急性心肌梗死后抑郁大鼠前炎癥細(xì)胞因子腫瘤壞死因子α和白細(xì)胞介素1β的變化規(guī)律

關(guān)梓桐 張文潔 李悅 李衛(wèi)紅 杜慶紅 徐雅

傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為“心主神明”即心主宰人的精神、意識和情志。并認(rèn)為心主血脈，即血是心主神志的物質(zhì)基礎(chǔ)，而周身之血脈為心所主，此觀點為心主神明提供了理論基礎(chǔ)。因此本研究團(tuán)隊猜想，心臟疾病后患者精神神志是否會出現(xiàn)異常表現(xiàn)。目前臨床發(fā)現(xiàn)心肌梗死患者中30%～60%伴有中度抑郁，15%～20%伴有抑郁癥。又有證據(jù)表明心肌梗死預(yù)后不良在抑郁癥狀中占有很大比重［1］。抑郁癥可加速缺血性心臟病的進(jìn)展和增加心血管病的發(fā)病率和死亡率，是心血管疾病的一種危險因素［2-5］。目前心梗后抑郁發(fā)生病理機(jī)制的最新研究認(rèn)為，心梗后抑郁的發(fā)生與炎癥反應(yīng)相關(guān)，但其機(jī)制尚不明確。另有研究顯示，應(yīng)用抗炎藥如己酮可可堿(pentoxifylline，PTX)可減少心肌梗死后腦邊緣系統(tǒng)的細(xì)胞凋亡［6］，從而進(jìn)一步印證炎癥反應(yīng)與心梗后抑郁的關(guān)系。為揭示心肌梗死后心腦神志的生物學(xué)關(guān)系及評估大鼠心肌梗死后前炎癥因子腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)和白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β的變化規(guī)律，本實驗以大鼠心肌梗死模型為切入點，觀察心肌梗死后大鼠行為變化特征與炎癥因子循環(huán)水平變化規(guī)律的關(guān)系。

1 材料與方法

1．1 實驗動物

100只8周齡SPF級雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量200～220 g，均購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號:SYXK(京)2012-0001。于北京中醫(yī)藥大學(xué)動物中心嚴(yán)格按照北京中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會有關(guān)實驗動物倫理審查和管理規(guī)定進(jìn)行。按照隨機(jī)的原則將100只動物分成4組，其中模型組(AMI group)40只，術(shù)后成活19只，死亡21只，成活率為47．50%，其中死亡大鼠死亡原因為術(shù)中或術(shù)后心律失常。給藥組(PTX group)35只，術(shù)后成活15只。假手術(shù)組(Sham group)15只。正常組(normal group，N group)10只。

1．2 主要實驗設(shè)備和儀器

心電圖解析系統(tǒng)SP-2006_LAN(北京軟隆生物技術(shù)有限公司);自發(fā)行為動物檢測系統(tǒng)(JLBehv-LAR-1，上海吉量軟件科技有限公司);強(qiáng)迫游泳分析系統(tǒng)(EthoVision XT，Noldus公司，荷蘭)。

1．3 實驗試劑

己酮可可堿(Enzo Life Sciences公司，批號:L 02465)。

1．4 心肌梗死動物模型建立

心肌梗死動物模型的建立，對比后參考Trueblood的方法［7］并在其基礎(chǔ)上予以改進(jìn)，將Wistar大鼠用10%的水合氯醛(0．4 mL/100g)麻醉后，仰位固定于手術(shù)臺上，采用生物信號定量分析系統(tǒng)SP-2006_LAN(北京軟隆生物技術(shù)有限公司)記錄大鼠術(shù)前及術(shù)后標(biāo)準(zhǔn)體表心電圖。正中剃毛，碘酒常規(guī)消毒，手術(shù)刀正中切開，用止血鉗鈍性分離肋間肌肉，自左側(cè)4～5肋間開胸，暴露心臟，在肺動脈圓錐及左心耳之間，距左冠狀動脈起點2～3 mm處，用3～0無創(chuàng)縫合線結(jié)扎左冠狀動脈前降支，立刻將心臟送回胸腔，擠出胸腔內(nèi)氣體，待心率及呼吸平穩(wěn)后用5～0縫合線縫合，假手術(shù)組在心臟左冠狀動脈左前降支處穿線不接扎，余過程與模型建立相同。正常組不予以任何手術(shù)處理。術(shù)后模型組及假手術(shù)組大鼠肌注青霉素鈉注射液80 000 U/天，共3天，以防止感染。動物清醒后按常規(guī)飼養(yǎng)。模型成功標(biāo)準(zhǔn)為心電圖顯示Ⅱ?qū)?lián)出現(xiàn)ST段弓背抬高0．2 mV以上(見圖1、圖2)。假手術(shù)組術(shù)后ST段的抬高不明顯(見圖3、圖4)。術(shù)后1～7天給藥組連續(xù)7天每日上午10點進(jìn)行腹腔注射PTX(0．2 mL/100g)，模型組給等體積的生理鹽水。

