miR-26a在卵巢癌患者血清中的表達及其臨床意義

陜西省腫瘤醫(yī)院(西安710061)

周　敏　崔曉娜 　趙西俠 　王　勤

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miR-26a在卵巢癌患者血清中的表達及其臨床意義

陜西省腫瘤醫(yī)院(西安710061)

周敏崔曉娜 趙西俠 王勤

目的:探討卵巢癌患者血清miR-26a的表達情況及其在卵巢癌診斷及預后的價值。方法:收集70例卵巢癌患者及健康婦女的血清標本,提取血清總RNA,通過實時定量PCR檢測血清miR-26a的表達水平,繪制ROC曲線；并分析miR-26a的表達水平與卵巢癌患者臨床病理特征的關系,以及miR-26a的表達與病人的生存之間的關系。結果:卵巢癌患者血清中miR-26a表達高于健康對照組,ROC 曲線下面積0.7963,最大約登指數(shù)0.729,靈敏度84.3%,特異度88.6%,對應診斷界值3.07。卵巢癌患者血清miR-26a表達與卵巢癌的臨床分期、細胞核分化程度呈正相關,而與年齡及組織學類型無顯著相關性。血清miR-26a高表達的卵巢癌患者5年生存率要低于血清miR-26a低表達患者。結論:卵巢癌患者血清中miR-26a表達水平增高,為卵巢癌的臨床診斷及預后判斷提供了重要參考。

卵巢癌由于缺少有效的篩查手段,確診時70%以上已是晚期,病死率居婦科惡性腫瘤的首位,5年生存率低于30%。miRNA是一組存在于真核生物中的長度約21～23個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子RNA,通過降解靶mRNA或抑制其翻譯,從而調(diào)控基因的表達,調(diào)節(jié)細胞生長、組織分化等,因而與發(fā)育、疾病有關[1]。研究表明：miRNA同腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關[2]，miR-26a在多種惡性腫瘤中異常表達,并與腫瘤細胞的增殖、侵襲遷移等有關[3]。Shen等[4]研究證明MiR-26a促進卵巢癌的增殖及腫瘤的形成。Chung[5]通過miRNA芯片分析了2例卵巢癌患者于健康對照的miRNA血清表達譜,發(fā)現(xiàn)miR-26a表達上調(diào),被認為是候選的卵巢癌新的生物標志物。本研究利用RT-qPCR 技術檢測卵巢癌患者血清miR-26a的表達并進一步分析其表達意義。

資料與方法

1 一般資料觀察組70例為陜西省腫瘤醫(yī)院2011年7月至2014年7月收治的卵巢癌患者；對照組70例為同期健康體檢者。觀察組均符合納入標準:①患者均經(jīng)影像學和病理組織學確診為卵巢癌,均為初診初治患者；②均未接受放、化療及激素等藥物治療； ③肝腎功能未見異常；④無其他腫瘤及內(nèi)科疾病。年齡30～75歲,平均60.14±5.33歲；絕經(jīng)56例,未絕經(jīng)14例；臨床分期: 早期21 例,中期33 例,晚期13 例。對照組70例健康婦女中,年齡28～76歲,平均58.14±8.57歲；絕經(jīng)53例,未絕經(jīng)17例。兩組受試者在年齡、生理等方面比較無顯著性差異(P<0.05),具有可比性。

2 檢測方法

2.1標本收集：空腹采血5 ml,真空干燥管中保存,2000r/min 離心10 min 后,-80℃冰箱保存待測。

2.2試劑與主要儀器：miR-26a和內(nèi)參U6引物購自上海吉瑪技術服務公司,Trizol試劑由美國Invitrogen公司提供,miRcute miRNA提取分離試劑盒購自北京天根生化科技有限公司,miRNA反轉錄引物和反轉錄試劑購自Ambion 公司,SYBR Premix購自TaKaRa公司；主要儀器: 美國ABI公司7500實時定量PCR儀；-80℃冰箱(Thermo)；美國Beckman臺式低溫高速離心機。

2.3miR-26a的提取及反轉錄:按照北京天根生化科技有限公司的miRcute miRNA提取分離試劑盒所述步驟提取miRNA。紫外分光儀檢測RNA濃度及純度。應用美國Ambion 公司的特異性miRNA反轉錄引物并按照反轉錄試劑盒步驟合成cDNA,每個反轉錄體系中含有10 ng 的RNA模板。反轉錄的條件: 16℃ 30 min, 42℃ 30 min, 85℃ 5 min。

2.4RT-qPCR 反應條件：95℃ 15s,95℃ 10s,60℃ 30s,40個循環(huán)。采用的相對定量法計算miR-26a的相對表達量( F ),F = 2-Δct,Δct =ctmiR-26a-ctU6,其中ct為每個反應管內(nèi)的熒光信號到達設定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

