植物源性轉(zhuǎn)基因食品DNA提取技術(shù)的研究進(jìn)展

張 娟,吳煒亮,譚嘉力,梁宇斌,李曉明

(廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院國(guó)家食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心,廣東佛山 528300)

植物源性轉(zhuǎn)基因食品DNA提取技術(shù)的研究進(jìn)展

張 娟,吳煒亮,譚嘉力,梁宇斌,李曉明

(廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院國(guó)家食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心,廣東佛山 528300)

如何從食品中提取到高質(zhì)量和高純度的植物基因組DNA是后續(xù)轉(zhuǎn)基因檢測(cè)成功與否的關(guān)鍵因素。通過(guò)對(duì)近年來(lái)國(guó)內(nèi)外有關(guān)食品中植物基因組主要提取方法:CTAB法、SDS法、磁珠法、試劑盒法等進(jìn)行介紹,分析各方法的優(yōu)缺點(diǎn),并展望其未來(lái)發(fā)展方向,以期為后續(xù)食品中植物基因組有效提取方法的建立提供借鑒。

食品,植物基因組,DNA提取

近年來(lái),隨著轉(zhuǎn)基因食品品種的與日俱增,其安全性問(wèn)題在世界范圍內(nèi)引起廣泛關(guān)注。對(duì)此,各國(guó)都普遍要求對(duì)轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行標(biāo)識(shí),從而保護(hù)消費(fèi)者的知情權(quán)和選擇權(quán)。目前,植物源性轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)技術(shù)主要是基于基因水平的,這就對(duì)前期的核酸提取技術(shù)和質(zhì)量提出很高要求。由于轉(zhuǎn)基因食品的組成成分比較多樣,加工過(guò)程復(fù)雜,因此對(duì)DNA提取造成潛在的困難?；诖?國(guó)內(nèi)外研究人員積極探索各種適合于轉(zhuǎn)基因食品DNA的高效提取方法,本文就有關(guān)這方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 植物源性轉(zhuǎn)基因食品DNA提取技術(shù)的研究背景

對(duì)植物源性食品進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè),不論是最基礎(chǔ)的PCR檢測(cè),還是后續(xù)更為復(fù)雜的分子生物學(xué)操作,前提條件就是從食品中獲得能夠滿(mǎn)足分子生物學(xué)操作要求的高質(zhì)量基因組DNA。雖然該技術(shù)在植物學(xué)研究領(lǐng)域?qū)儆诔墒旆€(wěn)定的常規(guī)技術(shù),但在食品特別是復(fù)雜食品領(lǐng)域并不完全適用。究其原因,主要來(lái)自?xún)蓚€(gè)方面:各種物理、化學(xué)及生物學(xué)加工處理方式對(duì)食品中的DNA造成不同程度的破壞和降解;食品生產(chǎn)加工過(guò)程中添加或自然產(chǎn)生的各種物質(zhì)對(duì)DNA的提取造成不同程度的干擾。所以,長(zhǎng)期以來(lái)食品中DNA提取技術(shù)成為制約基因檢測(cè)技術(shù)在食品安全檢測(cè)中進(jìn)一步發(fā)展的重要因素?；诖?無(wú)論是從傳統(tǒng)方法的改進(jìn)還是新方法的開(kāi)發(fā)方面都出現(xiàn)了許多新動(dòng)向[1-4]。

2 植物源性轉(zhuǎn)基因食品DNA提取技術(shù)

2.1 傳統(tǒng)提取方法的改進(jìn)

2.1.1 CTAB法 CTAB(hexadecyl trimethyl ammonium bromide,十六烷基三甲基溴化銨)是一種陽(yáng)離子去污劑,能與核酸形成復(fù)合物。在低鹽溶液(0.1～0.5mol/L NaCl)中,該復(fù)合物會(huì)因溶解度降低而沉淀,而大部分的蛋白質(zhì)及多糖仍存在于溶液中,通過(guò)離心可將復(fù)合物與蛋白質(zhì)及多糖等小分子物質(zhì)分離;在高鹽溶液(>0.7mol/L NaCl)中,該復(fù)合物可溶解并穩(wěn)定存在,再用異丙醇/無(wú)水乙醇沉淀核酸,從而獲得核酸提取物[5-6]。