1．5 行為學(xué)觀察

1．5．1 蔗糖水消耗實驗［8］蔗糖水消耗實驗于大鼠手術(shù)前，手術(shù)后2周進(jìn)行。本實驗是以大鼠蔗糖水?dāng)z取量降低作為指標(biāo)，用于評估大鼠快感缺乏［9-10］。實驗前48小時，訓(xùn)練大鼠適應(yīng)飲用蔗糖水。同時給予每只大鼠兩瓶水:一瓶為1%蔗糖水，一瓶為純凈水。大鼠禁食禁水24小時，而后在安靜避光的環(huán)境下進(jìn)行蔗糖水消耗實驗。然后每籠分別給予已定量的蔗糖水(1%蔗糖水)和純凈水兩瓶液體，60分鐘后取走液體并分別稱重。蔗糖水消耗百分比=蔗糖水消耗量/總液體消耗量×100%

圖1 模型組術(shù)前心電圖

圖2 模型組術(shù)后10分鐘心電圖

圖3 假手術(shù)組術(shù)前心電圖

圖4 假手術(shù)組術(shù)后10分鐘心電圖

1．5．2 自發(fā)行為實驗 自發(fā)行為實驗所用裝置為不透明的材料所制成，箱體為正方體，通過箱體所帶攝像頭來觀察大鼠在箱體的運(yùn)動狀態(tài)。根據(jù)參考文獻(xiàn)［11］，本實驗于大鼠手術(shù)后第2周進(jìn)行。實驗時將大鼠輕慢置于中心方格內(nèi)，關(guān)閉箱門，觀察大鼠在5分鐘內(nèi)的活動總路程，活動總時間和站立次數(shù)。

1．5．3 強(qiáng)迫游泳實驗 本實驗為行為絕望實驗法，其基本原理為當(dāng)大鼠放置在一個有限的空間使之游泳，觀察大鼠在水中的行為，大鼠不動時間越長，表示抑郁程度越高。本實驗于手術(shù)后30天進(jìn)行，參考文獻(xiàn)［12-13］將每只大鼠于下午13:00在安靜狀態(tài)下分別置于水溫24～25℃，水深30 cm，21 cm×21 cm×50 cm的有機(jī)玻璃缸中，進(jìn)行預(yù)游泳，每只大鼠游泳時間為15分鐘。24小時后進(jìn)行正式游泳實驗。同時間，同條件下讓每只大鼠強(qiáng)迫游泳5分鐘，并同時使用強(qiáng)迫游泳分析系統(tǒng)(EthoVision XT，Noldus公司，荷蘭)記錄大鼠游泳時間、掙扎時間及不動時間并對指標(biāo)進(jìn)行分析。

1．6 組織學(xué)檢測

TNF-α，IL-1β在大鼠血漿內(nèi)和腦組織內(nèi)濃度。術(shù)后33天取材。用10%的水合氯醛(0．4 mL/100g)麻醉大鼠，腹主動脈取血4 mL，注入肝素鈉離心管并離心，取上清液，－80℃保存;斷頸法處死大鼠，取腦組織，將腦組織于－80℃保存。大鼠腹主動脈取血于用肝素鈉采血管內(nèi)，離心機(jī)3000 rpm離心10分鐘，取上清液，大鼠腦組織勻漿。用Rat TNF-αElISA KIT試劑盒檢測(Multi Science)和Rat IL-1βElISA KIT試劑盒檢測(Multi Science)。

