肝臟蛋白質(zhì)組學(xué)的方法學(xué)研究進(jìn)展

樊昊 丁文 徐琰

(鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 河南鄭州 450001)

“蛋白質(zhì)組(proteome)”指的是由1個(gè)基因組表達(dá)的全部蛋白質(zhì)，1994年Marc Wilkins在意大利Siena會(huì)議上提出了這一概念。蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)是指應(yīng)用各種技術(shù)手段來(lái)研究蛋白質(zhì)組的學(xué)科，其目的是從整體的角度研究生物機(jī)體、組織、細(xì)胞甚至細(xì)胞器基因編碼的全部蛋白質(zhì)，包括蛋白的組成、分布、種類、功能、代謝特征及其動(dòng)態(tài)變化規(guī)律等［1］。

肝臟是身體內(nèi)以代謝功能為主的器官，起著去氧化、儲(chǔ)存肝糖、分泌性蛋白質(zhì)的合成等作用。肝病是一種世界范圍性的疾病，常見(jiàn)有肝炎、肝硬化、肝膿腫、原發(fā)性肝癌等。肝功能的損傷對(duì)患者全身器官組織都具有不同程度地?fù)p害，嚴(yán)重影響患者的生活。目前還沒(méi)有人工器官能夠完全取代肝臟的功能［2］。

蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)和生物結(jié)構(gòu)最主要的實(shí)際承擔(dān)者，從整體水平出發(fā)的肝臟蛋白質(zhì)組學(xué)研究可更貼近生命本質(zhì)的去理解肝臟的生命活動(dòng)規(guī)律和特點(diǎn)。同時(shí)肝臟蛋白質(zhì)組學(xué)的研究也能為新興的肝臟基因治療的發(fā)展和臨床運(yùn)用提供幫助［3］。因此，肝臟蛋白質(zhì)組學(xué)的研究備受重視。早在2002年國(guó)際蛋白質(zhì)組第一次研討會(huì)上，我國(guó)科學(xué)家倡導(dǎo)并提出了開(kāi)展人類肝臟蛋白質(zhì)組計(jì)劃的建議。2007年8月22日，我國(guó)科學(xué)家成功測(cè)定出6 788個(gè)高可信度的中國(guó)成人肝臟蛋白質(zhì)，系統(tǒng)構(gòu)建了國(guó)際上第1張人類器官蛋白質(zhì)組“藍(lán)圖”［4］。

隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法的更新和完善，蛋白質(zhì)組學(xué)研究得以進(jìn)一步深入。目前已有數(shù)種比較健全的蛋白質(zhì)組學(xué)研究體系，而對(duì)不同生物體、不同階段、不同狀態(tài)的蛋白質(zhì)組研究需要使用不同的方法。本文將對(duì)目前運(yùn)用于肝臟研究的常用蛋白質(zhì)組學(xué)方法進(jìn)行簡(jiǎn)要綜述，為研究者提供方法學(xué)上的建議，展望蛋白質(zhì)組學(xué)在肝臟研究領(lǐng)域的新空間。

1 蛋白質(zhì)分離技術(shù)

