失現(xiàn)象[3]。膜孔蛋白組成的通道為是奎諾酮類(lèi)藥物進(jìn)入菌體內(nèi)的主要途徑，其表達(dá)量減少或缺失引起菌體內(nèi)藥物濃度降低，從而導(dǎo)致耐藥的發(fā)生。資料顯示，此種機(jī)制不能引起細(xì)菌高度耐藥，但有其他耐藥機(jī)制共存時(shí)，能明顯提高細(xì)菌耐藥程度。

1.2 存在主動(dòng)外排系統(tǒng) 主動(dòng)外排系統(tǒng)的存在，是大腸埃希菌多重耐藥的主要機(jī)制之一。Van等人于2000年發(fā)現(xiàn)，大腸埃希菌菌株存在多種外排泵，最為重要的是質(zhì)子依賴型AcrAB-TolC系統(tǒng)，該系統(tǒng)可使菌株對(duì)有機(jī)溶劑、染料、去污劑以及多種抗菌藥物高度耐藥。Touze于2004年采用基因敲除法證實(shí)菌株缺失acrAB及tolC基因時(shí)，抗菌藥物敏感性大為提高，印證了Van等人的研究結(jié)果[14]。為探究AcrAB-Tolc系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)，Sennhauser、Fujihira等人采用定點(diǎn)突變的方法，對(duì)特殊位點(diǎn)氨基酰殘基進(jìn)行替換研究。結(jié)果顯示該系統(tǒng)主要由三個(gè)部分組成，即膜融合蛋白(AcrA)、外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(AerB)和外膜通道蛋白(TolC)。AcrA、AerB和TolC以三聚體形式存在于大腸埃希菌的細(xì)胞膜上，其中AcrA位于周漿間隙中，兩端連接著AerB和TolC；AerB和TolC分別位于細(xì)胞內(nèi)膜和外膜上。在無(wú)底物結(jié)合時(shí)，AcrAB-TolC三聚體結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定。其通道開(kāi)放或閉合取決與三聚體構(gòu)象變化[17]。當(dāng)胞內(nèi)或周漿間隙內(nèi)藥物分子與AerB結(jié)合時(shí)，其構(gòu)像發(fā)生改變，隨之通過(guò)級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，引起AerA和TolC構(gòu)像改變，AcrB和Tolc相互接觸，外排通道開(kāi)放。研究發(fā)現(xiàn)，藥物分子外排主要和H十相關(guān)聯(lián)，它們構(gòu)成一個(gè)反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。通道開(kāi)放后，H十發(fā)生內(nèi)流，藥物分子外排，最終降低菌體內(nèi)藥物有效濃度，引起菌株耐藥。

2 藥物作用靶位的突變

奎諾酮類(lèi)抗菌藥物主要作用靶位為DNA旋轉(zhuǎn)酶及拓?fù)洚悩?gòu)酶IV。藥物間作用靶位存在差異。Hooper等人研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)丙沙星等傳統(tǒng)奎諾酮藥物主要作用于DNA旋轉(zhuǎn)酶，環(huán)丙沙星、加替沙星等新型藥物可均衡作用于DNA旋轉(zhuǎn)酶及拓?fù)洚悩?gòu)酶IV。DNA旋轉(zhuǎn)酶是由兩個(gè)A亞基(GyrA)和兩個(gè)B亞基(GyrB)組成四聚體，催化依賴于ATP的DNA負(fù)超螺旋，在DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的起始階段起重要作用?？Z酮類(lèi)藥物通過(guò)與旋轉(zhuǎn)酶-DNA復(fù)合物結(jié)合而抑制DNA的斷裂-重接循環(huán)[4-5]。拓?fù)洚悩?gòu)酶IV是由兩個(gè)C亞基(PartC)和兩個(gè)E亞基組成的四聚體，在DNA復(fù)制后期起重要作用?？Z酮類(lèi)抗菌藥物通過(guò)作用異構(gòu)酶，從而干擾細(xì)菌的DNA復(fù)制、修復(fù)及轉(zhuǎn)錄等來(lái)殺菌。早年研究表明，大腸埃希菌基因組中存在奎諾酮類(lèi)藥物耐藥決定區(qū)(QRDR)。該區(qū)定位于gyrA的5’末端67-106密碼子區(qū)域。該區(qū)域的單位點(diǎn)突變引起MIC水平升高，但不顯現(xiàn)耐藥表型。同時(shí)兩點(diǎn)以上突變，或者伴發(fā)有次要靶位突變時(shí)，可引起菌株針對(duì)奎諾酮類(lèi)藥物顯著耐藥[6]。菌株來(lái)源不同，QRDR突變位點(diǎn)存在差異?？偟膩?lái)看，大腸埃希菌QRDR主要位點(diǎn)為gyrA內(nèi)83位絲氨酸和87位天冬氨酸，以及parc內(nèi)79位絲氨酸和53位天冬氨酸。瑞士的Casson等于2006年研究后發(fā)現(xiàn)GyrA中val7o突變?yōu)镾er、PartC中Ala81突變?yōu)門(mén)hr以及Glu84突變?yōu)镻ro均可引起大腸埃希菌對(duì)奎諾酮類(lèi)耐藥。07年采用PCR-SSCP技術(shù)，對(duì)40株耐奎諾酮類(lèi)大腸埃希菌進(jìn)行研究。發(fā)現(xiàn)除常見(jiàn)氨基酰突變外，37株菌株尚存在Asp87突變?yōu)锳sn、Ala84突變?yōu)镻ro[7-9]。日本的Niwa發(fā)現(xiàn)，突變氨基酰種類(lèi)，對(duì)于耐藥水平有一定的關(guān)系。其研究中揭示GyrA中QRDR中Asp突變?yōu)镚ly，可顯著增加耐藥水平。

