促生菌的分離鑒定及其對柳枝稷種子在鹽脅迫下的萌發(fā)促進(jìn)作用

馬曉敏，張紅娟，顧沐宇，歸 靜，高 偉，王佺珍

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，陜西楊陵712100）

隨著工業(yè)化的發(fā)展和不可再生資源的過度利用，石油能源在不久的將來便會面臨枯竭的危險，并且石油燃料的燃燒也帶來了大氣污染、全球氣候變暖等一系列的環(huán)境問題，人類即將面臨能源危機和大氣污染的雙重挑戰(zhàn)，而能源植物以其資源的豐富性、可再生性、環(huán)境友好性和碳零排放等優(yōu)點必將成為一種重要的替代能源。在各種能源植物中，柳枝稷因其抗逆性強，肥料需求少，生產(chǎn)成本低，適應(yīng)性廣，低灰分，纖維素含量高等優(yōu)點成為了目前能源植物研究的熱點。另外較長時間的研究實踐表明，其對我國的各地水文氣候有較強的適應(yīng)性，進(jìn)一步發(fā)展不僅可以保障能源安全，改善生態(tài)環(huán)境，如在水土流失嚴(yán)重的黃土高原區(qū)，種植柳枝稷改良了當(dāng)?shù)氐纳?，具有生態(tài)效益，因此，近些年我國政府加大了對能源作物的研究開發(fā)。

植物的生長受到很多非生物因素的限制，土壤鹽漬化是干旱和半干旱地區(qū)農(nóng)作物產(chǎn)量降低的主要原因之一［1］。目前，全球范圍超過50%的灌溉土地和20%的可耕作土地受到鹽漬化的影響［2］，每年世界上由于土壤鹽漬化而喪失的可耕作土地高達(dá)25～50萬hm2，尤其是在一些干旱和半干旱地區(qū)［3］。因此提高農(nóng)作物的耐鹽性，培育耐鹽作物，開發(fā)利用鹽堿地成為未來農(nóng)業(yè)發(fā)展的一個重要方向，并上升為我國西部農(nóng)業(yè)發(fā)展的重大課題［4］。植物根際促生菌（Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）是指定殖于植物根際系統(tǒng)，并能促進(jìn)植物生長的一類細(xì)菌的總稱，這些促生菌通過一些機制來促進(jìn)植物生長并提高植物的抗逆性，例如，分泌嗜鐵素和各種激素，溶磷性和固氮性［5］。另外，PGPR可以在分子水平上通過分泌一些酶來調(diào)節(jié)植物生理，促進(jìn)植物生長，具有ACC脫氨酶的內(nèi)生菌是一種重要PGPR［6］。ACC是乙烯的前體，高水平的乙烯會阻礙植物根系的延長和生長，進(jìn)而影響植物的生長和發(fā)育［7］。該酶可以催化乙烯的關(guān)鍵中間前體ACC轉(zhuǎn)化成α－酮丁酸和氨，從而影響植物生長時的乙烯水平，因而利用這類PGPR可能有助于提高植物的耐鹽性［8－9］。具有ACC脫氨酶活性的促生菌已經(jīng)在很多在植物上進(jìn)行了研究，如小麥、玉米、西紅柿、油菜［10－13］，可是目前在能源草柳枝稷上還沒有報道。本文從柳枝稷根莖中分離PGPR，并評價這些PGPR對柳枝稷種子在鹽脅迫下的促生作用，為利用植物促生菌改善和提高鹽脅迫條件下柳枝稷的生長，以及促進(jìn)其在鹽漬化地區(qū)的可持續(xù)生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 PGPRs分離于柳枝稷（Panicum virgatumL.）根莖，柳枝稷（品種Blackwell）生長于西北農(nóng)林科技大學(xué)草業(yè)科學(xué)實驗地。實驗所用柳枝稷種子來自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)。