1．7 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 20．0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示。數(shù)據(jù)均服從正態(tài)分布，并采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較時采用LSD法，P＜0．05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實驗結(jié)果

2．1 各組大鼠蔗糖水消耗實驗比較

各組大鼠蔗糖水消耗百分比經(jīng)正態(tài)檢驗，均符合正態(tài)分布，方差齊性檢驗P＞0．05，組間兩兩比較采用LSD法。假手術(shù)與正常組相比，大鼠蔗糖水消耗百分比沒有明顯差異(P＞0．05)。模型組與假手術(shù)組相比，模型組大鼠蔗糖水消耗百分比明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)。PTX組與模型組相比，PTX組大鼠蔗糖水消耗百分比明顯高于模型組大鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)。見表1。

表1 心梗術(shù)后各組大鼠蔗糖水消耗百分比±s)

表1 心梗術(shù)后各組大鼠蔗糖水消耗百分比±s)

注:與假手術(shù)組相比，a P ＜0．05;與模型組相比，b P ＜0．05

組別 n 蔗糖水消耗百分比(%)10 84．55 ±9．93假手術(shù)組 11 84．44 ±8．43模型組 9 63．15 ±9．22a PTX 組 8 74．89 ±5．17正常組b

2．2 各組大鼠自發(fā)行為實驗比較

各組大鼠三項自發(fā)行為指標(biāo)經(jīng)正態(tài)檢驗，均符合正態(tài)分布，方差齊性檢驗P＞0．05，組間兩兩比較采用LSD法。假手術(shù)與正常組相比，大鼠的活動總路程，總時間和站立次數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。模型組與假手術(shù)組相比，模型組大鼠的活動總路程，總時間和站立次數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)。PTX組和模型組相比，PTX組大鼠的活動總路程，總時間和站立次數(shù)明顯高于模型組大鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)。見表2。

表2 心梗后各組大鼠自發(fā)行為實驗指標(biāo)±s)

表2 心梗后各組大鼠自發(fā)行為實驗指標(biāo)±s)

注:與假手術(shù)組相比，a P ＜0．05;與模型組相比，b P ＜0．05

組別 n 總路程(mm) 總時間(s) 站立次數(shù)(次)44假手術(shù)組 11 7570．42 ±3141．58 208．76 ±20．12 32．43 ±12．14模型組 9 908．03 ±896．88a 59．00 ±36．50a 3．17 ±4．36a PTX 組 8 3952．39 ±2384．53b127．80 ±47．40b 18．22 ±6．28正常組 10 10651．54 ±3006．80 184．61 ±51．82 40．71 ±20．b

2．3 各組大鼠強(qiáng)迫游泳實驗比較

各組大鼠強(qiáng)迫游泳三項指標(biāo)經(jīng)正態(tài)檢驗，均符合正態(tài)分布，方差齊性檢驗P＞0．05，組間兩兩比較采用LSD法。假手術(shù)組與正常組相比，大鼠的游泳時間，不動時間和掙扎時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0．05)。模型組與假手術(shù)組相比，模型組大鼠游泳時間和掙扎時間明顯減少，但不動時間增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)。PTX組與模型組相比，PTX組大鼠的游泳時間和掙扎時間明顯高于模型組大鼠，但不動時間明顯低于模型組大鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)。見表3。

表3 心梗后各組大鼠強(qiáng)迫游泳實驗行為指標(biāo)± s ，S)

表3 心梗后各組大鼠強(qiáng)迫游泳實驗行為指標(biāo)± s ，S)

注:與假手術(shù)組相比，a P＜0．05;與模型組相比，b P＜0．05

10 172．41 ±6．88 40．77 ±4．77 88．12 ±24．48假手術(shù)組 11 152．70 ±7．78 61．04 ±4．90 29．00 ±8．37模型組 9 10．38 ±4．26a 290．92 ±7．26a 0．51 ±0．56a PTX 組 8 32．41 ±7．35b 125．30 ±8．11b 5．56 ±3．71游泳時間 不動時間 掙扎時間正常組組別 n b

