菰黑粉菌中Ueubc2的克隆及表達(dá)分析

余佳佳，張雅芬，崔海峰，俞曉平，葉子弘

（中國(guó)計(jì)量學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院/浙江省生物計(jì)量及檢驗(yàn)檢疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，310018）

菰黑粉菌中Ueubc2的克隆及表達(dá)分析

余佳佳，張雅芬，崔海峰，俞曉平，葉子弘

（中國(guó)計(jì)量學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院/浙江省生物計(jì)量及檢驗(yàn)檢疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，310018）

茭白是我國(guó)第二大水生蔬菜，它的形成與其內(nèi)生真菌菰黑粉菌的侵染密切相關(guān)。根據(jù)菰黑粉菌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)設(shè)計(jì)特異引物，采用RT-PCR擴(kuò)增獲得Ueubc2基因，序列分析發(fā)現(xiàn)Ueubc2是玉米瘤黑粉菌中ubc2的同源基因，編碼蛋白含有SAM、RA、SH3結(jié)構(gòu)域，作用于MAPK信號(hào)通路。同時(shí)通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)Ueubc2基因進(jìn)行表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)在融合生長(zhǎng)過(guò)程中Ueubc2上調(diào)表達(dá)，并在菌絲形成時(shí)其表達(dá)量最大，隨著菌絲生長(zhǎng)表達(dá)量逐漸降低，表明其在菰黑粉菌真菌二型態(tài)轉(zhuǎn)變過(guò)程中具有重要作用。

菰黑粉菌；二型態(tài)轉(zhuǎn)換；Ueubc2

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本課題組前期分別從龍茭2號(hào)正常茭和灰茭中分離得到的菰黑粉菌MT-1、T-1。

1.2 試驗(yàn)培養(yǎng)基

YEPS培養(yǎng)基：酵母提取物10 g，胰蛋白胨20 g，蔗糖20 g，蒸餾水1 000 mL；固體培養(yǎng)基另加15 g瓊脂；LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，NaCl 10 g；固體培養(yǎng)基另加15 g瓊脂。

1.3 Ueubc2基因片段的擴(kuò)增

①菰黑粉菌總RNA和DNA提取 收集適量菰黑粉菌，在液氮中充分研磨成粉末，根據(jù)Trizol試劑提取說(shuō)明書提取菰黑粉菌總RNA。DNA提取則用CTAB法。

②Ueubc2基因相關(guān)大片段的擴(kuò)增 根據(jù)菰黑粉菌反轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行信息學(xué)分析，得到Ueubc2基因預(yù)測(cè)片段，根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果設(shè)計(jì)特異引物Ueubc2-F1和Ueubc2-R1（表1），采用普通PCR以基因組DNA為模板擴(kuò)增菰黑粉菌中該基因的已知片段，經(jīng)割膠回收后，通過(guò)TA克隆轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取陽(yáng)性克隆，進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。經(jīng)NCBI的BLAST功能檢測(cè)，確定該片段包含Ueubc2基因的完整序列，并包括部分上下游基因。

③菰黑粉菌Ueubc2基因組序列的克隆 根據(jù)②擴(kuò)增片段測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)特異引物Ueubc2-gF和Ueubc2-gR，以DNA為模板擴(kuò)增Ueubc2基因完整序列，并測(cè)序。

④菰黑粉菌Ueubc2 cDNA全長(zhǎng)序列的擴(kuò)增 采用 PrimeScriptRT regent Kit With gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成菰黑粉菌總RNA的cDNA第1鏈。根據(jù)已擴(kuò)增片段分析結(jié)果，設(shè)計(jì)引物Ueubc2-F2和Ueubc2-R2擴(kuò)增目的基因cDNA完整序列，經(jīng)克隆測(cè)序驗(yàn)證。然后通過(guò)NCBI的BLAST功能，同其他已知物種進(jìn)行氨基酸序列同源性比對(duì)，并利用MEGA軟件進(jìn)行序列分析，用Neighbor-joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和多重序列比對(duì)圖譜，并根據(jù)同源性來(lái)預(yù)測(cè)Ueubc2編碼蛋白的功能。