1.1.2 主要試劑和儀器 ACC（A－3903）購自三力試劑公司；用于PCR擴增的全套試劑購自天根生化公司；實驗中其他試劑均AR級國產(chǎn)。種子培養(yǎng)箱SPX－100B－Z；超凈操作臺SW－CJ－1D；電導(dǎo)率儀DDS－307；PCR儀器T100。16SrDNA序列測定由天根生化公司完成。

1.1.3 培養(yǎng)基 PAF培養(yǎng)基（每升）：蛋白胨10g，絡(luò)蛋白水解物10g，MgSO41.5g，K2HPO41.5g，pH 7.2；DF鹽培養(yǎng)基（每升）：KH2PO44.0g，NaHPO46.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，葡萄糖2.0g，葡萄糖酸2.0g，檸檬酸2.0g，（NH4）2SO42.0g，pH 7.1－7.5；加富培養(yǎng)基（DFa）：ACC溶于超純水后抽濾滅菌，加到不含有（NH4）2SO4且預(yù)先滅菌的D F鹽培養(yǎng)基中，ACC終濃度為3.0mmol· L－1；TSB培養(yǎng)基：胰蛋白胨17g，大豆蛋白胨3g，葡萄糖2.5g，NaCl 5g，H2PO42.5g，pH 7.1～7.5。

1.2 方 法

1.2.1 ACC脫氨酶活性菌株的制備 參照Zhang［14］的方法，取柳枝稷根莖5g，研磨后取濾液1mL于50mL PAF液體培養(yǎng)基中，在28℃下200 r·min－1振蕩培養(yǎng)24h。重復(fù)轉(zhuǎn)接1次后，吸取1 mL懸浮液至50mL DF培養(yǎng)液中，相同條件下培養(yǎng)24h。然后吸取1mL懸浮液至DFa培養(yǎng)基中，進(jìn)行ACC脫氨酶活性菌株的篩選。如此轉(zhuǎn)接3次后，用接種環(huán)蘸取少量富集培養(yǎng)液，在分離純化培養(yǎng)基平板上劃線分離、28℃培養(yǎng)，待平板上出現(xiàn)單菌落后，挑取單菌落轉(zhuǎn)接至TSB固體分離純化斜面培養(yǎng)基上，選擇連續(xù)接種、傳代3次，保存在固體TSB培養(yǎng)基上于－20℃保存生長，進(jìn)行下一步研究。

1.2.2 分離菌株鑒定 分離的菌株進(jìn)行16SrDNA基因測序。16SrDNA通過菌落PCR獲得，引物使用細(xì)菌通用引物27f（5′－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3′）和1492r（5′－TACGGCTACCTTGTTACGACTT－3′）。PCR反應(yīng)體系（The 70－μL）：35 μL of 2x反應(yīng)混合物［0.1unit Taq聚合酶／μL，0.5 mmol·L－1dNTP，20mmol·L－1Tris－HCl（pH 8.3），100mmol·L－1KCl，3mmol·L－1MgCl2］，10μmol·L－1的引物2.8μL，0.56μL 2.5xTaq DNA聚合酶，28.84μL無菌水，2μL菌液。PCR程序為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性0.5min，54℃退火0.5min，72℃延伸5min，35個循環(huán)；72℃延伸。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。經(jīng)過純化的PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測序。通過BLAST軟件對測定16S rDNA基因序列進(jìn)行同源性比較，選取相似性較高的序列，并向GenBank提交獲得序列號。

1.2.3 ACC脫氨酶和IAA活性測定 ACC脫氨酶活性測定Donna M［15］的方法進(jìn)行，ACC脫氨酶在利用ACC的時候會產(chǎn)生α－丁酮酸，在540nm下測量處測定光吸收值，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出α－丁酮酸的濃度。IAA活性測定按照sheng［16］的方法進(jìn)行一些調(diào)整來測定，供試菌株先在DF培養(yǎng)液中培養(yǎng)2d，再定量轉(zhuǎn)入添加不同濃度色氨酸（L－Trp）的DF培養(yǎng)液（含0、50、100、200和500μg L－Trp ·mL－1）中繼續(xù)培養(yǎng)2d，取樣測菌液OD600，其余培養(yǎng)液室溫下8 000g離心，取500μL上清液，添加2mL Salkowski試劑（含150mL H2SO4、250mL ddH2O和0.5mL 0.5mol／L FeCl3），室溫培養(yǎng)20min后，在535nm處測吸光值（OD535）。IAA含量單位為μg·（mL·OD600）－1，IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線平行3次。

