干細(xì)胞治療馬軟組織疾病研究進(jìn)展

孫亞?wèn)|，王洪斌

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030；2.遼寧水利職業(yè)學(xué)院生物工程系，遼寧沈陽(yáng)110122；3.沈陽(yáng)市佳緣動(dòng)物醫(yī)院，遼寧沈陽(yáng)110122）

干細(xì)胞是一種原始細(xì)胞，通過(guò)對(duì)稱性和非對(duì)稱性分化而具有自我更新和定向分化能力。分類(lèi)上包括胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESCs）和成體干細(xì)胞（adult stem cells，ASCs）。雖然 ASCs在馬屬動(dòng)物疾病治療上已得到一些應(yīng)用［1-2］，但尚缺乏長(zhǎng)期詳實(shí)的臨床數(shù)據(jù)。治療中最常用的兩種干細(xì)胞分別是脂肪組織間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose tissue mesenchymal stem cells，AT-MSCs）和骨髓源間充質(zhì)干細(xì)胞（marrow-derived mesenchymal stem cells，BMMSCs）。在頭尾部采集的脂肪組織用膠原酶消化培養(yǎng)純化后獲得AT-MSCs或者脂肪源基質(zhì)混合物（adipose-derived stromal vascular fraction，ADSVF）［3］。在胸骨和髂骨采集的骨髓［4-5］，經(jīng)過(guò)2周～3周的培養(yǎng)可以獲得BM-MSCs。如果離心便得到含有血小板和少量干細(xì)胞的骨髓濃縮物［6］。ADSVF從收集到應(yīng)用臨床時(shí)間周期短，商業(yè)化比較成熟，臨床應(yīng)用更廣泛，但是AD-SVF中只含有20%～40%的干細(xì)胞。除了成體組織源性的 MSCs，其他來(lái)源的MSCs包括馬胎兒成纖維細(xì)胞，臍帶血，胎盤(pán)，羊水組織［7-8］。其中只有商品化的胎兒成纖維細(xì)胞源MSCs在治療馬肌腱炎中的有效性得以確認(rèn)［7］。雖然上述干細(xì)胞在治療馬軟組織疾病臨床應(yīng)用比較廣泛，但是仍然存在諸多問(wèn)題，如安全性問(wèn)題等。本文主要綜述目前動(dòng)物臨床治療使用干細(xì)胞的種類(lèi)及治療方法和存在的問(wèn)題，期望為干細(xì)胞治療此類(lèi)疾病提供借鑒。

1 干細(xì)胞治療軟組織疾病應(yīng)用

1.1 肌腱炎和懸韌帶炎

目前臨床主要采用直接注射或者超聲波引導(dǎo)注射的方法治療肌腱炎和懸韌帶炎。經(jīng)過(guò)培養(yǎng)的BMMSCs和 AT-MSCs可用于治療馬的肌腱炎［9］。Smith等首次報(bào)道BM-MSCs治療賽馬趾淺屈肌肌腱炎方法。Pacini S等［10］首次用對(duì)照試驗(yàn)研究BMMSCs治療自然發(fā)生的馬趾淺屈肌肌腱炎。試驗(yàn)組11匹馬用BM-MSCs，對(duì)照組15匹用傳統(tǒng)抗炎方法，其他條件相同。試驗(yàn)組中9匹馬（9／11，82%）經(jīng)過(guò)治療9個(gè)～12個(gè)月后就可以重新參加比賽，并且在2年內(nèi)沒(méi)有復(fù)發(fā)。對(duì)照組中15匹馬全部在1年內(nèi)復(fù)發(fā)（平均復(fù)發(fā)時(shí)間7個(gè)月）。證明干細(xì)胞在治療馬肌腱炎比傳統(tǒng)方法更有效。O＇Meara B等［11］對(duì)比研究文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)和傳統(tǒng)方法相比，BM-MSCs治療復(fù)發(fā)比率明顯下降，分別為53%和25.7%，對(duì)比治療后重新參加比賽的次數(shù)，差異不顯著。雖然上述資料均已經(jīng)證實(shí)干細(xì)胞在治療此類(lèi)疾病的有效性，但是要提高治療效果還有待進(jìn)一步研究。多種因素影響干細(xì)胞治療效果，其中包括注射過(guò)程中干細(xì)胞受到機(jī)械破壞程度、注射干細(xì)胞的數(shù)量和注射次數(shù)。為了避免注射過(guò)程中受到嚴(yán)重的機(jī)械破壞，可以在注射過(guò)程中使用20或23G注射針。Godwin等證明較少數(shù)量干細(xì)胞治療效果不佳。Schnabel L V等［12］證明每個(gè)病變區(qū)域10×106個(gè)BM-MSCs具有較好的治療效果。注射次數(shù)決定恢復(fù)情況。通常在第1次注射30d后重新評(píng)估跛行程度且進(jìn)行超聲波檢查，如果檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)改善程度小于50%，則必須要進(jìn)行第2次甚至多次注射。Sole A等［13］證明對(duì)于廣泛性肌腱或者懸韌帶病變，采用干細(xì)胞局部靜脈注射的方法更為有效。除了上述治療方法，Kol A 等［14］證明血小板富集血漿（plateletrich plasma PRP）結(jié)合BM-MSCs也是治療肌腱炎行之有效的方法。首次注射時(shí)使用PRP結(jié)合骨髓濃縮物，再次按先后次序使用PRP結(jié)合BM-MSCs。關(guān)于PRP和BM-MSCs二者誰(shuí)更有效還有待進(jìn)一步研究。關(guān)于那種方法更有效同樣需要深入研究。

