IL-8基因-251T/A和+781C/T多態(tài)性與南通地區(qū)肝癌遺傳易感性的關(guān)聯(lián)研究

陸小華， 朱小慶， 張玉宇， 儲(chǔ)玉山， 茅國(guó)新

肝癌是臨床最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。遺傳因素在肝癌的病因中約占所有危險(xiǎn)因素的60%［1］。南通地區(qū)，尤其是啟東、海門(mén)，在國(guó)內(nèi)屬于肝癌高發(fā)區(qū)，發(fā)病率、死亡率位居前列。對(duì)寡核苷酸多態(tài)性（SNP）與肝癌遺傳易感性關(guān)聯(lián)的研究將有利于在本地區(qū)采取更好的預(yù)防、診斷和治療措施，具有重要的臨床意義和應(yīng)用價(jià)值。許多研究表明，白細(xì)胞介素（IL）SNP與肝癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［2-5］。IL-8作為一種多功能的趨化因子，在新生血管形成、炎性反應(yīng)等多種生理病理過(guò)程中發(fā)揮作用。本研究選取該基因在中國(guó)人群中等位基因型頻率>0.05且在國(guó)內(nèi)外腫瘤易感性研究中涉及較多的的-251T/A（rs4073）、+781C/T（rs2227306）位點(diǎn)進(jìn)行南通地區(qū)肝癌遺傳易感性關(guān)聯(lián)的研究，并探究基因多態(tài)性與不同暴露因素交互作用對(duì)肝癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的影響。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究為醫(yī)院基礎(chǔ)的病例對(duì)照研究。包括454例肝癌患者及446名健康對(duì)照。病例組選擇2011年7月1日至2013年3月31日在我院介入放射科、普外科住院，按照《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范（2011年版）》診斷標(biāo)準(zhǔn)確診的且無(wú)治療史的肝癌患者，對(duì)照組選擇同期在我院門(mén)診體檢且無(wú)腫瘤疾病的健康人群。入組人員均為南通地區(qū)籍貫或在南通地區(qū)生活15年以上的漢族成年人。

1.2 方法

1.2.1 問(wèn)卷調(diào)查 采用統(tǒng)一調(diào)查表，在征得受檢者知情同意后，填寫(xiě)每例（名）研究對(duì)象的人口學(xué)資料和相關(guān)暴露因素資料調(diào)查表。調(diào)查表中按WHO標(biāo)準(zhǔn)定義吸煙和飲酒史，即研究對(duì)象一生中連續(xù)或累積吸煙半年或以上者視為有吸煙史；每周飲酒至少1次，持續(xù)半年或以上者視為有飲酒史。所有研究對(duì)象資料的收集均符合倫理學(xué)原則。

1.2.2 試驗(yàn)方法 所有研究對(duì)象均抽取外周靜脈血3 ml，采用上海生工SK8224血液基因組DNA抽提試劑盒提取基因組DNA。利用RFLP-PCR方法，對(duì)IL-8基因-251位點(diǎn)和+781位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。引物序列為：-251位點(diǎn)正向引物 5′-ATTGGCTGGCTTATCTTCA-3′， 反 向 引 物 5′-CAAATACGGAGTATGACGAAAG-3′。 +781 位點(diǎn)正向引物 5′-GTGGTATCACAGAGGATTATGC-3′，反向引物 5′-CAGTCATAACTGACAACATTGATC-3′。PCR 反應(yīng)體系總體積為 15μl：11μl ddH2O；1.5μl 10×PCR 緩 沖 液 ；1.2 μl 25 mmol/L Mg2+；0.3 μl dNTP；0.2 μl正向引物；0.2 μl反向引物；Taq DNA聚合酶0.1 μl；0.5 μl模板 DNA。 反應(yīng)步驟：95℃預(yù)變性 5 min，95℃變性 30 s，68℃退火 45 s，72℃延伸1 min， 循環(huán) 20 次；95℃變性 30 s，58℃退火 30 s，72℃延伸40 s循環(huán)20次，72℃延伸6 min。-251位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為272 bp，Mun I消化后在2%瓊脂糖凝膠上電泳。TT基因型顯示272 bp條帶，AA基因型顯示170、102 bp 2個(gè)條帶，AT基因型顯示272、170和102 bp 3個(gè)條帶（見(jiàn)圖1）。+781位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為162 bp，Bcl I消化后在2%瓊脂糖凝膠上電泳。CC基因型顯示162 bp條帶，TT基因型顯示118、44 bp 2個(gè)條帶，CT基因型顯示162、118和44 bp 3個(gè)條帶 （見(jiàn)圖2）。在全部樣本中，隨機(jī)挑取15%樣本進(jìn)行測(cè)序，以驗(yàn)證分型的準(zhǔn)確性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，用Hardy-