1.2.4 在鹽脅迫條件下促生菌對茄子種子和形態(tài)、生理指標(biāo)的影響 挑選大小一致飽滿無病害的柳枝稷種子，用70%乙醇處理1min，用無菌水洗凈；再用1%NaCl處理10min，用無菌水洗凈，將種子分為4組，處理組3組用前面分離的，Pseudomonas sp.（P）菌，Rhizobiumsp.（R）菌或Pseudomonas sp.＋Rhizobiumsp.（P＋R）混菌處理1h（用滅菌的0.03mmol·L－1MgSO4重懸浮，OD600＝0.5）對照組只用0.03mmol·L－1MgSO4處理相同時間作為對照。在培養(yǎng)皿（直徑9cm）中進(jìn)行不同濃度梯度的NaCl脅迫試驗。供試NaCl濃度分別為：0mmol，50mmol，100mmol，150mmol，200mmol，250mmol每1個梯度設(shè)3組重復(fù)。每個培養(yǎng)皿播種50粒種子，每個處理中一次性加入某一濃度的NaCl溶液8mL，28℃種子培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以后每天稱重補水，每天統(tǒng)計發(fā)芽數(shù)。發(fā)芽第14d每個培養(yǎng)皿選取10株幼苗測定根長、芽長（N＝3＊10）（發(fā)芽不足10株的測定所有發(fā)芽的根長和芽長）和相對電導(dǎo)率，并計算發(fā)芽率，發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，并用Duncan法進(jìn)行多重比較，用Excel 2010進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離和篩選

本試驗得到兩個菌株Rhizobiumsp.（R），Pseudomonas sp.（P）。在GenBank獲得注冊序列號分別為KM269075和KJ698416。

2.2 菌株的ACC脫氨酶活性和IAA活性

P菌的ACC脫氨酶和IAA活性分別為895± 35nmol（α－丁酮酸／蛋白mg／h），22.5±1.6μg mL－1。R菌沒有ACC脫氨酶活性，IAA活性為11.3±0.5μg mL－1。

2.3 不同濃度的NaCl鹽脅迫條件下促生菌對柳枝稷種子萌發(fā)和幼苗生長的影響

2.3.1 不同濃度的NaCl鹽脅迫條件下促生菌對柳枝稷種子發(fā)芽率影響 圖1顯示，隨著NaCl鹽濃度的升高，各處理組的發(fā)芽率都下降。0mmol和50mmol鹽濃度處理下，處理組和對照組的發(fā)芽率沒有顯著差異，100mmol NaCl鹽脅迫下，接種R菌的發(fā)芽率顯著高于無菌的發(fā)芽率，但與接種P菌和混合菌的處理組沒有顯著差異。150mmol和250mmol NaCl脅迫下，處理組的發(fā)芽率均顯著高于對照組的發(fā)芽率。200mmol NaCl脅迫下，接種R菌和混合菌的發(fā)芽率顯著高于無菌的發(fā)芽率。

圖1 不同濃度NaCl鹽脅迫條件下接菌和不接菌對柳枝稷種子發(fā)芽率的影響Fig.1 Effect of inoculation on germination rate of switchgrass under NaCl salt stress

2.3.2 不同濃度的NaCl鹽脅迫條件下促生菌對柳枝稷種子發(fā)芽勢的影響 圖2顯示，隨著NaCl濃度的升高，4組處理的發(fā)芽勢都降低。0～100 mmol NaCl下，處理組和對照組的發(fā)芽勢沒有顯著差異，150～250mmol NaCl脅迫下，R和P菌處理組種子發(fā)芽勢顯著高于無菌處理組的發(fā)芽勢。