2．4 各組大鼠血漿內(nèi)IL-1β 和TNF-α 濃度

各組大鼠血漿內(nèi)IL-1β和TNF-α濃度經(jīng)正態(tài)檢驗，均符合正態(tài)分布，方差齊性檢驗P＞0．05組間兩兩比較采用LSD法。假手術(shù)組與正常組相比，大鼠血漿內(nèi)IL-1β和TNF-α濃度無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。模型組與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血漿內(nèi)IL-1β和TNF-α濃度均增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)。PTX組和模型組相比，PTX組大鼠血漿內(nèi)IL-1β和TNF-α濃度均低于模型組大鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)。見表4。

表4 心梗后各組大鼠血漿內(nèi)IL-1β和TNF-α濃度指標(biāo)±s)

表4 心梗后各組大鼠血漿內(nèi)IL-1β和TNF-α濃度指標(biāo)±s)

注:與假手術(shù)組相比，a P ＜0．05;與模型組相比，b P ＜0．05

組別 n IL-1β TNF-α 10 106．26 ±13．18 499．00 ±71．42假手術(shù)組 11 117．19 ±17．91 478．31 ±191．71模型組 9 147．91 ±24．35a 708．37 ±81．31a PTX 組 8 130．41 ±13．24b 615．87 ±55．66正常組b

2．5 各組大鼠腦內(nèi)IL-1β 和TNF-α 濃度

各組大鼠腦內(nèi)IL-1β和TNF-α濃度經(jīng)正態(tài)檢驗，均符合正態(tài)分布，方差齊性檢驗P＞0．05，組間兩兩比較采用LSD法。假手術(shù)組與正常組相比，大鼠腦內(nèi) IL-1β和 TNF-α濃度無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。模型組和假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦內(nèi)IL-1β和TNF-α濃度均增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)。PTX組和模型組相比，PTX組大鼠腦內(nèi)IL-1β和TNF-α濃度均低于模型組大鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)。見表5。

表5 心梗后各組大鼠腦內(nèi)IL-1β和TNF-α濃度指標(biāo)(±s)

表5 心梗后各組大鼠腦內(nèi)IL-1β和TNF-α濃度指標(biāo)(±s)

注:與假手術(shù)組相比，a P ＜0．05;與模型組相比，b P ＜0．05

組別 n IL-1β TNF-α 10 31．88 ±11．37 74．17 ±9．54假手術(shù)組 11 51．36 ±8．06 103．37 ±12．57模型組 9 76．16 ±6．92a 147．03 ±15．90a PTX 組 8 62．49 ±8．07b 116．03 ±9．63正常組b

3 討論

傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為識神是指人的精神意識思維活動，是以人的意志為轉(zhuǎn)移的，大腦的后天活動，本源于大腦卻隸屬于心，這是由于心主血脈為大腦的識神活動提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。目前臨床統(tǒng)計表明心血管疾病并發(fā)情緒障礙的概率為8% ～44%［14］?？挂钟羲帉π募」Ｋ赖闹委煰熜跷?，因此探求心肌梗死后抑郁相關(guān)病理機(jī)制尤為重要。目前在急性心梗模型的基礎(chǔ)研究中，慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激抑郁模型是目前較為理想的抑郁動物模型之一［15-16］。根據(jù)參考文獻(xiàn)，抑郁癥動物模型至少應(yīng)符合3個標(biāo)準(zhǔn)［17］:(1)表觀信度:例如動物的行為特點看上去是否象人類的抑郁癥;(2)內(nèi)在信度:引起行為改變的原因和因果關(guān)系是否和抑郁癥一樣;(3)預(yù)測信度:對人類有效的抗抑郁藥是否能可靠地改變動物的這種行為。本實驗結(jié)果表明大鼠冠狀動脈前降支結(jié)扎2周后，模型組大鼠與正常組和假手術(shù)組大鼠相比，蔗糖水偏好顯著減少，表明大鼠快感缺乏;自發(fā)行為實驗中大鼠的活動總路程、總時間、直立次數(shù)均明顯減少，表明大鼠的活動度和對外界新鮮環(huán)境的好奇度明顯下降;游泳時間和掙扎時間明顯減少，不動時間增加，表明大鼠具有絕望行為。以上大鼠產(chǎn)生快感缺乏，活動能力下降，產(chǎn)生絕望行為與抑郁癥的核心癥狀(心情低落、興趣缺乏等)有一定程度的相似性，類似抑郁癥患者的癥狀，因此可以判定大鼠在急性心肌梗死后產(chǎn)生了抑郁行為。