1.4 Ueubc2基因表達(dá)模式分析

①樣品采集觀察 以YEPS固體培養(yǎng)基分別培養(yǎng)從龍茭2號(hào)正常茭和灰茭中分離得到的菰黑粉菌，先分別在YEPS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至菌濃度OD600為2.0。以O(shè)D600為2.0的菰黑粉菌為初始濃度，分別取100 μL菌液，涂布YEPS固體平板，分別培養(yǎng)0、12、24、36、48、60 h后收集菌體。試驗(yàn)重復(fù)3次，收集的菌體用液氮速凍，-80℃保存。

②熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)量

菰黑粉菌總RNA的提取及其cDNA的合成方法同1.2，利用獲得的Ueubc2cDNA序列，按照qRT-PCR引物設(shè)計(jì)要求設(shè)計(jì)熒光特異性引物（表1）。以β-actin基因作為內(nèi)參基因，以YEPS固體培養(yǎng)基上分別培養(yǎng)0、12、24、36、48、60 h的cDNA為模板進(jìn)行定量 PCR擴(kuò)增。熒光定量PCR采用SYBR Green I染料法，反應(yīng)在StepOneTMReal-Time PCR System（ABI）檢測(cè)系統(tǒng)上進(jìn)行。PCR反應(yīng)液體系為：10 μL SYBR Premix Ex TaqTM，0.5 μL PCR Forward Primer（10 μmol/L），0.5 μL PCR Reverse Primer（10 μmol/L），0.5 μL cDNA模板，8.5 μL PCR水。反應(yīng)程序?yàn)?95℃ 30 s；95℃ 30 s，54℃ 20 s，72℃延伸30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3個(gè)重復(fù)樣品。根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR得到的Ct值以及標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用2-ΔΔCt法計(jì)算Ueubc2的相對(duì)表達(dá)量[20]，同時(shí)對(duì)其進(jìn)行顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菰黑粉菌Ueubc2基因的全長(zhǎng)克隆及序列特征分析

根據(jù)前期菰黑粉菌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)信息，設(shè)計(jì)了特異引物（表1）擴(kuò)增了Ueubc2目的基因和開(kāi)放閱讀框。根據(jù)Ueubc2-F1和Ueubc2-R1引物以菰黑粉菌DNA為模板擴(kuò)增得到4 091 bp（圖1）的序列，對(duì)測(cè)序結(jié)果根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的Blast功能進(jìn)行信息學(xué)分析，確定該序列包含Ueubc2完整序列和部分上下游序列。再根據(jù)信息學(xué)結(jié)果設(shè)計(jì)引物Ueubc2-gF和Ueubc2-gF，以DNA為模板擴(kuò)增得到2 562 bp序列（圖1），經(jīng)Blast功能分析發(fā)現(xiàn)該蛋白與玉米瘤黑粉菌中的ubc2基因具有較高的同源性，包括了的TAG終止密碼子和ATG起始密碼子，是完整序列。再以Ueubc2-F2和Ueubc2-R2引物，以cDNA為模板擴(kuò)增該目的基因的開(kāi)放閱讀框，得到2 562 bp片段（圖1），而基因組擴(kuò)增得到的Ueubc2完整序列也是序列2 562 bp，說(shuō)明該目的基因內(nèi)部不含內(nèi)含子。

經(jīng)ExPasy預(yù)測(cè)，Ueubc2基因編碼了853個(gè)氨基酸，蛋白分子量約為90.42 kDa，理論等電點(diǎn)為8.09。通過(guò)NCBI中的BLAST比對(duì)結(jié)果表明，該序列與其他真菌中的MAPK信號(hào)通路調(diào)控蛋白具有高度同源性，特別與玉米黑粉菌中的Ubc2蛋白結(jié)構(gòu)很相似，因此我們將其命名為Ueubc2（GenBank登陸號(hào)KT779549）。