CTAB法是經(jīng)典的植物DNA提取方法,也是目前研究最多的用于提取轉(zhuǎn)基因食品DNA的方法。國(guó)內(nèi)外學(xué)者依據(jù)不同的食品類(lèi)型,對(duì)CTAB法的各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行針對(duì)性地優(yōu)化,以達(dá)到提取高質(zhì)量DNA的目的。周紅霞等[7]為了提高食用油中DNA的沉淀效果加入核酸共沉淀劑和NaAc,經(jīng)優(yōu)化的CTAB法有效地提取到可用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)的DNA模板。相比上述的方法優(yōu)化,Sonia等[8]則從在裂解液中添加不同成分、裂解液組成成分濃度、裂解時(shí)間及沉淀時(shí)間等四個(gè)方面對(duì)CTAB法進(jìn)行細(xì)致地優(yōu)化,最終形成一種適合大多數(shù)植物油中DNA提取的方法。該方法相比其他傳統(tǒng)方法耗時(shí)短、用油量少,且比商品化試劑盒價(jià)格更加優(yōu)惠。Tung等[9]通過(guò)比較傳統(tǒng)CTAB法和稍加改進(jìn)的CTAB法(在裂解液中加入1%的巰基乙醇)提取未經(jīng)加工的大豆和玉米中DNA的效果發(fā)現(xiàn),傳統(tǒng)CTAB法提取效果更好,DNA濃度分別達(dá)32.7ng/mg和28.4ng/mg,A260/A280吸光值比值均為1.9。?zge等[10]在運(yùn)用PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米和大豆的過(guò)程中,以CTAB法提取深加工產(chǎn)品中的DNA取得良好效果,后續(xù)PCR反應(yīng)能擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)目的條帶。孫敏等[11]在使用CTAB法提取粉絲中DNA的過(guò)程中,加入豬肉DNA作為擔(dān)體,實(shí)現(xiàn)微量核酸的共沉淀,該方法簡(jiǎn)單、實(shí)用,大大提高了核酸的提取效率,為轉(zhuǎn)基因成分的檢出奠定了良好的基礎(chǔ)。此外,在裂解液中加入PVP(Polyvinylpyrrolidone,聚乙烯吡咯烷酮)也是CTAB法常用的改良方式。莊逸林等[12]通過(guò)在CTAB法提取過(guò)程中加入β-巰基乙醇和PVP來(lái)去除多糖和多酚類(lèi)物質(zhì),實(shí)驗(yàn)證明該方法可用于新鮮番木瓜、番木瓜干和番木瓜果汁等經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單加工產(chǎn)品的DNA提取。姚偉等[13]通過(guò)增加酚類(lèi)物質(zhì)的結(jié)合劑PVP和起抗氧化作用的亞硫酸鈉,有效防止了多酚類(lèi)物質(zhì)的氧化。同時(shí),PVP還可作為澄清劑吸附甘蔗葉中的多糖,使之沉淀去除。閆苗苗等[14]為解決植物易褐化的問(wèn)題加入適量PVP以結(jié)合多酚類(lèi)化合物。陳笑蕓等[15]對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆深加工食品進(jìn)行適當(dāng)前處理后,利用改良CTAB法提取DNA,能顯著提高大豆深加工食品中DNA的提取效率和質(zhì)量。高媛等[16]為探求適宜轉(zhuǎn)基因蘋(píng)果種子DNA的提取方法,采用改良CTAB法、SDS法與高鹽低pH SDS法對(duì)蘋(píng)果種子進(jìn)行提取方法比較。結(jié)果表明,改良CTAB法相比其他2種方法獲得的DNA產(chǎn)量最高,可達(dá)0.221mg/g,更適于轉(zhuǎn)基因蘋(píng)果種子DNA提取。吳申懋等[17]以食品中常見(jiàn)的添加劑液體麥精和玉米糖漿為研究材料,采用改良CTAB法、SDS法和試劑盒法提取DNA。實(shí)驗(yàn)證明,改良CTAB法可得到較好質(zhì)量的DNA,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶單一,可用以區(qū)分這兩種添加劑。張秀杰等[18]預(yù)先用PBS緩沖液除去大部分的可溶性多糖,再通過(guò)提高CTAB緩沖液中NaCl濃度以去除殘余多糖,成功從蜂蜜中提取到片段完整、純度較高的DNA。而Sónia等[19]則為了追溯蜂蜜的植物源性,比較了5種不同的DNA提取方法,實(shí)驗(yàn)證明,在不考慮DNA產(chǎn)率的情況下,改良CTAB法和DNeasy Plant Mini試劑盒提取的DNA能獲得比較理想的PCR擴(kuò)增效果。同樣地,Patrick等[20]以CTAB法為基礎(chǔ),通過(guò)改變幾種加入成分和提取參數(shù),建立一種從蜂蜜中自動(dòng)提取DNA的方法。相比手動(dòng)CTAB法,該方法獲得更高產(chǎn)量的DNA,且不存在PCR抑制物。此前,該團(tuán)隊(duì)曾基于上述方法建立了從植物種子中自動(dòng)提取DNA的方法,用于檢測(cè)監(jiān)督轉(zhuǎn)基因植物[21]。

