Livin、VEGF在骨肉瘤組織中的表達(dá)及預(yù)后的關(guān)系

張黎明

骨肉瘤是好發(fā)于青少年的最常見骨惡性腫瘤，侵襲性強(qiáng)，易發(fā)生早期肺轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致患者病情進(jìn)展迅速，預(yù)后差［1］。研究顯示，凋亡抑制蛋白Livin在骨肉瘤等多種惡性腫瘤組織高表達(dá)，不僅參與腫瘤的增殖和凋亡進(jìn)程，而且與腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移及對(duì)化療藥物的敏感性密切相關(guān)［2］。然而，關(guān)于 Livin及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)在骨肉瘤組織表達(dá)的相關(guān)性及與腫瘤轉(zhuǎn)移、預(yù)后的關(guān)系目前筆者尚未見明確報(bào)道。本研究通過檢測(cè)骨肉瘤組織Livin、VEGF的表達(dá)及與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，分析二者表達(dá)的相關(guān)性，探討其在骨肉瘤轉(zhuǎn)移及預(yù)后中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院2011年10月至2013年10月經(jīng)手術(shù)切除的骨肉瘤組織蠟塊標(biāo)本58例，術(shù)前均未接收任何放化療，經(jīng)臨床﹑影像﹑病理確診為骨肉瘤，臨床病理資料完整。其中男32例，女26例;年齡8～46歲，中位年齡19.4歲。Dahlin病理分型:骨母細(xì)胞型20例，纖維母細(xì)胞型22例，軟骨母細(xì)胞型16例;腫瘤部位:股骨20例，脛腓骨18例，肱骨10例，其他部位10例。Enneking臨床分期:ⅠA期0例，ⅠB期4例，ⅡA期11例，ⅡB期28例，Ⅲ期15例;有軟組織浸潤(rùn)40例，無(wú)軟組織浸潤(rùn)18例;有肺轉(zhuǎn)移48例，無(wú)肺轉(zhuǎn)移10例。另選取同期骨軟骨瘤組織標(biāo)本35例作為對(duì)照，其中男19例，女16例;年齡11～49歲，中位年齡22.3 歲。

1.2 主要試劑 兔抗人Livin單克隆抗體、鼠抗人VEGF單克隆抗體購(gòu)自 Santa Cruz公司。Trizol、RTPCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司。免疫組化SP試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 RT-PCR:采用 RT-PCR 技術(shù)檢測(cè) Livin、VEGF mRNA表達(dá)，Trizol提取組織總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA純度和濃度。取1 μg總RNA用RT-PCR試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此為模板進(jìn)行后續(xù)PCR擴(kuò)增。PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。擴(kuò)增完畢后取5 μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析儀對(duì)條帶進(jìn)行掃描分析，以目的基因與β-actin灰度值的比值來(lái)反映目的基因mRNA表達(dá)水平。見表1。

表1 Livin、VEGF、β-actin 引物序列

1.3.2 免疫組織化學(xué)SP法:采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)Livin、VEGF蛋白表達(dá)，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。具體步驟如下:用10%甲醛固定標(biāo)本，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，常規(guī)二甲苯脫蠟至水，PBS漂洗5 min×3次，EDTA抗原修復(fù)，室溫冷卻以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS漂洗5 min×3次，正常山羊血清室溫封閉15 min，滴加一抗，4℃過夜，PBS漂洗5 min×3次，滴加二抗，37℃孵育 30 min，PBS漂洗5 min×3次，滴加辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，37℃孵育5 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片。用已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。光鏡下觀察標(biāo)本染色情況，對(duì)圖像光密度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 判定標(biāo)準(zhǔn) Livin、VEGF陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn):胞漿內(nèi)檢出淺黃、棕黃或棕褐色顆粒。每張切片由兩名病理醫(yī)師隨機(jī)選取5個(gè)有代表性的視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，若陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占比例＞20%即為陽(yáng)性。根據(jù)其陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占百分比及染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分并求均值。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占百分比:1% ～25% 為1分，26% ～50%為2分，51% ～75% 為3分，76% ～100%為4分;染色強(qiáng)度的深淺積分:無(wú)染色為0分，弱陽(yáng)性為1分，強(qiáng)陽(yáng)性為2分。然后按照陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占百分比積分×染色強(qiáng)度的深淺積分，1～2為陰性，3～8為陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性比較采用Spearman等級(jí)相關(guān)性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨肉瘤和骨軟骨瘤組織Livin、VEGF mRNA的表達(dá)情況 RT-PCR結(jié)果顯示，在骨肉瘤和骨軟骨瘤組織中，Livin mRNA 表達(dá)水平分別為(2.98±0.21)、(1.77 ±0.12)，VEGF mRNA 表達(dá)水平分別為(3.76 ±0.35)、(1.89 ±0.15)，Livin、VEGF mRNA 在骨肉瘤組織的表達(dá)水平顯著高于骨軟骨瘤組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表2 骨肉瘤和骨軟骨瘤組織Livin、VEGF mRNA的表達(dá)情況 ±s