結　果

1血清miR-26a 的表達水平比較 通過RT-qPCR檢測卵巢癌患者血清及健康對照血清中miR-26a 的表達情況,結果顯示卵巢癌患者血清中miR-26a的表達水平高于健康對照組(P<0.01)。

2血清miR-26a表達水平與卵巢癌患者臨床病理特征的關系血清miR-26a表達水平與臨床分期密切相關,隨著臨床進展,血清miR-26a的表達逐漸升高(P<0.05)。此外,血清miR-26a表達與卵巢癌細胞核分化程度亦密切相關,血清miR-26a在卵巢癌細胞核中/低分化組的表達顯著高于細胞核高分化組(P<0.05)。miR-26a的表達與卵巢癌其他臨床病理特征,包括年齡、組織學類型均無顯著相關性(P>0.05)。

3血清miR-26a表達水平對卵巢癌的診斷效率根據(jù)上述血清miR-26a的表達水平繪制ROC曲線。結果顯示：ROC曲線下面積0.7963,最大約登指數(shù)0.729,靈敏度84.3%,特異度88.6%,對應診斷界值3.07。

4血清miR-26a表達與卵巢癌患者生存之間的關系血清miR-26a表達與卵巢癌患者術后5年生存率密切相關,miR-26a高表達的卵巢癌患者術后5年生存率顯著低于miR-26a低表達的患者(Log-rank test:P=0.0412)。

討　論

腫瘤標志物是反映腫瘤存在或者進展的化學類物質(zhì),或不存在于正常成人組織而僅見于胚胎組織,或在腫瘤組織中的含量大大超過在正常組織里的含量。腫瘤標志物的存在或量變可以提示腫瘤的性質(zhì),借以了解腫瘤的組織發(fā)生、細胞分化、細胞功能,以幫助腫瘤的診斷、分類、預后判斷以及治療指導。理想的腫瘤標志物的特點：①敏感性高,能早期檢測出腫瘤患者；②特異性好,能準確鑒別腫瘤/非腫瘤患者；有器官特異性,方便對腫瘤的定位；③血清中水平與腫瘤體積大小、臨床分期相關,用以判斷預后；④半衰期短,可反映腫瘤的動態(tài)變化,監(jiān)測治療效果、復發(fā)和轉移測定方法精密度、準確性高,操作方便。

研究證明,miRNAs與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著極為密切的關系,利用芯片等高通量檢測技術發(fā)現(xiàn)其在腫瘤組織與正常組織之間存在顯著差異,并且具有明顯的組織特異性,更重要的是miRNAs可以在人體的血清、血漿等體液中檢測出來,為開展無創(chuàng)診斷帶來了可能[6]。Chai等[7]發(fā)現(xiàn)在肝細胞癌中miR-26a通過PI3K/Akt通路下調(diào)巨噬細胞集落刺激因子的表達抑制巨噬細胞的招募。在乳腺癌中miR-26a通過靶向作用于HMGA1分子抑制腫瘤細胞的增殖。在膽管癌細胞中ω-3多不飽和脂肪酸通過抑制miR-26a/b的表達上調(diào)15-PGDH表達,為ω-3多不飽和脂肪酸治療膽管癌提供了前期研究基礎[8]。miR-26a在多種惡性腫瘤中異常表達,并與腫瘤細胞的增殖、侵襲遷移等有關[4]。如上所述,MiR-26a促進卵巢癌的增殖及腫瘤的形成[5]。與健康對照的miRNA血清相比,卵巢癌患者血清miR-26a表達上調(diào),被認為是候選的卵巢癌新的生物標志物[6]。

我們的研究證實了卵巢癌患者血清中miR-26a表達高于健康對照組,ROC 曲線下面積0.7963,最大約登指數(shù)0.729,靈敏度84.3%,特異度88.6%,對應診斷界值3.07,提示血清中miR-26a可以作為卵巢癌診斷的分子指標；卵巢癌患者血清miR-26a表達與卵巢癌的臨床分期、病理分級呈正相關,而與年齡無顯著相關性；血清中miR-26a高表達的患者5年生存率要低于血清中miR-26a低表達患者。我們的研究為卵巢癌的臨床診斷及預后判斷提供了重要參考,具有重要的臨床應用價值。

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[4] Shen W, Song M, Liu J,etal.MiR-26a promotes ovarian cancerproliferation and tumorigenesis [J]. PLoS One, 2014, 9(1):e86871.

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(收稿：2015-06-20)

R737.31

Adoi：10.3969/j.issn.1000-7377.2015.09.073

主題詞卵巢腫瘤/診斷卵巢腫瘤/病理學預后@ miR-26a