人獸共患旋毛蟲病診斷技術(shù)的研究進(jìn)展

葉星宇

(廣元市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,四川廣元628017)

人獸共患旋毛蟲病診斷技術(shù)的研究進(jìn)展

葉星宇

(廣元市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,四川廣元628017)

旋毛蟲病是一種嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲病。旋毛蟲的檢測(cè)方法主要包括實(shí)驗(yàn)室檢測(cè),免疫學(xué)檢測(cè)和分子生物學(xué)檢測(cè)。目前,主要采用免疫學(xué)方法檢測(cè)旋毛蟲病。本文就旋毛蟲病診斷技術(shù)的研究做一綜述。

旋毛蟲病;檢測(cè)技術(shù);研究進(jìn)展

1 前言

旋毛蟲病是由旋毛形線蟲引起的一種嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲病，旋毛蟲主要寄生于豬、熊等150多種動(dòng)物及人。由于其病原傳播的復(fù)雜性，流行范圍廣，世界各地區(qū)均有發(fā)生該病的報(bào)道。旋毛蟲病不僅給畜牧食品業(yè)帶來重大的經(jīng)濟(jì)損失，而且還嚴(yán)重危害人類的健康。龐顏坤（1999）報(bào)道，1964～1997年，僅云南省人群暴發(fā)旋毛蟲病就達(dá)441次，發(fā)病20101人，死亡多達(dá)213人。因此，旋毛蟲的診斷有十分重要的意義。

2 旋毛蟲診斷技術(shù)

2.1 實(shí)驗(yàn)室診斷

2.1.1 解剖分析

旋毛蟲“目檢”法目檢法即用眼睛觀察肉樣以檢旋毛蟲，旋毛蟲幼蟲感染豬體后大約21d～7個(gè)月形成鈣化，肉眼觀察即能檢出。操作方法是：將新鮮膈肌腳撕去肌膜，肌肉縱向拉平拉緊，然后在光線較好處仔細(xì)觀察肌纖維表面，最好稍斜方向去看更易發(fā)現(xiàn)，肉眼松本時(shí)的光線以自然光源較好，檢出率高。

2.1.2 顯微鏡檢測(cè)

常用活組織壓片鏡檢、人工胃液消化分離法及動(dòng)物感染，壓片法檢。體操作方法是：選取豌豆大小的無脂肪和皮膚的肌肉組織，從每一肉樣剪取麥粒大小的肉24粒，均勻地在玻片上排放，用另一玻片壓緊在兩玻片之間，置于旋毛蟲鏡檢器或顯微鏡交視野投放到屏幕上觀察，發(fā)現(xiàn)包囊幼蟲即可確診。（消化法是肌片用胃蛋白酶和稀鹽酸消化，離心沉淀后檢查幼蟲）。

但以實(shí)驗(yàn)室診斷方法有摘取組織的局限性，在感染的早期及輕度感染者檢出率低，陽性率僅50%左右，且不易被患者接受。

2.2 免疫學(xué)診斷

2.2.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是將可溶性抗原或抗體吸附于固相載體上，利用酶標(biāo)抗體或抗原結(jié)合形成酶標(biāo)記的免疫復(fù)合物，加入相應(yīng)酶底物顯色，根據(jù)反應(yīng)液顏色判定抗原-抗體反應(yīng)情況，從而檢測(cè)抗原或抗體。經(jīng)過長(zhǎng)期實(shí)踐，實(shí)驗(yàn)技術(shù)的改進(jìn)，常規(guī)的ELISA發(fā)展為SPA—ELISA、DOT—ELISA等。黎世濤等用SPAELISA檢測(cè)旋毛蟲法所需的材料制成快速診斷試劑盒，與常規(guī)ELISA平行檢測(cè)107例旋毛蟲病人血清，陽性率分別為99.07%和97.19%；人畜血清兩法陽性率均為100%。朱名勝等用Dot-ELIST檢測(cè)旋毛蟲病患者38例和感染旋毛蟲的豚鼠40例血清，陽性率分別為97.4%和100%。

2.2.2 間接熒光抗體檢測(cè)技術(shù)（IFAT）

間接熒光抗體檢測(cè)技術(shù)是將待檢樣本（如：血液涂片、組織切片等）固定，加入一抗反應(yīng)一定時(shí)間，用pbs反復(fù)洗脫，自然干燥，再加入用熒光標(biāo)記的二抗反應(yīng)。再熒光顯微鏡下觀察，根據(jù)是否有熒光判斷結(jié)果。有熒光為陽性，無熒光為陰性。El-Shazly AM等采用IFA和ELISA檢測(cè)實(shí)驗(yàn)感染旋毛蟲鼠的IgG水平，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，IFA的敏感性和特異性分別為100%和85%，ELISA的敏感性和特異性分別為100%和93.3%。IFAT法檢測(cè)旋毛蟲病快速、有較高的敏感性和特異性，而且制備的熒光標(biāo)記抗體，可以用于多種抗原抗體系統(tǒng)的檢測(cè)。但需配備熒光鏡，使其應(yīng)用范圍受到一定的限制。