表2 骨肉瘤和骨軟骨瘤組織Livin、VEGF mRNA的表達(dá)情況 ±s

注:與骨肉瘤組織比較，*P ＜0.05

類別 Livin mRNA相對(duì)表達(dá)水平VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)水平骨肉瘤組織(n=58)2.98 ±0.21 3.76 ±0.35骨軟骨瘤組織(n=35) 1.77 ±0.12* 1.89 ±0.15*

2.2 骨肉瘤和骨軟骨瘤組織Livin、VEGF蛋白的表達(dá)情況 免疫組化結(jié)果顯示，Livin、VEGF蛋白主要定位于胞漿中，呈淺黃、棕黃或棕褐色顆粒。在骨肉瘤和骨軟骨瘤組織中，Livin蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為60.3%(35/58)、17.1%(6/35)，平均光密度值分別為(0.54±0.03)、(0.05 ±0.01);VEGF 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為 81.0%(47/58)、22.9%(8/35)，平均光密度值分別為(0.72 ±0.04)、(0.06 ±0.02)。Livin、VEGF 蛋白在骨肉瘤組織的陽(yáng)性表達(dá)率和表達(dá)水平均顯著高于骨軟骨瘤組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表3，圖1。

表3 骨肉瘤和骨軟骨瘤組織Livin、VEGF蛋白的表達(dá)情況例(%)

圖1 Livin、VEGF在骨肉瘤和骨軟骨瘤組織的表達(dá)(SP×400)

2.3 骨肉瘤組織Livin、VEGF蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 Livin、VEGF蛋白在骨肉瘤組織的表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤大小、病理分型、Enneking分期無(wú)關(guān)(P＞0.05)。而與腫瘤軟組織浸潤(rùn)、肺轉(zhuǎn)移有關(guān)(均P＜0.05)，Livin、VEGF在軟組織浸潤(rùn)組和無(wú)浸潤(rùn)組的陽(yáng)性表達(dá)率分別 72.5%和 38.9%、90.0%和55.6%;Livin、VEGF在肺轉(zhuǎn)移組和無(wú)轉(zhuǎn)移組的陽(yáng)性表達(dá)率分別 75.0% 和 40.0%、91.7% 和 50.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)。見表4。

表4 Livin、VEGF蛋白表達(dá)與骨肉瘤臨床病理特征的關(guān)系例(%)

2.4 骨肉瘤組織Livin、VEGF蛋白表達(dá)的相關(guān)性 58例骨肉瘤組織中，Livin、VEGF均陽(yáng)性表達(dá)者24例(41.38%)，Livin陽(yáng)性表達(dá)且VEGF陰性表達(dá)者11例(18.97%)，Livin陰性表達(dá)且VEGF陽(yáng)性表達(dá)者8例(13.79%)。相關(guān)分析顯示，Livin、VEGF表達(dá)呈明顯正相關(guān)(r=0.822，P=0.001)。見表5。

表5 Livin、VEGF蛋白在骨肉瘤組織表達(dá)的相關(guān)性 例

2.5 生存分析 對(duì)58例骨肉瘤患者追蹤隨訪發(fā)現(xiàn)，35例Livin蛋白表達(dá)陽(yáng)性組3年存活率為42.9%(15/35)，平均生存時(shí)間為(29.5 ±5.21)個(gè)月，23 例陰性組存活率為69.6%(16/23)，平均生存時(shí)間為(42.3±5.52)個(gè)月;47例VEGF蛋白表達(dá)陽(yáng)性組3年存活率為38.3%(18/47)，平均生存時(shí)間為(27.2 ±5.17)個(gè)月，11例表達(dá)陰性組存活率為72.7%(8/11)，平均生存時(shí)間為(44.8 ±5.45)個(gè)月，Livin、VEGF 蛋白表達(dá)與患者生存期密切相關(guān)(P＜0.05)。