1.1 雙向凝膠電泳(two－dimensional electrophoresis，2－DE)常用的2－DE技術(shù)主要為二維聚丙烯酰胺凝膠電泳(two－dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，2D －PAGE)以及雙向熒光差異凝膠電泳(two－dimensional fluorescence difference gel electrophoresis，DIGE)。2D－PAGE是目前最為常用的蛋白質(zhì)組學(xué)分離方法之一，實(shí)用性高。DIGE則可以對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)行更精確且可重復(fù)的定量分析。雙向凝膠電泳獲得的數(shù)據(jù)已經(jīng)有專門的系統(tǒng)管理。如:PARIS(proteomic analysis and resources indexation system)系統(tǒng)［5］，儲(chǔ)存了電泳圖像和信息，可供研究者搜索使用。根據(jù)2－DE相關(guān)技術(shù)，可以對(duì)肝臟蛋白質(zhì)組中的目標(biāo)蛋白進(jìn)行分離［6］，在不同的pH值段構(gòu)建蛋白質(zhì)參考譜，以便于進(jìn)一步的分析［7］。對(duì)于同種蛋白，借助參考譜的對(duì)照，可以確定其亞基(如巰基等)等結(jié)構(gòu)的變化，或者檢測(cè)其修飾程度［8］。進(jìn)而在肝病研究中，可以通過(guò)分析肝臟疾病中蛋白質(zhì)的變化，探究蛋白質(zhì)的變化與肝臟疾病發(fā)生的關(guān)系［9］。然而，目前2－DE方法還存在著很多缺陷:蛋白質(zhì)電泳行為易受樣品中雜質(zhì)影響;難溶于樣品緩沖液的疏水性蛋白在圖譜上難以顯示;一些特殊蛋白易在電泳中降解和丟失;實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較差等［10］。故為適應(yīng)不同組織或細(xì)胞的特殊理化性質(zhì)，需要針對(duì)不同來(lái)源的樣品進(jìn)行預(yù)分離等處理，以獲得足夠量、高純度的蛋白質(zhì)樣品用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)HPLC采用了高壓輸液泵、高靈敏度檢測(cè)器和高效微粒固定相，可將液體混合物中的成份分離、成分定性并進(jìn)行定量分析。其分析速度快，通常分析1個(gè)樣品在15～30 min;分離效能高;可優(yōu)化固定相和流動(dòng)相以達(dá)到最佳分離效果;70%以上的有機(jī)化合物可用高效液相色譜分析，其優(yōu)勢(shì)十分明顯。其不足之處在于分析成本高，分析時(shí)間較長(zhǎng)。肝臟蛋白質(zhì)組中的蛋白含量大，種類繁多，低濃度的蛋白不易被檢測(cè)出。運(yùn)用HPLC可以精準(zhǔn)地檢測(cè)樣品中的目標(biāo)蛋白［11］，特別是高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性、熱穩(wěn)定性差化合物的分離分析。在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的蛋白分析如檢測(cè)蛋白質(zhì)的修飾程度中具有較好前景［12］。同時(shí)HPLC在肝臟藥物的提取和加工中也有廣泛的利用［13］。

1.3 親和層析(affinity chromatography) 親和層析是利用親和力，分離蛋白質(zhì)混合物中能特異結(jié)合配體的目的蛋白或其他分子的層析技術(shù)。其特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便，對(duì)含量少又不穩(wěn)定的活性物質(zhì)更為有效，并可得到高產(chǎn)率的純化產(chǎn)物。但是，只有那些具有配基的生物分子才能用親和層析分離，具有較高局限性。在肝臟蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中，親和層析技術(shù)能夠快速高效地分離出特征較明顯的目標(biāo)蛋白(如磷酸化修飾后的蛋白等)［14］。對(duì)于已知蛋白的提取和分離具有較好效果。也可以針對(duì)凝聚素(如DSA等)，對(duì)能與其親和的不同蛋白質(zhì)進(jìn)行研究［15］。

1.4 毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis，CE) CE是一類以毛細(xì)管為分離通道、以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力的新型液相分離技術(shù)［16］。CE技術(shù)使納米級(jí)的分析成為可能，其系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)在線自動(dòng)分析，一般十幾分鐘即可完成一次樣品分析;同時(shí)維持費(fèi)用較低。其缺點(diǎn)是制備能力差，對(duì)復(fù)雜樣品存在分離不完全的現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)中CE常與質(zhì)譜聯(lián)用，可以彌補(bǔ)紫外檢測(cè)器由于通過(guò)樣品的光程較短導(dǎo)致靈敏度低的問(wèn)題。肝臟蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中，CE技術(shù)可用于相對(duì)分子質(zhì)量范圍不適于2－DE的樣品。相比其他方法CE具有更好的泛用性［17］，對(duì)于定量的肝臟蛋白質(zhì)組學(xué)研究效果較好［18］。

2 蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)

2.1 質(zhì)譜技術(shù)(mass spectrometry，MS)MS鑒定蛋白質(zhì)的基本原理是先使樣品分子離子化，然后根據(jù)不同離子之間的質(zhì)荷比(m/z)的差異來(lái)分離并確定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量［19］。MS技術(shù)具有靈敏、準(zhǔn)確、高通量、自動(dòng)化等特點(diǎn)。質(zhì)譜技術(shù)可達(dá)到對(duì)蛋白質(zhì)的快速鑒定和高通量篩選［20］。但是MS還存在固有的局限性，質(zhì)荷比相似的蛋白質(zhì)不能區(qū)分等。MS廣泛運(yùn)用于肝臟蛋白質(zhì)組學(xué)研究的各個(gè)方面。MS可以運(yùn)用于大規(guī)模的肝臟蛋白質(zhì)組分析，一次性收獲大量數(shù)據(jù)［21］;以肝臟蛋白質(zhì)峰為模型等進(jìn)行宏觀方向的研究［22］;對(duì)于20個(gè)氨基酸以下的肽段，MS還能進(jìn)行翻譯后修飾的分析(糖基化、磷?；?。