2.3.3 不同濃度的NaCl鹽脅迫條件下促生菌對柳枝稷種子發(fā)芽指數(shù)的影響 圖3顯示，隨著NaCl濃度的升高，各組的發(fā)芽指數(shù)都下降。0～100mmol NaCl脅迫下，各組柳枝稷種子的發(fā)芽指數(shù)沒有顯著差異。但是，150～250mmol NaCl脅迫下，接種P菌，R菌和混合菌的發(fā)芽指數(shù)都要顯著高于無菌的發(fā)芽指數(shù)。

圖2 不同濃度NaCl鹽脅迫條件下接菌和不接菌對柳枝稷種子發(fā)芽勢影響Fig.2 Effect of inoculation on tgerminability of switchgrass under NaCl salt stress

圖3 不同濃度NaCl鹽脅迫條件下接菌和不接菌對柳枝稷種子發(fā)芽指數(shù)影響Fig.3 Effect of inoculation on germination index of switchgrass under NaCl salt stress

2.3.4 不同濃度的NaCl鹽脅迫條件下促生菌對柳枝稷種子胚根生長的影響 圖4顯示，各處理組中，50mmol NaCl處理下，胚根長度有升高的趨勢。100～250mmol NaCl處理下，隨著NaCl濃度的升高，胚根長度下降。0mmol和50mmol，100mmol，250mmol NaCl脅迫下，接種P菌組的胚根長度顯著高于不接菌組的。200mmol NaCl脅迫下，所有接菌組的胚根長度顯著高于不接菌的。

2.3.5 不同濃度的NaCl鹽脅迫條件下促生菌對柳枝稷種子胚芽生長的影響 圖5顯示，隨之NaCl鹽濃度的升高，各組的胚芽長度均下降。0mmol NaCl下，混合菌處理組的胚芽長度顯著高于無菌和R菌的胚芽長度，50mmol NaCl下，P菌和混菌處理組的胚芽長度顯著高于無菌組的，150mmolNaCl下，R菌處理組的胚芽長度顯著高于無菌組的，200mmol NaCl下，接菌組的胚芽長度均高于無菌組的，250mmol NaCl下，P菌的胚芽長度顯著高于其他組的。

2.3.6 不同濃度的NaCl鹽脅迫條件下促生菌對柳枝稷幼苗相對電導(dǎo)率的影響 圖6顯示，隨之NaCl濃度的升高，各組的相對電導(dǎo)率均上升，0mmol和50mmol NaCl脅迫下下，各組的相對電導(dǎo)率沒有顯著差異，100mmol NaCl脅迫下，無菌組的相對電導(dǎo)率顯著高于R菌和混合菌組的，150～250mmol NaCl脅迫下無菌組的相對電導(dǎo)率顯著高于其他接菌的相對電導(dǎo)率。

圖4 不同濃度NaCl鹽脅迫條件下接菌和不接菌對柳枝稷種子胚根的影響Fig.4 Effect of inoculation on radicle of switchgrass under NaCl salt stress

圖5 不同濃度NaCl鹽脅迫條件下接菌和不接菌對柳枝稷種子胚芽的影響Fig.5 Effect of inoculation on plumule of switchgrass under NaCl salt stress

圖6 不同濃度NaCl鹽脅迫條件下接菌和不接菌對柳枝稷幼苗相對電導(dǎo)率的影響Fig.6 Effect of inoculation on relative electrical conductivity of switchgrass seedlings under NaCl salt stress