3 質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥

大腸埃希菌針對(duì)奎諾酮類(lèi)藥物耐藥機(jī)制，多歸于染色體靶位突變或多重藥物外排泵過(guò)度表達(dá)。近來(lái)研究表明，質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥(PMQR)亦發(fā)揮著重要作用。（1）1998年Mart等人將來(lái)源于肺炎克雷伯菌UABI的pMG252轉(zhuǎn)化至其他菌株時(shí)，發(fā)現(xiàn)該質(zhì)?？娠@著提高宿主菌對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥水平，從而揭示了質(zhì)粒介導(dǎo)菌株針對(duì)奎諾酮類(lèi)藥物耐藥的機(jī)制[10]。后續(xù)研究探明，該機(jī)制涉及qnrA、aac(6’)-Ib-cr及qepA等基因參與，且不同基因在菌株中分布有所差異。qnrA為一段由657個(gè)核苷酸組成的開(kāi)放讀碼框架，編碼218個(gè)氨基酸序列。該基因呈全球性流行，常定位于I類(lèi)整合子In4家族上，其亞型也不斷發(fā)現(xiàn)。Tran等人2005年研究明確了Qnr的耐藥機(jī)制。該蛋白可先于奎諾酮類(lèi)藥物特異性地與DNA旋轉(zhuǎn)酶或IV型拓?fù)洚悩?gòu)酶結(jié)合，通過(guò)減少酶與藥物結(jié)合位點(diǎn)及改變酶蛋白構(gòu)象，最終引起菌株耐藥[15]。（2）氨基糖苷轉(zhuǎn)移酶基因(aac(6’)-Ib)最早報(bào)道于1986年，現(xiàn)己有30多種相似基因型，主要介導(dǎo)菌株對(duì)氨基糖苷類(lèi)藥物耐藥[11-13]。部分慶大霉素耐藥大腸埃希菌中可發(fā)現(xiàn)aae(6’)-Ib-cr存在。與aae(6’)-Ib相比，其5’端多了12個(gè)獨(dú)特的堿基對(duì)，同時(shí)存在多處點(diǎn)突變。Robiesek等人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)發(fā)生突變時(shí)，尤其是氨基酰序列中102位Trp突變?yōu)锳rg，同時(shí)179位AsP突變?yōu)門(mén)yr后，可引起宿主菌對(duì)部分奎諾酮類(lèi)藥物耐藥。進(jìn)一步研究表明，aac(6’)Ib-cr介導(dǎo)奎諾酮類(lèi)耐藥，主要通過(guò)對(duì)奎諾酮類(lèi)藥物哌嗪環(huán)上氨基氮原子進(jìn)行乙酰化作用實(shí)現(xiàn)的[16]。（3）qepA是法國(guó)學(xué)者2007年發(fā)現(xiàn)的質(zhì)?；颍山閷?dǎo)宿主菌對(duì)親水性奎諾酮類(lèi)藥物低水平耐藥。同年，Yamane進(jìn)一步明確了該基因的結(jié)構(gòu)與功能。qepA由1536個(gè)核昔酰構(gòu)成，編碼蛋白包括511個(gè)氨基酸，為質(zhì)子依賴型外排蛋白。該基因介導(dǎo)奎諾酮類(lèi)耐藥，主要通過(guò)QePA對(duì)親水性奎諾酮類(lèi)藥物外排實(shí)現(xiàn)的[17]。（4）qnr、aac(6’)-Ib-cr及qepA均能夠介導(dǎo)低水平奎諾酮類(lèi)藥物耐藥，三者作用機(jī)制、作用位點(diǎn)存在差異。aac(6’)-Ib-cr及qepA在大腸埃希菌中更為多見(jiàn)。基于三者可共存于同一質(zhì)粒上，三者可共同參與大腸埃希菌針對(duì)奎諾酮類(lèi)藥物的耐藥性。

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（2015–06–05）

S859.79+6

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1007-1733(2015)07-0074-02