2.2 Ueubc2蛋白結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)文中2.1獲得的Ueubc2目的基因和開(kāi)放閱讀框序列測(cè)序結(jié)果，將基因翻譯成氨基酸序列，使用Blast中蛋白比對(duì)功能與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中所有蛋白進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果表明，該蛋白具有SAM結(jié)構(gòu)域（sterile alpha motif domain）、RA結(jié)構(gòu)域（ras association domain）和2個(gè)SH3結(jié)構(gòu)域（Src homology 3 domain）33種特征結(jié)構(gòu)（圖 2）。而玉米瘤黑粉菌中的Ubc2蛋白也存在這3個(gè)結(jié)構(gòu)域，說(shuō)明我們的Ueubc2與Ubc2蛋白很可能具有相似功能。為了研究Ueubc2與其他真菌中具有相似結(jié)構(gòu)的銜接蛋白進(jìn)行進(jìn)化分析，篩選了部分親緣關(guān)系較近真菌構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，如圖3。從圖中可知菰黑粉菌Ueubc2蛋白與大麥堅(jiān)黑粉菌（Ustilago hordeiCCF49723.1）、玉米瘤黑粉菌（XP_011391983）、玉米絲黑穗病黑粉菌（Sporisorium reilianumCBQ70036）、賓地瘤黑粉菌（Melanopsichium pennsylvanicum4 CDI56086）親緣關(guān)系較近。說(shuō)明Ueubc2蛋白確實(shí)與玉米瘤黑粉菌中的Ubc2蛋白屬于同類蛋白。將菰黑粉菌Ueubc2蛋白與以上4種真菌中的MAPK信號(hào)途徑中的銜接蛋白進(jìn)行比對(duì)，如圖4。因?yàn)楸葘?duì)的蛋白較大，所以就截取了部分比對(duì)序列，但從圖中還是可以看出這5種真菌銜接蛋白的結(jié)構(gòu)還是具有一些差異，但SAM（氨基酸位點(diǎn)13-79）、RA（氨基酸位點(diǎn)432-509）、2個(gè)SH3（氨基酸位點(diǎn)586-640；737-785）3種結(jié)構(gòu)域在這5種蛋白質(zhì)中都比較保守，只有少數(shù)幾個(gè)堿基的差異。表明菰黑粉菌中該蛋白可能是比較重要的蛋白，具有與其他真菌類似的功能，可能也參與真菌的菌絲生長(zhǎng)、致病性和有性生殖的過(guò)程。

2.3 Ueubc2基因在不同培養(yǎng)時(shí)間、菌落形態(tài)下的表達(dá)特征分析

將菰黑粉菌MT-1、T-1分別培養(yǎng)0、12、24、36、48、60 h后進(jìn)行菌落顯微觀察，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)初期，菰黑粉菌菌落光滑（圖 6C），邊界清晰，培養(yǎng)后，T-1在12 h即可觀察到形成的菌絲（圖 6A），而MT-1在36 h可觀察到形成的菌絲（圖 6D）。收集菌體，通過(guò)熒光定量PCR分析Ueubc2的表達(dá)量，結(jié)果如圖5，T-1茭白黑粉菌中Ueubc2基因表達(dá)量在12 h時(shí)最大，此時(shí)菌落開(kāi)始生長(zhǎng)菌絲；而MT-1茭白黑粉菌中Ueubc2基因表達(dá)量在36 h時(shí)最大，此時(shí)菌落在倒置顯微鏡下可以觀察到菌絲生長(zhǎng)，12 h時(shí)菌落邊界較光滑（圖 6B）。MT-1、T-1菰黑粉菌中Ueubc2的表達(dá)量趨勢(shì)基本一致，Ueubc2基因表達(dá)量都是呈現(xiàn)先上升后下降的過(guò)程，但是在融合生長(zhǎng)過(guò)程中該基因在T-1菌株中的表達(dá)量顯著高于MT-1，同時(shí)從圖 6可以看出T-1菰黑粉菌菌絲生長(zhǎng)速度較MT-1快，可能與其生長(zhǎng)能力相關(guān)。對(duì)Ueubc2基因在不同培養(yǎng)時(shí)間、菌落形態(tài)下的表達(dá)特征綜合分析，推測(cè)Ueubc2基因可能與菰黑粉菌菌株融合和菌絲生長(zhǎng)有關(guān)。