CTAB法雖然可以用于轉(zhuǎn)基因食品中DNA的提取,但為了提高提取效率,往往需要針對(duì)樣品實(shí)際情況進(jìn)行反復(fù)的方法改良。此外,該法存在操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、試劑組成復(fù)雜等問(wèn)題,使其在使用上受到一定限制。

2.1.2 SDS法 與CTAB不同,SDS(Sodium dodecyl sulfate,十二烷基硫酸鈉)是一種陰離子去污劑,在高溫條件(55～65℃)下能裂解細(xì)胞,使染色體離析和蛋白質(zhì)變性,同時(shí)與蛋白質(zhì)和多糖結(jié)合成復(fù)合物,釋放出核酸。通過(guò)提高鹽濃度和降低溫度,使該復(fù)合物沉淀出來(lái),后用酚/氯仿反復(fù)抽提上清液中的核酸,以去除殘余蛋白質(zhì),最后用乙醇沉淀DNA[5-6]。

SDS法也是提取植物基因組DNA的經(jīng)典方法。Tigst等[22]用3種不同的DNA提取方法(試劑盒法、SDS法和高通量法)提取油菜、亞麻和大豆單個(gè)種子中的DNA,DNA平均產(chǎn)量達(dá)58～251ng/mg,均可滿(mǎn)足后續(xù)檢測(cè)需求。高媛等[16]為了探求適于轉(zhuǎn)基因蘋(píng)果果肉的DNA提取方法,采用改良CTAB法、SDS法和高鹽低pH SDS法對(duì)蘋(píng)果果肉進(jìn)行基因組總DNA提取。結(jié)果表明,相比其他2種方法,SDS法在純度和產(chǎn)量上效果最好,DNA的A260/A280值為1.808,產(chǎn)量為0.012mg/g。李蔥蔥等[23]以SDS為主要提取試劑,建立了用于玉米葉片基因組DNA的微量快速提取方法。該方法省略了抽提、洗滌等步驟,提取濃度可達(dá)250ng/μL以上,A260/A280的比值在1.9左右,純度較高,滿(mǎn)足了轉(zhuǎn)基因成分定性PCR檢測(cè)的需要。趙艷等[24]應(yīng)用改良SDS法提取轉(zhuǎn)基因稻米及經(jīng)過(guò)蒸煮、微波膨化后稻米食品中的DNA,結(jié)果顯示該法提取效果明顯好于CTAB法,PCR技術(shù)能檢測(cè)到加工食品中的轉(zhuǎn)基因成分。許冬倩等[25]在SDS法提取油脂DNA的操作過(guò)程中,省略了酚/氯仿抽提的步驟,獲得了滿(mǎn)足下游PCR檢測(cè)的DNA質(zhì)量。推測(cè)其可能原因?yàn)橛椭懈蓴_DNA提取的蛋白質(zhì)及多糖類(lèi)物質(zhì)含量較低,酚/氯仿抽提的意義不太,相反,該步驟的增加伴隨著DNA的損失。Hellebrand等[26]則利用SDS法從粗制油和精煉菜籽油中均提取到可用于PCR檢測(cè)的DNA。梅玲玲等[27]采用CTAB法、酶裂解法及SDS法提取轉(zhuǎn)基因食品中的DNA,綜合DNA的提取純度、濃度、PCR擴(kuò)增效果及操作簡(jiǎn)易程度等因素,判定SDS法提取效果最好,具有經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便的特點(diǎn),適用于PCR檢測(cè)。毛國(guó)杰等[28]在SDS提取緩沖液中加入乙醇和PVP有效去除轉(zhuǎn)基因番茄中的多糖和酚類(lèi)物質(zhì),同時(shí)降低鹽濃度以沉淀多糖,獲得的DNA可進(jìn)行穩(wěn)定而準(zhǔn)確的PCR檢測(cè),該方法克服了SDS法對(duì)含糖量高的樣品提取效果不佳的缺陷。

SDS法操作簡(jiǎn)單、快捷,可獲得符合檢測(cè)要求的DNA。但是,由于SDS的主要作用是沉淀蛋白質(zhì),在去除多糖類(lèi)物質(zhì)方面不夠理想,因此不適合提取含糖類(lèi)較多的食品。