3 討論

骨肉瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移是涉及多基因、多步驟參與的復(fù)雜過程，包括腫瘤細(xì)胞的異常增殖、新生血管形成、細(xì)胞外基質(zhì)成分的降解及腫瘤細(xì)胞的遷移等。Livin是凋亡抑制蛋白(IAP)家族的重要成員，是具有抗凋亡作用的重要分子。其抗凋亡機(jī)制主要有Caspases依賴途徑和非Caspases依賴途徑:Livin可與Caspases-3和Caspases-7結(jié)合抑制其活性，阻斷Caspases信號(hào)傳導(dǎo)通路從而產(chǎn)生抗凋亡作用［3］;另外，Livin與TAB1結(jié)合后能夠活化TAK1，進(jìn)而激活JNK1，通過TAK1/JNK1途徑介導(dǎo)抗凋亡作用。研究顯示，Livin在正常組織細(xì)胞不表達(dá)或低表達(dá)，而在結(jié)直腸癌、胃癌、膀胱癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞特異性高表達(dá)，參與腫瘤細(xì)胞的異常增殖，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［4，5］。Li等［6］研究發(fā)現(xiàn)Livin在骨肉瘤細(xì)胞系中過表達(dá)，采用RNA干擾技術(shù)下調(diào)Livin表達(dá)能夠抑制腫瘤細(xì)胞的異常增殖﹑侵襲并增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。因此，Livin可作為骨肉瘤的一個(gè)潛在治療靶點(diǎn)。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是腫瘤血管形成中的關(guān)鍵因子，其通過自分泌或旁分泌的方式具有增加血管通透性、促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、血漿蛋白外滲及間充質(zhì)干細(xì)胞的浸潤(rùn)等作用，這為腫瘤組織提供了豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并為腫瘤細(xì)胞侵入脈管系統(tǒng)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了良好條件［7］。研究顯示，VEGF在胃癌、膀胱癌等多種惡性腫瘤組織異常高表達(dá)，參與腫瘤細(xì)胞的抗凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移過程［8，9］。Charity 等［10］研究發(fā)現(xiàn)骨肉瘤患者血清VEGF水平與預(yù)后密切相關(guān)，VEFG高表達(dá)表明腫瘤新生血管較多，提示患者預(yù)后不良。

本研究采用RT-PCR和免疫組化法檢測(cè)骨肉瘤組織Livin、VEGF mRNA和蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示，Livin、VEGF在骨肉瘤組織的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于骨軟骨瘤組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)合Livin、VEGF表達(dá)與骨肉瘤臨床病理特征的關(guān)系，我們發(fā)現(xiàn)有軟組織浸潤(rùn)和肺轉(zhuǎn)移的患者Livin、VEGF陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于無(wú)浸潤(rùn)和無(wú)轉(zhuǎn)移者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示 Livin、VEGF的陽(yáng)性表達(dá)與骨肉瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移能力有關(guān)。我們推測(cè)異常高表達(dá)的Livin、VEGF可能通過某種信號(hào)機(jī)制對(duì)惡變細(xì)胞的凋亡進(jìn)程產(chǎn)生抑制作用，從而使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生免疫逃逸。此外，Livin、VEGF蛋白陽(yáng)性患者3年生存率顯著低于陰性患者，提示Livin、VEGF表達(dá)陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞增殖能力和侵襲性強(qiáng)、更易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，預(yù)后差。因此，Livin、VEGF可作為判斷骨肉瘤復(fù)發(fā)、早期轉(zhuǎn)移及預(yù)后的分子標(biāo)志物。

相關(guān)性分析顯示，骨肉瘤組織Livin、VEGF蛋白表達(dá)趨勢(shì)一致，這與Chen等［11］在食管癌組織的報(bào)道一致，提示二者共表達(dá)在腫瘤侵潤(rùn)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮協(xié)同作用。謝楚海等［12］研究發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤組織Livin表達(dá)與腫瘤微血管密度值(MVD)呈正相關(guān)，作者認(rèn)為L(zhǎng)ivin可能直接或間接促進(jìn)VEGF的表達(dá)及活性，二者共同參與腫瘤新生血管生成。Yan等［13］研究了HeLa細(xì)胞或SK-MEL-28細(xì)胞中調(diào)控Livin表達(dá)的分子機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)刺激VEGF表達(dá)通過mTOR/4E-BP1信號(hào)途徑最終導(dǎo)致Livin蛋白表達(dá)增加。因此，我們推測(cè)骨肉瘤組織Livin、VEGF表達(dá)可能存在相互促進(jìn)作用，確切機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

綜上所述，Livin、VEGF表達(dá)與骨肉瘤患者的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)，聯(lián)合檢測(cè)骨肉瘤組織Livin、VEGF表達(dá)水平能夠?yàn)榕R床診治骨肉瘤及評(píng)估患者預(yù)后提供重要參考價(jià)值。隨著腫瘤生物治療技術(shù)的發(fā)展，采用小干擾 RNA或特異性抑制劑下調(diào) Livin、VEGF的表達(dá)有可能抑制腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程，并改善患者預(yù)后，這有望成為預(yù)防或治療骨肉瘤的一個(gè)新的研究方向。

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