3 討 論

本研究首次從柳枝稷根莖中分離具有ACC脫氨酶活性的促生菌：P、R，并向GenBank獲得注冊序列號。菌株P(guān)和R能在以ACC為唯一氮源的培養(yǎng)基上生長，且P菌具有較高的ACC脫氨酶活性和IAA活性；R菌雖然沒有ACC脫氨酶活性，但是R菌是根瘤菌具有固氮性。P菌和R菌能促進(jìn)柳枝稷在NaCl鹽脅迫的種子萌發(fā)，尤其是高濃度鹽脅迫下的萌發(fā)，提高了種子的發(fā)芽率，發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)，說明P、R菌不但可以在0～250mmol·L－1NaCl下存活，而且可以促進(jìn)柳枝稷種子的萌發(fā)、提高發(fā)芽的整齊度和種子活力。另外，接菌處理組幼苗的胚根長和胚芽長顯著高于對照組幼苗的胚根和胚芽長，特別是在高濃度NaCl脅迫下。表明促進(jìn)菌P、R和他們的混合菌可以緩解NaCl鹽脅迫，促進(jìn)柳枝稷幼苗的生長。植株相對電導(dǎo)率（REC）是衡量植株狀態(tài)的重要生理指標(biāo)。隨之鹽濃度的升高，幼苗具有的相對電導(dǎo)率升高，植物受損。同等NaCl鹽濃度下特別是高鹽濃度下，接菌的幼苗的相對電導(dǎo)率要顯著低于無菌幼苗的相對電導(dǎo)率，表明同等鹽濃度下，接種促生菌的幼苗受到的脅迫小，促生菌具有緩解和抵消NaCl鹽脅迫的作用。

高濃度的NaCl通過離子毒害，水分脅迫和養(yǎng)分不平衡給植物生長發(fā)育造成的脅迫［17］。植物在NaCl鹽脅迫下會產(chǎn)生大量的乙烯，乙烯是一種植物調(diào)節(jié)激素，低濃度的乙烯可以促進(jìn)植物生長，高度濃度的乙烯可以抑制植物的生長［18］。具有ACC脫氨酶的促生菌可以催化乙烯的前體ACC，把ACC轉(zhuǎn)化成α－酮丁酸和氨，從而降低植物在NaCl鹽脅迫下的乙烯水平，減少乙烯對植物生長的危害。IAA也是一種植物激素，具有促進(jìn)細(xì)胞生長和分化的作用，另外還能減緩高濃度乙烯對根造成的抑制作用［19－20］。當(dāng)將促生根際菌定植到種皮或是植物根系時，會合成并分泌IAA（生長素），新合成的IAA將會被植物體吸收形成內(nèi)源生長素，從而刺激植物細(xì)胞的分裂與延長。與此同時，IAA會激發(fā)ACC合成酶的活性，將S－腺營酸轉(zhuǎn)化成1－氨基環(huán)丙烷1－梭酸。Penrose研究表明，用ACC脫氨酶活性菌處理植物的種子可以降低2～4倍的乙烯含量［21］。產(chǎn)生固氮酶的PGPR可將空氣中的二氧化氮固定成為有機氮，被植物和微生物使用促進(jìn)作物生長。本實驗中分離的P菌既具有ACC脫氨酶活性，又具有IAA活性，R菌雖然沒有ACC脫氨酶活性但具有固氮酶活性，可以在只含有ACC為唯一氮源的培養(yǎng)基中生長，而且R菌具有IAA活性，因此可以提高柳枝稷種子在NaCl鹽脅迫下的抗性。P菌、R菌及其兩者的混合菌通過ACC脫氨活性、IAA活性、兩者之間的相互作用，促進(jìn)柳枝稷種子在NaCl鹽脅迫下的種子萌發(fā)和幼苗生長。

4 結(jié) 論

研究結(jié)果表明，促生菌P、R、P＋R處理的柳枝稷的種子，可以提高種子在NaCl鹽脅迫的萌發(fā)，促進(jìn)幼苗的生長，緩解鹽脅迫對植物的毒害作用，從而增強植物對鹽脅迫的抗性。本研究為提高和擴大柳枝稷在鹽漬化土地柳枝稷的建植提供了新的思路和方法。

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