2.2 新提取方法的開(kāi)發(fā)

2.2.1 磁珠法 磁珠法的基本原理是將細(xì)胞中游離出來(lái)的核酸分子吸附到磁珠表面,蛋白質(zhì)等雜質(zhì)不被吸附而留在溶液中。在磁場(chǎng)作用下,使磁珠與液體分離,回收磁珠,再用洗脫液洗脫磁珠,從而獲得高純度的DNA[5]。

磁珠法由于可以提取痕量DNA,而且提取的DNA純度好、質(zhì)量高,因此被廣泛應(yīng)用于多種復(fù)雜及深加工食品的DNA提取。王愛(ài)迪等[29]將磁珠法與市售試劑盒法進(jìn)行比較,考察磁珠法對(duì)深加工食品中基因片段的提取效率。結(jié)果表明,磁珠法提取的DNA的完整性、濃度以及可擴(kuò)增性等均超過(guò)試劑盒法。趙衛(wèi)東等[30]制備了用于植物源性轉(zhuǎn)基因食品中提取基因組DNA的磁性微球,并將其作為吸附劑進(jìn)行DNA提取,結(jié)果表明,所提幾種食品DNA的濃度和純度較高,可滿(mǎn)足后續(xù)檢測(cè)需求。此外,該學(xué)者又以大豆和馬鈴薯植物源性食品為研究對(duì)象,比較了磁珠法、試劑盒法和CTAB法等5種方法提取DNA的效果,結(jié)果顯示,與其他幾種提取方法相比,磁珠法提取的DNA濃度稍低,但純度較高,對(duì)于豆油和淀粉等深加工樣品,可提取到很好的基因組片段,滿(mǎn)足轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的要求[31]。Catherine等[32]通過(guò)對(duì)比Wizard試劑盒磁珠、硅膠和羥基磷灰石等3種材料吸附橄欖油中DNA的能力,發(fā)現(xiàn)Wizard磁珠試劑盒法提取效果最好。Wu等[33]比較了Wizard磁珠純化試劑盒和CTAB法對(duì)大豆油的提取效率,發(fā)現(xiàn)磁珠法提取DNA的擴(kuò)增效率更高。2011年,該科研團(tuán)隊(duì)同樣利用磁珠純化試劑盒提取食用油中的DNA,完全滿(mǎn)足后續(xù)PCR-CE-SSCP檢測(cè)方法的要求[34]。楊冬燕等[35]比較了核酸富集處理前后3種核酸提取方法(DN easy? Plant Mini試劑盒法、Food EX Magnetic試劑盒法和CTAB法)對(duì)精煉食用植物油的提取效果。實(shí)驗(yàn)證實(shí),磁珠試劑盒法(EX Magnetic試劑盒法)在采用核酸富集處理后,能擴(kuò)增出目的片段的樣品數(shù)量由原來(lái)的0個(gè)增加到6個(gè),提取效率顯著提高。

磁珠法通過(guò)特異吸附DNA去除了干擾后續(xù)反應(yīng)的抑制劑,具有很好的純化作用。此外,該法無(wú)需離心和加入多種試劑,操作簡(jiǎn)單,適合核酸自動(dòng)化提取需求,是未來(lái)核酸提取方法的一個(gè)重要發(fā)展方向。