（M：Marker； 1、4、5、6 泳道為 AT 基因型；3 泳道為 AA 基因型；2、7、8泳道為T(mén)T基因型）圖1 IL-8基因－251位點(diǎn)PCR產(chǎn)物酶切電泳圖

（M：Marker；1、2、5、6、8 泳道為 CC 基因型；3、4 泳道為 CT 基因型；7泳道為T(mén)T基因型）Weinberg平衡檢驗(yàn)樣本的群體代表性，用方差分析進(jìn)行計(jì)量資料的多樣本均數(shù)比較，用χ2檢驗(yàn)比較各位點(diǎn)基因型及由2個(gè)位點(diǎn)組成的基因型頻率差異，以多因素Logistic回歸分析IL-8 SNP與肝癌易感性的關(guān)聯(lián)，關(guān)聯(lián)強(qiáng)度用OR、95%CI及交互作用指數(shù)S表示，其中S>1為正交互，S＜1為負(fù)交互。所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象的一般情況

病例組454例，對(duì)照組446例。兩組在性別、年齡的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。吸煙、飲酒、HBV感染和肝癌家族史在兩組中的分布頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 見(jiàn)表 1。

2.2 IL-8基因型分布Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)

IL-8-251、+781位點(diǎn)各基因型在對(duì)照組中Hardy-Weinberg平衡結(jié)果表明，對(duì)照組中各基因型分布均符合該平衡定律，其中－251位點(diǎn)χ2=0.09，P=0.95；+781 位點(diǎn) χ2=0.04，P=0.98?？烧J(rèn)為對(duì)照組人群來(lái)自總體人群，具有群體代表性。

表1 肝癌組、對(duì)照組研究對(duì)象的一般情況

2.3 2位點(diǎn)等位基因和基因型頻率分布比較

－251位點(diǎn)3種基因型TT、TA、AA在病例組中分布頻率為23.79%、64.54%、11.67%，在對(duì)照組分別為38.57%、44.17%、17.26%，2組之間3種基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。等位基因T在病例組和對(duì)照組中頻率分別為56.06%、60.65%，等位基因A在病例組和對(duì)照組中頻率分別為43.94%、39.35%。2組之間等位基因分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 +781位點(diǎn) 3種基因型 CC、CT、TT 在病例組中分布頻率為38.55%、51.98%、9.47%，在對(duì)照組分別為45.29%、41.03%、13.68%，2組之間3種基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。等位基因C在病例組和對(duì)照組中頻率分別為64.54%、65.81%，等位基因T在病例組和對(duì)照組中頻率分別為35.46%、34.19%。2組之間等位基因分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 見(jiàn)表 2。

表2 兩位點(diǎn)各基因型、等位基因頻率在研究對(duì)象中的分布

2.4 IL-8基因多態(tài)性與HCC患病風(fēng)險(xiǎn)的多因素Logistic回歸分析

與IL-8－251位點(diǎn)TT野生型基因攜帶者相比，攜帶AT雜合突變型基因者罹患HCC的風(fēng)險(xiǎn)增加（OR=1.99，95%CI：1.01～3.85）， 攜帶 AA 純合突變基因型者與HCC的患病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)（OR=1.06，95%CI：0.82～1.75）。 而與+781 位點(diǎn) CC 野生基因型個(gè)體相比，攜帶突變基因型CT、TT者罹患HCC的風(fēng)險(xiǎn)增加 （CT基因型 OR=1.78，95%CI：1.03～3.1；TT 基因型 OR=1.36，95%CI：1.01～2.62）。 結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 2位點(diǎn)多態(tài)性與HCC患病風(fēng)險(xiǎn)的多因素Logistic回歸分析