3 討論與結(jié)論

茭白是我國(guó)第二大水生蔬菜，不但其本身營(yíng)養(yǎng)豐富，口感也極佳，廣受人民喜愛(ài)，是一種具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的健康蔬菜[6～8]。但至今茭白植株孕茭機(jī)制還不是很清楚，這就迫切需要我們投入更大的精力于茭白孕茭機(jī)制的研究。而前期研究已發(fā)現(xiàn)菰黑粉菌是茭白植株基部膨大成可食用肉質(zhì)莖的關(guān)鍵，也在茭白組織切片中觀察到黑粉菌，并成功從茭白中分離得到菰黑粉菌，為孕茭機(jī)制在基因水平的研究提供了基礎(chǔ)。而菰黑粉菌的侵染能力又與真菌二型態(tài)具有密切聯(lián)系，菌絲態(tài)真菌一般具有侵染宿主的能力[9]，如釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）[9～10]、玉米瘤黑粉菌[11]。而真菌二型態(tài)的轉(zhuǎn)變受cAMP和MAPK信號(hào)途徑的協(xié)同調(diào)控[12～14]，本試驗(yàn)克隆得到的Ueubc2基因是MAPK信號(hào)途徑上游的關(guān)鍵基因。結(jié)合Ueubc2蛋白結(jié)構(gòu)及親緣關(guān)系分析，可知該蛋白是玉米瘤黑粉菌Ubc2的同源蛋白，是MAPK信號(hào)通路中的上游基因[14]，Ueubc2基因的缺失，很可能會(huì)導(dǎo)致菰黑粉菌致病性的缺失。在玉米瘤黑粉菌Ubc2蛋白中存在3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，SAM、RA和2個(gè)SH33種結(jié)構(gòu)域（圖2），它們是Ubc2蛋白行使功能不可缺少部分。SAM結(jié)構(gòu)域普遍存在于信號(hào)蛋白和核蛋白中，以EPH-相關(guān)的酪氨酸激酶介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間的的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；RA結(jié)構(gòu)域可能會(huì)與RasGTP蛋白結(jié)合，是假定的RasGTP效應(yīng)器。它們參與真菌菌絲的生長(zhǎng)，與真菌二型態(tài)轉(zhuǎn)變有關(guān)[5]。SH3結(jié)構(gòu)域是蛋白與蛋白間相互聯(lián)系的部分，對(duì)于富含脯氨酸的序列具有更強(qiáng)的親和性，優(yōu)先與P×× P基結(jié)合。SH3結(jié)構(gòu)域的蛋白具有多樣的細(xì)胞作用，比如酶的調(diào)節(jié)、信號(hào)通路調(diào)控、介導(dǎo)蛋白復(fù)合體的組裝等，是玉米瘤黑粉菌致病性產(chǎn)生的必須成分[5]。而在菰黑粉菌中也存在Ubc2同源蛋白，并且也具有與其高度同源的3個(gè)功能結(jié)構(gòu)域。從Ueubc2基因在不同培養(yǎng)時(shí)間、菌落形態(tài)下的熒光結(jié)果可知，Ueubc2基因跟菰黑粉菌菌絲融合生長(zhǎng)密切相關(guān)，且主要作用于菌絲形成初期，可能與其已知作用機(jī)制類似，在菰黑粉菌中，Ueubc2作用于信息素響應(yīng)，從而啟動(dòng)MAPK信號(hào)途徑來(lái)促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)[5]。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)Ueubc2基因在菰黑粉菌中的表達(dá)水平來(lái)探索該基因在其二型態(tài)轉(zhuǎn)變過(guò)程中的作用，為后期研究菰黑粉菌在茭白植株中菌絲態(tài)的形成時(shí)期，以及孕茭機(jī)制探索提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Cloning and Expression Analysis ofUeubc2inUstilago esculenta

YU Jiajia,ZHANG Yafen,CUI Haifeng,YU Xiaoping,YE Zihong
(College of Life Sciences,China Metering University;Zhejiang Provincial Key Laboratory of Biometrology and Inspection&Quarantine,Hangzhou,310018)

Zizania latifoliais the second aquatic vegetable in China.Its formation is closely releted the interaction which between its internally Endophytic fungus andUstilago esculenta.According to the transcriptome database ofUstilago esculenta,we designed the specific primers,using RT-PRC to amplify geneUeubc2.Sequence analysis showed that Ueubc2is the homologous gene ofubc2inUstilago maydis,and the encoding protein contains SAM,RA and SH3 domain, which acting on the MAPK signal pathway.At the same time,the expression analysis by real-time PCR revealed to gene Ueubc2was up-regulated during the mating progress,and reached highest when hyphae formed,then decreased during hyphae's growth,the result shows that it had an important role in the process of two type transformation ofUstilago esculenta.