2.2.2 試劑盒法 試劑盒法是通過(guò)將提取食品中DNA所需的試劑和耗材整合在一起,從而可直接用于提取高質(zhì)量DNA的方法,基于的主要原理有離心柱法、離子交換法及磁珠法等。由于該方法適用于同時(shí)提取多個(gè)樣品,操作簡(jiǎn)便、快速、高效,無(wú)需酚氯仿抽提,避免有毒試劑的污染,從而受到科研人員的青睞。其中用于提取食用油中基因組的試劑盒種類(lèi)繁多[36]。程紅梅等[37]以大豆油為材料,建立了一種快速、簡(jiǎn)便提取大豆油中DNA的試劑盒法,能從10mL大豆油中提取0.4μg高純度DNA。該方法用于提取市售的十幾種精煉大豆油DNA并進(jìn)行PCR檢測(cè),分別擴(kuò)增出不同的目的片段。Spaniolas等[38]通過(guò)比較3種不同DNA提取試劑盒對(duì)葵花籽油和橄欖油的提取效果發(fā)現(xiàn),QIAamp DNA Stool試劑盒獲得比較強(qiáng)的PCR擴(kuò)增信號(hào)相比其他兩種試劑盒。Simona等[39]則運(yùn)用擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性的方法來(lái)評(píng)價(jià)貯藏時(shí)間對(duì)橄欖油DNA的影響,使用NucleoSpin Plant試劑盒(Macherey-Nagel,Düren,Germany)提取DNA達(dá)到了預(yù)期效果,結(jié)果顯示一個(gè)月內(nèi)生產(chǎn)的橄欖油提取DNA質(zhì)量較好,一個(gè)月后提取DNA質(zhì)量顯著降低。Michelangelo等[40]為了建立辨別橄欖油真假屬性的檢測(cè)方法,比較了試劑盒法和改良CTAB法提取8種植物油中DNA的效果,結(jié)果發(fā)現(xiàn)試劑盒法提取DNA可擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)目的條帶,而CTAB法提取的DNA無(wú)擴(kuò)增。除此之外,還有用于其他食品中(特別是深加工食品)基因組提取的試劑盒。莊逸林等[11]用改良的QIAGEN基因組提取試劑盒對(duì)番木瓜罐頭進(jìn)行核酸提取方法的優(yōu)化,與改良的CTAB法相比,該方法成功提取了可用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)的DNA。同樣是番木瓜制品中DNA提取的方法研究,Kiyomi等[41]將不同樣品經(jīng)過(guò)適當(dāng)前處理后使用不同試劑盒進(jìn)行DNA提取。相比其他5種基因組提取試劑盒,QIAGEN的陰離子交換試劑盒(Genomic-tip 100G)獲得較高純度和產(chǎn)量的DNA,可用于轉(zhuǎn)基因番木瓜的檢測(cè)研究。Rafaat等[42]比較了6種從玉米及其衍生產(chǎn)品中提取DNA的方法,結(jié)果發(fā)現(xiàn),Roche的DNA提取試劑盒從玉米的衍生產(chǎn)品中獲得純度最高的DNA,部分樣品后續(xù)的PCR檢測(cè)能檢測(cè)到相應(yīng)的外源基因。Angela等[43]則對(duì)比了2種不同試劑盒對(duì)深加工食品(如櫻桃果醬、馬鈴薯水餃及巧克力等)的DNA提取效果,實(shí)驗(yàn)證實(shí),Wizard? Magnetic DNA Purification for Food試劑盒對(duì)提取富含多糖和多酚化合物的食品中DNA的效果較好;而QIAGEN DNeasy? Tissue試劑盒對(duì)富含油脂食品的提取效果更加理想,具有特異、靈敏和重現(xiàn)性好的優(yōu)點(diǎn)。

由于食品種類(lèi)繁多且生產(chǎn)工藝復(fù)雜,其DNA提取技術(shù)應(yīng)該有不同的針對(duì)性,不同的產(chǎn)品應(yīng)該采用不同的試劑盒,而目前國(guó)內(nèi)外用于提取食品中DNA的試劑盒卻存在如下的問(wèn)題:品種相對(duì)單一,難以滿(mǎn)足各類(lèi)食品特別是復(fù)雜食品的檢測(cè)需求;標(biāo)準(zhǔn)化程度低和可操作性較差,按照說(shuō)明書(shū)要求往往提取不到目標(biāo)產(chǎn)物(主要針對(duì)深加工食品);國(guó)外試劑盒價(jià)格昂貴,造成檢測(cè)成本升高。因此,要積極研發(fā)針對(duì)不同加工程度食品的DNA提取技術(shù),提高其可操作性,促進(jìn)其標(biāo)準(zhǔn)化,使該技術(shù)能得到廣泛應(yīng)用。