2.5 2位點(diǎn)聯(lián)合基因型與HCC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)

本研究顯示，與攜帶－251位點(diǎn)、+781位點(diǎn)TTCC聯(lián)合基因型的個(gè)體相比，攜帶AT-CT、TT-CT及AT-CC聯(lián)合基因型的個(gè)體罹患HCC的風(fēng)險(xiǎn)增加（AT-CT 基因型 OR=2.10，95%CI：1.52～2.9；TT-CT基因型 OR=3.33，95%CI：1.01～10.50；AT-CC 基因型OR=3.67，95%CI：2.28～5.90）。 而攜帶 AA-TT、AACT、TT-TT聯(lián)合基因型者罹患HCC的風(fēng)險(xiǎn)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)。見(jiàn)表4。

表4 2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)聯(lián)合基因型與HCC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)結(jié)果

2.6 IL-8基因多態(tài)性與不同暴露因素在HCC發(fā)病中的交互作用分析

本研究發(fā)現(xiàn)，－251位點(diǎn)SNP與飲酒、HBV感染、肝癌家族史因素在HCC的發(fā)生中存在正交互作用，該位點(diǎn)SNP與年齡、性別、吸煙因素在HCC的發(fā)生中存在負(fù)交互作用。+781位點(diǎn)SNP與飲酒、肝癌家族史因素在HCC的發(fā)生中存在正交互作用，而該位點(diǎn)SNP與年齡、性別、吸煙、HBV感染這些因素在HCC的發(fā)生中存在負(fù)交互作用?，F(xiàn)將吸煙、飲酒、HBV感染、肝癌家族史陽(yáng)性與否的結(jié)果見(jiàn)表 5、6。