Ustilago esculenta;two type transformation;Ueubc2

S645.2；Q786；Q781

A

1001-3547（2015）22-0202-06

10.3865/j.issn.1001-3547.2015.22.073

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD27B01）；浙江省公益項(xiàng)目（2014C32022）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（3147085）

2015-10-14與菰黑粉菌二型態(tài)轉(zhuǎn)變過(guò)程。本研究為進(jìn)一步闡述菰黑粉菌菌絲形態(tài)發(fā)生的分子機(jī)制，探討茭白的孕茭機(jī)理提供了理論基礎(chǔ)。

茭白（Zizania latifoliaTurcz），古稱為菰，是禾本科多年水生宿根性草本植物，原產(chǎn)中國(guó)及部分東南亞地區(qū)[1]?！吨芏Y》中記載在公元前3世紀(jì)“菰”為六谷之一，是重要糧食作物[2]。茭白共生菌菰黑粉菌可以侵入茭白植株，使茭白莖基部膨大形成可食用茭白，該種肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富的膨大組織是我國(guó)長(zhǎng)江流域以及以南地區(qū)廣泛栽培的經(jīng)濟(jì)作物[1]。前期研究也發(fā)現(xiàn)在茭白膨大過(guò)程中，組織中菰黑粉菌（Ustilago esculenta）會(huì)大量增殖，在切片中可以觀察到大量菌絲[3]。因此，菰黑粉菌與茭白的生產(chǎn)密切相關(guān)。

菰黑粉菌屬于黑粉菌屬真菌，具有典型的二型態(tài)生活史。而真菌的致病性與其二型現(xiàn)象具有緊密聯(lián)系，酵母型真菌處于無(wú)性生殖狀態(tài)，進(jìn)行芽殖或裂殖；菌絲型的產(chǎn)生一般與真菌的有性生殖有關(guān)，該狀態(tài)下的真菌具有侵染宿主的能力。菰黑粉菌同樣具有酵母型和菌絲型2種型態(tài)，且在茭白膨大過(guò)程中菰黑粉菌也隨之快速增殖，菌絲也大量生長(zhǎng)，所以菰黑粉菌的侵染能力可能也與其近緣真菌玉米瘤黑粉菌（Ustilago maydis）類似，菌絲態(tài)的形成使真菌具有侵染能力[4]。真菌的二型態(tài)轉(zhuǎn)變又與環(huán)磷酸腺苷/蛋白激酶A（cAMP/PKA）和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase,MAPK）信號(hào)途徑相關(guān)，它們可以協(xié)同調(diào)控真菌菌絲的生長(zhǎng)，并使真菌產(chǎn)生致病性。在玉米瘤黑粉菌中，MAPK信號(hào)途徑可以調(diào)控真菌中交配型基因交聯(lián)、型態(tài)轉(zhuǎn)變和致病性。MAPK信號(hào)通路包含Kpp4/ Ubc4、Fuz7/Ubc5、Kpp2/Ubc3、Kpp6和Crk1。另外，ubc還存在其他2個(gè)基因，Ubc1蛋白參與cAMP/ PKA信號(hào)途徑中PKA亞基的表達(dá)調(diào)控；Ubc2銜接蛋白調(diào)控信息素響應(yīng)的MAP激酶信號(hào)通路和致病性產(chǎn)生的過(guò)程。ubc2基因位于MAPK信號(hào)通路最上游位置，ubc2基因發(fā)生突變，玉米瘤黑粉菌菌絲生長(zhǎng)會(huì)受到抑制[5]。

本課題組前期對(duì)菰黑粉菌轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在菰黑粉菌中具有與玉米瘤黑粉菌ubc2基因序列相似基因，因此對(duì)本課題組前期分離得到的菰黑粉菌進(jìn)行該基因序列和開(kāi)放閱讀框的PCR擴(kuò)增，通過(guò)基因結(jié)構(gòu)、同源性及系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，該基因與玉米瘤黑粉菌中ubc2基因具有較高同源性，故命名為Ueubc2。同時(shí)利用熒光定量PCR檢測(cè)分析了不同培養(yǎng)時(shí)間誘導(dǎo)后Ueubc2在菰黑粉菌菌落二型態(tài)轉(zhuǎn)化過(guò)程中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)菰黑粉菌菌落在從酵母型向菌絲型轉(zhuǎn)化過(guò)程中Ueubc2基因的表達(dá)量具有明顯的變化，其中在培養(yǎng)早期Ueubc2呈上調(diào)表達(dá)，并在菌絲開(kāi)始形成時(shí)達(dá)到最大，之后隨著菌絲大量形成，表達(dá)量逐漸降低，表明該基因參

余佳佳(1990-)，女，研究生，主要從事真菌與植物互作，E-mail：yji12579@163.com

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