2.3 其他提取方法

植物源性食品中基因組的提取方法遠(yuǎn)不止上述四種類(lèi)型,常見(jiàn)的還有高鹽低pH法、尿素法及異丙醇沉淀法等。但是,由于技術(shù)條件的限制,這些方法并沒(méi)有在食品分析領(lǐng)域獲得廣泛的認(rèn)可和應(yīng)用。曹文波等[44]建立了一種從玉米和水稻葉片中提取高質(zhì)量基因組的改良尿素法,與傳統(tǒng)方法(CTAB和SDS法)相比,該法具有產(chǎn)率高、快速簡(jiǎn)便、可常溫操作、成本低等優(yōu)點(diǎn)。王永等[45]曾以轉(zhuǎn)基因大豆為研究材料,采用改良Chelex-100法和常規(guī)CTAB法進(jìn)行基因組的提取比較和評(píng)價(jià)。結(jié)果表明,改良Chelex-100法的提取效率與CTAB法相當(dāng),且具有簡(jiǎn)便、快捷、經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn),可替代后者用于轉(zhuǎn)基因檢測(cè)。徐偉麗等[46]則以豆粉為材料來(lái)評(píng)價(jià)幾種基因組提取方法的工作效率,在綜合考慮DNA的純度和濃度后認(rèn)為幾種提取方法的優(yōu)劣依次為:改進(jìn)熱解法>改進(jìn)異丙醇沉淀法>熱解法>異丙醇沉淀法>高鹽低pH法>改進(jìn)CTAB法>CTAB法>改進(jìn)SDS法。同年,該研究團(tuán)隊(duì)以生豆?jié){為研究對(duì)象,比較了熱解法、異丙醇沉淀法、CTAB法、SDS法、高鹽低pH和異硫氰酸胍法以及它們的改良方法的提取效果。結(jié)果顯示,除異丙醇沉淀法外,其他方法提取的DNA均可滿(mǎn)足PCR的檢測(cè)需求[47]。

3 不同植物源性轉(zhuǎn)基因食品DNA提取技術(shù)的方法比較

針對(duì)上文所述各種提取方法來(lái)看,目前并不存在一種通用型的植物源性轉(zhuǎn)基因食品DNA的提取方法。傳統(tǒng)方法雖然適用于大多數(shù)樣品的DNA提取且成本低,但不宜大批量樣品的DNA提取。此外,還存在使用的有機(jī)溶劑容易污染環(huán)境、操作相對(duì)劇烈從而對(duì)DNA有一定程度破壞及提取的DNA需進(jìn)一步純化等問(wèn)題。新型方法往往已形成商品化且環(huán)保安全,適合大規(guī)模樣品的DNA提取和高效純化,但相對(duì)成本較高,而且需要專(zhuān)門(mén)的配套設(shè)備。由此可見(jiàn),不同方法具有各自不同的優(yōu)缺點(diǎn),操作人員需要根據(jù)各自的食品類(lèi)型和特點(diǎn)進(jìn)行選擇和優(yōu)化,從而確定出最佳方案。

4 小結(jié)和展望

從理論上講不論是經(jīng)典提取方法還是商業(yè)化的試劑盒都可以用于食品中植物源基因組DNA的提取,但食品往往經(jīng)歷復(fù)雜的加工程序,其中產(chǎn)生的某些物理、化學(xué)或酶因子會(huì)嚴(yán)重影響其DNA質(zhì)量,因此,在實(shí)際應(yīng)用中其提取技術(shù)又不能與普通的植物組織相提并論?？偨Y(jié)已有的DNA提取技術(shù)及其在食品中的應(yīng)用研究,目前植物源性食品中DNA提取需突破的關(guān)鍵技術(shù)有:加強(qiáng)不同食品中含有的各種抑制劑的前處理技術(shù);綜合幾種DNA提取方法進(jìn)行優(yōu)化,以便找到最適方法;針對(duì)片段小和含量低的情況,提高DNA的富集和純化技術(shù)?？偠灾?如何快速、高效、經(jīng)濟(jì)地從食品中提取到高產(chǎn)率和高純度的DNA已成為轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)體系建立的重要制約因素。在食品工業(yè)化的今天,DNA提取技術(shù)的發(fā)展必須與食品基因檢測(cè)的需求相適應(yīng),該技術(shù)的商品化和自動(dòng)化將是未來(lái)發(fā)展的主流方向,這不僅能為檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)提供便利,而且有利于檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)化,為轉(zhuǎn)基因食品的安全標(biāo)識(shí)提供有效的技術(shù)保障。

[1]Panagiotis M,Ioannis G,Ioannis S,et al. Advances of DNA-based methods for tracing the botanical origin of food products[J].Food Res Int,2014,60:163-172.

[2]Costa J,Mafra I,Oliveira MBPP. Advances in vegetable oil authentication by DNA-based markers[J]. Trends Food Sci Tech,2012,26:43-55.

[3]Caterina A,Michelangelo V,Simona P,et al. The use of food genomics to ensure the traceability of olive oil[J]. Trends Food Sci Tech,2011,22:237-244.

[4]張海亮,吳亞君,陳銀基,等.食用油中DNA提取方法的研究進(jìn)展[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2010,36(11):128-132.

[5]凌莉,李志勇,黃韻,等.食品中植物基因組DNA提取純化方法研究進(jìn)展[J].食品科技,2012,37(5):6-15.