表5 －251T/A位點(diǎn)SNP與多種暴露因素在HCC發(fā)生中的交互作用

表6 +781C/T位點(diǎn)SNP與多種暴露因素在HCC發(fā)生中的交互作用

3 討論

肝癌的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，其發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移與多種基因的突變、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路和新生血管增生異常等因素密切相關(guān)。IL-8作為一種多能α型趨化因子，對(duì)多種白細(xì)胞有趨化、激活作用，在炎癥、免疫反應(yīng)、動(dòng)脈硬化及DIC中起到一定作用；同時(shí)其也是促血管生成因子，可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞在血管生成過(guò)程中的應(yīng)答，增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞存活及擴(kuò)散，并促進(jìn)腫瘤部位的腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和浸潤(rùn)性嗜中性粒細(xì)胞遷移。與腫瘤血管新生、生長(zhǎng)以及腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，影響腫瘤的治療和預(yù)后。IL-8信號(hào)表達(dá)可通過(guò)以下途徑：①調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子的活動(dòng)影響基因表達(dá)；②在翻譯階段調(diào)節(jié)細(xì)胞蛋白質(zhì)組；和（或）③通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白的翻譯后調(diào)節(jié)影響細(xì)胞骨架，從而激活多個(gè)上游的信號(hào)傳導(dǎo)通路［6］。IL-8基因位于人染色體4q13-q21區(qū)域，由4個(gè)外顯子、3個(gè)內(nèi)含子和1個(gè)啟動(dòng)子構(gòu)成。IL-8的產(chǎn)生受包括－251A/T在內(nèi)的的啟動(dòng)子區(qū)域的控制。啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生突變，可影響IL-8基因轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致IL-8產(chǎn)生受到影響。內(nèi)含子區(qū)+781 C/T定位于CAAT盒的上游，可以結(jié)合CAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白B（C/EBPb），從而促進(jìn)IL-8基因的轉(zhuǎn)錄和調(diào)節(jié)作用。內(nèi)含子區(qū)發(fā)生突變，可導(dǎo)致真核基因剪接信號(hào)的改變，使得內(nèi)含子以隱外顯子的方式出現(xiàn)在真核RNA中，編碼出無(wú)活性的蛋白質(zhì)，從而影響IL-8的功能。近年來(lái)，許多研究發(fā)現(xiàn)IL-8基因多態(tài)性與胃癌、乳腺癌、鼻咽癌、舌癌、口腔鱗癌等多種腫瘤的易感性相關(guān)［7-12］。但該基因多態(tài)性與肝癌的遺傳易感性的關(guān)聯(lián)研究不多，尤其缺少?lài)?guó)內(nèi)人群的相關(guān)報(bào)道。本研究結(jié)合南通地區(qū)肝癌高發(fā)的特點(diǎn)，進(jìn)行該基因－251T/A和+781C/T位點(diǎn)多態(tài)性與南通地區(qū)人群肝癌遺傳易感性的關(guān)聯(lián)研究。結(jié)果顯示，IL-8－251位點(diǎn)雜合突變基因型AT及+781位點(diǎn)突變基因型CT、TT是南通地區(qū)人群罹患HCC的易感基因型。－251位點(diǎn)純合突變基因型AA在本研究中雖然未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，但顯示為邊緣陽(yáng)性（P=0.05）。鑒于本研究的初期樣本量較小，可能會(huì)產(chǎn)生一定的偏倚，我們后續(xù)研究將通過(guò)進(jìn)一步增加樣本量來(lái)驗(yàn)證該位點(diǎn)多態(tài)性與HCC發(fā)生存在關(guān)聯(lián)。而臺(tái)灣地區(qū) Chien等［13］研究發(fā)現(xiàn)，IL-8+781位點(diǎn) TT基因型較CC基因型發(fā)生HCC的風(fēng)險(xiǎn)顯著降低（OR=0.346，95%CI：0.132～0.909）， 與本研究結(jié)果不一致，可能原因包括：一是不同地區(qū)人群具有異質(zhì)性；二是肝癌是多基因多位點(diǎn)突變共同造成的結(jié)果，不僅僅是由單一基因單個(gè)位點(diǎn)突變所致，單個(gè)位點(diǎn)是否發(fā)生突變并不能直接導(dǎo)致肝癌的發(fā)生。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，－251、+781 2位點(diǎn)不同聯(lián)合基因型中，AT-CT、TT-CT及AT-CC3種聯(lián)合基因型的個(gè)體罹患肝癌的風(fēng)險(xiǎn)增加。復(fù)雜疾病一般由多種遺傳與環(huán)境因素以及它們之間的相互作用引起，并促使其發(fā)生發(fā)展。目前已經(jīng)有很多研究證據(jù)表明，肝癌的發(fā)生是基因與環(huán)境交互作用的共同結(jié)果［14-16］。本文針對(duì)IL-8基因上的2個(gè)SNP位點(diǎn)展開(kāi)研究，發(fā)現(xiàn)其與年齡、性別、吸煙、飲酒、HBV感染、家族史等方面存在交互作用，為后續(xù)的進(jìn)一步研究提供了線索，也為個(gè)體化治療提供了一定的研究方向。肝癌的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，其發(fā)生絕非單一分子事件，只有當(dāng)多種基因同時(shí)發(fā)生改變、協(xié)同作用，方可增加發(fā)生肝癌的危險(xiǎn)性。分析易感基因的某種基因型頻率在肝癌患者與正常對(duì)照人群中的分布差異，只能確定某基因型個(gè)體對(duì)肝癌的易感性，僅是肝癌遺傳機(jī)制中的諸多作用因素之一。本研究?jī)H選擇了IL-8基因的2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，且樣本量較小，所以只能視其為一個(gè)初步研究。今后我們應(yīng)該加強(qiáng)于肝癌發(fā)生相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路中的多基因交互作用，在大樣本基礎(chǔ)上對(duì)多個(gè)基因的交互作用與肝癌發(fā)生關(guān)聯(lián)進(jìn)行研究。如加強(qiáng)基因與基因之間以及基因與不同環(huán)境影響因素交互作用的研究，構(gòu)建肝癌易感基因單體型圖，或?qū)⒂兄谠黾訉?duì)肝癌的認(rèn)識(shí)，為從基因水平更好的采取預(yù)防、診斷和治療措施打下理論基礎(chǔ)。

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