目前心肌梗死后抑郁的發(fā)生機(jī)制尚未明確，有研究表明，心肌梗死與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。心肌局部及全身的炎癥反應(yīng)，影響心肌梗死的病理及預(yù)后，并最終導(dǎo)致心肌重塑和疤痕形成。心肌梗死后，由免疫導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)，包括補(bǔ)體激活、細(xì)胞因子釋放、炎癥和免疫細(xì)胞趨化和浸潤，可加重心肌損傷和擴(kuò)大心肌梗死的范圍。前炎癥細(xì)胞因子的釋放與心梗后抑郁的發(fā)病病理有關(guān)［18-19］。與心肌組織細(xì)胞因子濃度升高相平行的是，心梗后腦組織當(dāng)中細(xì)胞因子的濃度也急劇增加［20］。因此本研究可以提出假設(shè)在急性心梗使得前炎癥細(xì)胞因子(如IL-1β、TNF-α)被激活并釋放入血，隨血液循環(huán)透過血腦屏障進(jìn)入腦組織，刺激腦內(nèi)神經(jīng)元，小膠質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)一步釋放前炎癥細(xì)胞因子如TNF-α和IL-1β等，引起腦內(nèi)炎癥從而誘發(fā)抑郁的產(chǎn)生。根據(jù)上述實驗結(jié)果，模型組大鼠與假手術(shù)組大鼠和正常組大鼠相比，其血漿內(nèi)和腦內(nèi)IL-1β濃度和TNF-α濃度均明顯升高，從而可印證本研究提出的假設(shè)。

PTX是甲基黃嘌呤衍生物，是一種非特異性磷酸二酯酶抑制劑，具有抗炎抗纖維化特性，可通過cAMP依賴機(jī)制降低促炎細(xì)胞因子循環(huán)水平，如TNF-α、IL-1β 等［21］。有研究證明 PTX 可能通過改變促炎細(xì)胞因子水平從而衰減抑郁行為。據(jù)報道促炎細(xì)胞因子可誘發(fā)抑郁樣行為和細(xì)胞凋亡。例如:IL-1β 可提高 HPA活性［22］，并且誘發(fā)抑郁行為［23-25］，而 IL1-β 在抑郁癥患者循環(huán)濃度升高，且IL-1β拮抗劑可抑制IL-1β活性，由此可以認(rèn)為PTX可減少炎性細(xì)胞因子。本實驗研究數(shù)據(jù)表明，PTX可通過抑制炎癥因子循環(huán)水平而緩解心梗后抑郁的癥狀，從而印證炎癥反應(yīng)可能是心梗后抑郁發(fā)生的可能機(jī)制這一猜想。

本研究采用冠狀動脈前降支結(jié)扎方法建立大鼠急性心肌梗死模型，并通過行為學(xué)實驗和組織學(xué)檢測研究表明大鼠在心肌梗死后出現(xiàn)快感缺乏，活動度低下，絕望行為等抑郁行為，且模型組大鼠血漿內(nèi)和腦內(nèi)炎癥因子IL-1β和TNF-α濃度明顯升高。并采用PTX予以治療。結(jié)果表明PTX組大鼠與模型組大鼠相比，不但血漿內(nèi)和腦內(nèi)炎癥因子IL-1β和TNF-α循環(huán)水平濃度降低，且包括蔗糖水偏好顯著升高;活動總路程、總時間、直立次數(shù)和直立時間均明顯升高，游泳時間和掙扎時間明顯升高，不動時間顯著減少在內(nèi)的抑郁行為顯著減輕，提示炎癥反應(yīng)可能是心梗后抑郁發(fā)生的可能機(jī)制。

本實驗研究急性心肌梗死后產(chǎn)生的炎癥因子通過血液循環(huán)進(jìn)入腦組織從而引起腦內(nèi)炎癥而產(chǎn)生抑郁，但目前研關(guān)于炎癥因子如何改變血腦屏障通透性的機(jī)制仍尚未明確，希望通過建立更詳細(xì)的實驗來研究心梗后抑郁的炎癥機(jī)制。

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