2.2.3 間接血凝試驗(yàn)（IHA）

間接血凝試驗(yàn)是指將抗原或抗體通過結(jié)合劑結(jié)合到紅細(xì)胞表面，再與相應(yīng)的抗體或抗原結(jié)合就會(huì)出現(xiàn)肉眼可見的紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。IHA診斷旋毛蟲病有較好的敏感性和特異性，而且具有操作簡(jiǎn)便，不需特殊設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，具有早期診斷價(jià)值。

2.2.4 環(huán)蚴沉淀試驗(yàn)（Slide）

將已消化好的純凈幼蟲50～100條，置玻片上消毒凡士林制成圓形小凹中，加待檢血清1滴，蓋上蓋玻片，放人潮濕方盤中，在37℃溫箱中培養(yǎng)24h，取出玻片用低倍鏡觀察，是否有幼蟲口部或肛門出現(xiàn)透明凝塊狀或泡沫狀的沉淀物附著，判定結(jié)果。王紹基等采用IHA和Slide檢測(cè)旋毛蟲病豚鼠血清，陽性率分別為100%和97.1%。用兩種方法檢測(cè)正常豚鼠血清、血吸蟲病兔血清、肺吸蟲病大白鼠血清、蛔蟲病人血清和鞭蟲病人血清，除1例肺吸蟲病大白鼠血清出現(xiàn)陽性反應(yīng)外，均為陰性。崔晶等用環(huán)蚴沉淀試驗(yàn)與IFAT進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，檢測(cè)鄭州一起旋毛蟲大暴發(fā)490名有聚餐史者及212例旋毛蟲患者血清陽性率，結(jié)果無顯著差異。Slide幼蟲沉淀物大多附在幼蟲尾部呈不太規(guī)則的透明凝塊狀，或附在幼蟲口部呈空泡狀，有些幼蟲口、尾同時(shí)附有沉淀物，隨幼蟲移動(dòng)而自然擺動(dòng)，在低倍鏡下易于觀察。

2.2.5 乳膠-磁性顆粒技術(shù)

乳膠顆粒是一種有色懸浮液（如藍(lán)色、紅色等），用旋毛蟲p49抗原致敏乳膠顆粒，用抗抗體包被磁性顆粒，利用抗原—抗體反應(yīng)使兩種顆粒與陽性抗體形成大分子結(jié)合物，在磁場(chǎng)作用下，結(jié)合物隨著磁性顆粒沉降下來，從而使溶液變清（陰性對(duì)照仍為懸浮濁液），通過目測(cè)判定結(jié)果，必要時(shí)也可用儀器檢測(cè)其清濁度。該檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便、時(shí)間短、靈敏度高、不需專用設(shè)備的快速診斷技術(shù)。宋思揚(yáng)等報(bào)道用該技術(shù)測(cè)定旋毛蟲P49抗原抗體，檢測(cè)到19份感染鼠血清、6份感染豬血清、3份旋毛蟲病豬血清、4份病人血清呈IgG抗體陽性，說明融合蛋白P49/GST的乳膠-磁性顆粒技術(shù)可用于旋毛蟲的早期診斷。

2.2.6 快速免疫層析法

快速免疫層析是在層析材料上包被相應(yīng)的抗原，采用膠體金技術(shù)將處理過的制劑吸附在試紙條上，檢測(cè)被檢血清中的相應(yīng)抗體。若抗原、抗體相對(duì)應(yīng)，則發(fā)生高特異的免疫親和反應(yīng)，免疫復(fù)合物被截留集聚在一定區(qū)域（檢測(cè)帶），通過膠體金而得到肉眼直觀的顯色帶，可判定檢測(cè)結(jié)果。采用膠體金標(biāo)記Dipstick試紙條檢測(cè)旋毛蟲病患者與旋毛蟲感染的小鼠、大鼠、兔、豬血清的陽性率分別為100%（28/28）、96.00%（48/50）、100%（10/10）、100%（10/10）及100%（30/30）；其它寄生蟲?。ㄋ故县傊澄x病、血吸蟲病、華支睪吸蟲病等）患者及正常人血清均為陰性。張?jiān)虑宓炔捎每焖倜庖邔游龇ê虴LISA法檢測(cè)旋毛蟲病患者及動(dòng)物，兩種檢測(cè)方法檢測(cè)感染旋毛蟲的感染率一致?？焖倜庖邔游龇ㄔ\斷旋毛蟲病具有較高的敏感性和特異性，簡(jiǎn)便快捷，勿須特殊儀器設(shè)備，是一種檢測(cè)旋毛蟲病血清IgG抗體和流行病學(xué)調(diào)查較好的免疫診斷方法。

此外，還有免疫酶染色試驗(yàn)（IEST）、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光酶免疫染色試驗(yàn)（ECIA）、皮內(nèi)試驗(yàn)、循環(huán)抗原（CAg）檢測(cè)、淋巴細(xì)胞雜交瘤和單克降抗體（McAb）技術(shù)等。雖然旋毛蟲的免疫學(xué)檢測(cè)方法很多，由于旋毛蟲蟲體抗原的結(jié)構(gòu)極其復(fù)雜，且在其長(zhǎng)期的寄生生活中，逐漸形成了各種各樣的免疫逃避手段，采用成分復(fù)雜的蟲體抗原往往難以取得理想的診斷、預(yù)防和治療效果。