2.2 鳥槍法(shotgun)蛋白質(zhì)鳥槍法是一種自下而上(bottom－up)的技術(shù)路線，增進(jìn)了低豐度蛋白、疏水性蛋白的分離和檢測(cè)能力;回收率高，可保持蛋白質(zhì)完整性和活性。該方法可在短時(shí)間內(nèi)獲得大量鑒定結(jié)果［23］，因此在蛋白質(zhì)組研究中被廣泛采用。其局限性在于:鳥槍法的重復(fù)性、可靠性以及信息的詳細(xì)程度相對(duì)較差。鳥槍法能高效地分析肽段上的變化，適用于探究特定模型下蛋白表達(dá)的差異以及蛋白修飾程度［24］，以及蛋白質(zhì)的加成與復(fù)雜基體中的活性代謝物的鑒定［25］。但是通過(guò)蛋白質(zhì)直接酶切得到的肽混合物過(guò)于復(fù)雜，不適合實(shí)現(xiàn)對(duì)肝細(xì)胞全部蛋白質(zhì)的識(shí)別與鑒定。

2.3 同位素標(biāo)記親和標(biāo)簽技術(shù)(isotope－coded affinitytag，ICAT)ICAT技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)研究應(yīng)用較多的便是免疫印跡法(western blot)，利用ICAT技術(shù)單獨(dú)選擇某一種蛋白質(zhì)，檢測(cè)其表達(dá)含量的變化。ICAT技術(shù)可以對(duì)混合樣品直接測(cè)試;能夠快速定性和定量鑒定低豐度蛋白質(zhì);還可以快速找出重要功能蛋白質(zhì)，其靈敏度和準(zhǔn)確性高。但是ICAT對(duì)不含半胱氨酸的蛋白質(zhì)無(wú)法分析。其標(biāo)簽試劑本身是種相當(dāng)大的修飾物，并在整個(gè)MS分析過(guò)程中保留在每個(gè)肽段上，這使得數(shù)據(jù)庫(kù)搜索的算法復(fù)雜。在肝臟蛋白質(zhì)組學(xué)中，ICAT常用于鑒定某種蛋白，并能對(duì)蛋白進(jìn)行定性和半定量分析［26］。同時(shí)通過(guò)檢測(cè)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，也可以檢測(cè)基因表達(dá)程度［27］。結(jié)合化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，可以同時(shí)比較多個(gè)肝組織樣品同種蛋白的表達(dá)量差異［28］。

2.4 相對(duì)和絕對(duì)定量同位素標(biāo)記(isobaric tags for relative andabsolute quantitation，iTRAQ) iTRAQ技術(shù)是一種體外同位素標(biāo)記技術(shù)。其優(yōu)勢(shì)在于可以對(duì)一個(gè)基因組表達(dá)的全部蛋白質(zhì)或某個(gè)復(fù)雜的混合體系中的所有蛋白質(zhì)進(jìn)行精確定量和鑒定，用于尋找差異表達(dá)蛋白。然而iTRAQ試劑易受雜質(zhì)蛋白以及緩沖液的污染，需要對(duì)樣本進(jìn)行預(yù)處理，對(duì)操作要求較高。此外還有成本較高等問(wèn)題［29］。iTRAQ能對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行精確定量分析，在肝臟蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中，適用于差異蛋白的定量比較，可用于檢測(cè)藥物療效，高效監(jiān)測(cè)生物標(biāo)記物變化［30］。

3 結(jié)語(yǔ)

選擇正確有效的技術(shù)對(duì)于蛋白質(zhì)組學(xué)的研究事半功倍。此次選擇了關(guān)注度較高的數(shù)種蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法，在PubMed上搜索近5年來(lái)的有關(guān)文章數(shù)，從中分析有關(guān)方法的熱度變化。分離方法中，2－DE介于較高的操作難度以及較差的重復(fù)性，近年的關(guān)注度有所下降;HPLC現(xiàn)已經(jīng)在金屬分析等領(lǐng)域中具有較多運(yùn)用，在肝臟蛋白質(zhì)組學(xué)研究中頗具潛力;CE以及親和層析雖熱度不高但前景良好。鑒定方法中，MS能提供海量的通量信息，是其他技術(shù)所不能比擬的;ICAT及iTRAQ目前運(yùn)用較多，在定量蛋白分析中具有良好的效果;鳥槍法對(duì)于肽段鑒定的效果良好，但在蛋白質(zhì)整體檢測(cè)的效果上仍有待提高。希望本文能為諸位肝臟蛋白質(zhì)組學(xué)者在研究方法選擇上提供一些幫助。

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