[6]蔡翠霞,肖維威,康文杰,等.轉(zhuǎn)基因食品DNA提取研究進(jìn)展[J].中國(guó)生物工程雜志,2011,31(5):121-125.

[7]周紅霞,華春,張紅琳,等. PCR法定性檢測(cè)大豆食用油中轉(zhuǎn)基因成分[J].食品工業(yè)科技,2012,33(6):87-91.

[8]Sonia RG,María DB,Manuel PM,et al. Development of a method to recovery and amplification DNA by real-time PCR from commercial vegetable oils[J]. Food Chem,2014,158:374-383.

[9]Tung N,Son CT,et al. Comparison of DNA extraction efficiencies using various methods for the detection of genetically modified organisms(GMOs)[J]. Int Food Res J,2009,16:21-30.

[10]?zge A,Funda Y,Karlo M. PCR detection of genetically modified maize and soy in mildly and highly processed foods[J]. Food Control,2013,32:525-531.

[11]孫敏,粟志平,梁成珠,等.粉絲類(lèi)產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)[J].食品科學(xué),2008,29(6):230-233.

[12]莊逸林,相大鵬,周木龍,等.番木瓜及其深加工制品中轉(zhuǎn)基因成分定性PCR檢測(cè)方法的建立[J].食品科學(xué),2007,28(7):352-355.

[13]姚偉,耿廣良,余愛(ài)麗,等.一種改良的轉(zhuǎn)基因甘蔗基因組DNA提取方法[J].熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào),2004,12(3):257-260.

[14]閆苗苗,魏光成,潘效紅,等.一種適用于動(dòng)物與植物總DNA提取的方法-改良CTAB法[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,36(20):8488,8588.

[15]陳笑蕓,汪小福,周育,等.轉(zhuǎn)基因大豆深加工食品DNA鑒定技術(shù)研究[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào),2013,13(4):156-162.

[16]高媛,杜國(guó)強(qiáng),師校欣. 適于轉(zhuǎn)基因蘋(píng)果種子和果肉總DNA提取的方法[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2010,26(16):238-241.

[17]吳申懋,鄧志瑞,陳沁. PCR技術(shù)區(qū)分液體麥精和玉米糖漿[J]. 食品工業(yè)科技,2013,34(23):151-155.

[18]張秀杰,刁青云,宛煜嵩,等. 蜂蜜中轉(zhuǎn)基因成分的PCR檢測(cè)[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué),2010,29(3):584-587.

[19]Sónia S,Joana SA,Maria BO,et al. Improving DNA isolation from honey for the botanical origin identification[J]. Food Control,2014,http://dx.doi.org/10.1016/j.foodcont.2014.02.035

[20]Patrick G,Adelina E,Paul M,et al. Automated DNA extraction from pollen in honey[J]. Food Chem,2014,149:302-306.

[21]Patrick G,Andrea H,Adelina E,et al. Development of a CTAB buffer-based automated gDNA extraction method for the surveillance of GMO in seed[J]. Eui Food Res Technol,2013,236:599-606.

[22]Tigst D,Indira R,Michelle H,et al. Assessment of DNA extraction methods for PCR testing of discontinued or unapproved biotech events in single seeds of canola,flax and soybean[J]. Food Control,2012,24:44-49.

[23]李蔥蔥,劉娜,李飛武,等. 一種快速提取玉米基因組DNA的方法[J]. 玉米科學(xué),19(1):52-55.

[24]趙艷. 轉(zhuǎn)基因稻米加工食品的PCR檢測(cè)技術(shù)研究[J]. 中國(guó)糧油學(xué)報(bào),2006,21(3):198-201.

[25]許冬倩,郝義波. 一種有效的油脂DNA的提取方法[J]. 食品研究與開(kāi)發(fā),2008,29(10):42-45.

[26]Hellebrand M,Nagy M,Morsel JT. Determination of DNA traces in rapeseed oil[J]. Z Lebensm Unters Forsch A,1998,206:237-242.

[27]梅玲玲,徐藝珍,程蘇云,等. 轉(zhuǎn)基因食品DNA提取技術(shù)研究[J]. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2005,15(6):689-690,749.

[28]毛國(guó)杰,歐陽(yáng)青,蔡文啟,等. 一種適于轉(zhuǎn)基因番茄檢測(cè)的高效穩(wěn)定的DNA提取方法[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2001,9(4):363-365.

[29]王愛(ài)迪,冉曉華,陳磊,等. 超強(qiáng)磁性微球提取深加工轉(zhuǎn)基因食品DNA[J]. 食品科學(xué),2013,34(10):122-125.