3 分子生物學(xué)診斷

3.1 多重PCR技術(shù)（multiplex PCR）

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是20世紀(jì)80年代中期發(fā)展起來的一種在體外迅速大量擴(kuò)增特異性DNA的新技術(shù)，它具有高度的靈敏性和特異性。Caballero-Garcia ML等用PCR方法對(duì)實(shí)驗(yàn)感染小鼠進(jìn)行旋毛蟲病早期診斷，結(jié)果最早在感染后第3天檢測(cè)到旋毛蟲DNA，在第3～17d，33只實(shí)驗(yàn)鼠血樣中均檢測(cè)到旋毛蟲DNA。張國(guó)華等根據(jù)旋毛蟲幼蟲基因序列設(shè)計(jì)合成引物，采用PCR檢測(cè)感染幼蟲及健康幼蟲，可檢測(cè)0.01條幼蟲產(chǎn)物。

多重PCR敏感性和特異性都相對(duì)較高，可鑒別分子差異不明顯的蟲種。由于可在同一PCR反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)對(duì)多個(gè)目的基因進(jìn)行分型，多重PCR還具有系統(tǒng)、經(jīng)濟(jì)及簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，尤其適合于大量標(biāo)本鑒定。近年來此方法廣泛應(yīng)用于旋毛蟲的流行病學(xué)調(diào)查及蟲種分類，是旋毛蟲分類學(xué)及流行病學(xué)分離鑒定中十分有用的工具。

3.2 構(gòu)建旋毛蟲cDNA文庫

近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者把視線放在基因工程抗原上，通過構(gòu)建cDNA文庫，篩選理想的抗原，預(yù)測(cè)其抗原表位。探索應(yīng)用旋毛蟲重組抗原進(jìn)行快速廣普旋毛蟲檢測(cè)的新方法。

在眾多的旋毛蟲抗原中，旋毛蟲的排泄分泌（ES）抗原可直接刺激宿主的免疫系統(tǒng)，是誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答的主要靶抗原。因此，旋毛蟲ES抗原作為診斷抗原比較理想。Zaflenga等（1989）用從旋毛蟲肌幼蟲分離的多聚腺苷酸mRNA構(gòu)建了cDNA（互補(bǔ)DNA）表達(dá)文庫，篩選出ES中53KD；Sugane等將獲得的T·spiralismRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA表達(dá)文庫，從而篩選出ES中45～46KDa蛋白的結(jié)構(gòu)基因，基因陽性克隆表達(dá)，經(jīng)檢測(cè)表明能與旋毛蟲病陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)；原麗紅等利用p46ku抗原基因的原核表達(dá)重組蛋白WN10免疫小鼠，可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的抗旋毛蟲保護(hù)性免疫；牛廷獻(xiàn)等以從旋毛蟲新生幼蟲cDNA文庫中篩選獲得的T668基因表達(dá)的重組蛋白為抗原，對(duì)小鼠的保護(hù)性作用進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示T668重組抗原具有一定的免疫保護(hù)作用，且可激發(fā)特異性體液免疫，為旋毛蟲病的防治提供了新的免疫原。劉明遠(yuǎn)等已成功地構(gòu)建了中國(guó)豬旋毛蟲和犬旋毛蟲（T.nativa）分離株的成蟲及新生幼蟲混合文庫。Chung等構(gòu)建了偽旋毛蟲（T.pseudospiralis）DNA文庫，表達(dá)了一種23kDa的β-半乳糖苷酶-融合蛋白，免疫細(xì)胞定位表明抗該融合蛋白的血清只能識(shí)別偽旋毛蟲，提示該融合蛋白可作為偽旋毛蟲病鑒別診斷的一種特異性抗原。NaganoI等用旋毛蟲感染血清從旋毛蟲肌幼蟲cDNA文庫免疫篩選到絲氨酸蛋白酶抑制劑基因和絲氨酸蛋白酶基因。

4 小結(jié)

旋毛蟲病是一種嚴(yán)重的人獸共患病，威脅人類健康，且對(duì)農(nóng)牧養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此快速診斷疾病，對(duì)于治療和預(yù)防具有十分重要的意義。目前旋毛蟲病得診斷主要是依靠免疫學(xué)診斷，近年來，旋毛蟲抗原特別是ES抗原的研究，cDNA表達(dá)庫的建立等，從分子水平上尋找診斷與控制旋毛蟲病的措施奠定了基礎(chǔ)，為基因疫苗的研究也奠定了基礎(chǔ)。

[1]崔晶，王中全，晉雪香，等.鄭州市一起旋毛蟲病大暴發(fā)的流行病學(xué)調(diào)查及臨床觀察[J].中國(guó)人獸共患病雜志，1997，13（2）：65.

[2]鄭繼昌，李治深.旋毛蟲血清學(xué)診斷研究進(jìn)展[J].中國(guó)獸醫(yī)寄生蟲病，2003，（10）：38-43.