[30]趙衛(wèi)東,鄭文杰,王愛(ài)迪,等. 磁性微球在植物源性轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)中的應(yīng)用[J]. 食品研究與開(kāi)發(fā),2012,33(6):128-130.

[31]趙衛(wèi)東,鄭文杰,賀艷. 植物源性食品DNA提取方法的建立及幾種方法比較[J]. 食品科技,2012,37(9):306-310.

[32]Catherine B,Delphine C,Isabelle M,et al. Comparative study of methods for DNA preparation from olive oil samples to identify cultivar SSR alleles in commercial samples:possible forensic applications[J]. J Agric Food Chem,2004,52:531-537.

[33]Wu Y,Chen Y,Ge Y,et al. Detection of olive oil using the Evagreen real-time PCR method[J]. Eur Food Res Technol,2008,227:1117-1124.

[34]Wu Y,Zhang H,Han J,et al. PCR-CE-SSCP applied to detect cheapoil blended in olive oil[J]. Eur Food Res Technol,2011,233:313-324.

[35]楊冬燕,楊永存,張海龍,等. 核酸富集處理對(duì)精煉食用植物油DNA提取效率的影響[J]. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2009,19(12):2770-2772.

[36]Advances in vegetable oil authentication by DNA-based markers[J]. Trends food Sci Tech,2012,26:43-55.

[37]程紅梅,彭于發(fā),金蕪軍,等. 一種快速、簡(jiǎn)便提取大豆油DNA的方法及轉(zhuǎn)基因大豆油的檢測(cè)[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,40(5):1069-1072.

[38]Spaniolas S,Bazakos C,Spano T,et al. The potential of plastid trnL(UAA)intron polymorphisms for the identification of the botanical origin of plant oils[J]. Food Chem,2010,122:850-856.

[39]Simona P,Matteo B,Caterina A,et al. Storage-time effects on olive oil DNA assessed by Amplified Fragments Length Polymorphisms[J]. Food Chem,2010,123:787-793.

[40]Michelangelo V,Caterina A,Nelson M. Detection of plant oil DNA using high resolution melting(HRM)post PCR analysis:A tool for disclosure of olive oil adulteration[J]. Food Chem,2013,141:3820-3826.

[41]Kiyomi O,Kosuke N,Masaki K,et al. A DNA extraction and purification method using an ion-exchange resin type kit for the detection of genetically modified papaya in processed papaya products[J]. Food Control,2013,32:728-735.

[42]Rafaat ME,Mohamed FR,Klaus DJ. DNA extraction methods for detecting genetically modified foods:A comparative study[J]. Food Chem,2011,126:1883-1889.

[43]Angela DP,Vito TF,Maria CG,et al. A comparison of DNA extraction methods for food analysis[J]. Food Control,2007,18:76-80.

[44]曹文波,鄭璐璐,謝文海. 一種提取植物基因組DNA的方法-改良尿素法[J]. 華中師范大學(xué)學(xué)報(bào),2008,42(3):448-451.

[45]王永,蘭青闊,張莉,等. 改良Chelex-100法和CTAB法用于轉(zhuǎn)基因抗草甘膦大豆檢測(cè)效果的比較[J]. 大豆科學(xué),2008,27(5):898-901.

[46]徐偉麗,馬鶯,杜明,等. 豆粉基因組DNA不同提取方法的比較[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2011,27(23):119-122.

[47]徐偉麗,杜明,馬鶯,等. 生豆?jié){基因組DNA不同提取方法的比較研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(20):12013-12015,12017.

Advances on extraction technologies of plant genomic DNA in food

ZHANG Juan,WU Wei-liang,TAN Jia-li,LIANG Yu-bin,LI Xiao-ming

(Guangdong Test Center of Product Quality Supervision,China National Food Quality Supervision and Testing Center,Foshan 528300,China)

How to acquire high purity and quantity plant genomic DNA in food has been an important step in genetically modified organisms(GMOs)detection. Several main extraction methods of plant genomic DNA were reviewed in this paper. The discussions were mainly focused on the advantages and disadvantages of several methods and the current status and perspectives of plant genomic DNA extraction technology in food,in order to supply some information for establishing the effective plant genomic DNA extraction method in food.

food;plant genome;DNA extraction

2014-06-13

張娟(1981-)，女，博士，主要從事轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)方面的相關(guān)研究。

廣東省自然科學(xué)基金博士啟動(dòng)項(xiàng)目(S2012040007679);中國(guó)南方智谷引進(jìn)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(201209)。

TS207.3

A

1002-0306(2015)07-0396-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.075