1.2 關(guān)節(jié)疾病

MSCs治療骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）和軟骨損傷效果已經(jīng)得到證實(shí)。BM-MSCs治療效果好于AT-MSCs［15-16］。Frisbie首次采用關(guān)節(jié)內(nèi)注射干細(xì)胞治療馬腕關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎。分別用BM-MSCs和AD-SVF治療受損傷的關(guān)節(jié)，過(guò)70d的治療后組間關(guān)節(jié)軟骨生物化學(xué)和組織化學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)不同。經(jīng)過(guò)BM-MSCs注射治療后滑膜積液情況緩解并且前列腺素E2（PGE2）濃度下降。用AD-SVF治療后腫瘤壞死因子（TNF）-α濃度升高引起炎癥反應(yīng)。關(guān)于BM-MSCs關(guān)節(jié)內(nèi)注射治療OA的具體方法還需要大量的研究，目前研究支持在注射前將MSCs分化誘導(dǎo)［17］。培養(yǎng)的BM-MSCs和MSCs的治療有效性通過(guò)實(shí)驗(yàn)性股骨外側(cè)滑車(chē)脊軟骨缺損模型得到驗(yàn)證［6，18］。Wilke M M 等［18］用BM-MSCs結(jié)合纖連蛋白移植物在第30天治療軟骨缺損比單獨(dú)使用纖連蛋白移植物獲得很好的關(guān)節(jié)鏡和活組織檢查評(píng)價(jià)結(jié)果，8個(gè)月后試驗(yàn)組和對(duì)照組間結(jié)果差異不顯著。原因可能是活組織檢查采樣造成了軟骨損傷及BMMSCs存活時(shí)間比較短。Fortier L A等［6］采用相似的方法（未采用活組織檢查）證明BM-MSCs治療軟骨缺陷的有效性。經(jīng)過(guò)短期（3個(gè)月）與長(zhǎng)期（8個(gè)月）的臨床和組織學(xué)評(píng)估發(fā)現(xiàn)BM-MSCs治療效果明顯提高。8個(gè)月后磁共振技術(shù)檢查關(guān)節(jié)恢復(fù)非常明顯。Rachel E M 等［19］用BM-MSCs結(jié)合透明質(zhì)酸采用關(guān)節(jié)內(nèi)注射法治療馬內(nèi)側(cè)股骨髁全層軟骨缺損，1年后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物安樂(lè)死后發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組組織修復(fù)程度及蛋白多糖濃度與對(duì)照組相比大幅度提高。組織核磁共振、組織化學(xué)和生物化學(xué)檢查結(jié)果差異不顯著。Dora J F等［16］研究證實(shí)33匹馬關(guān)節(jié)鏡手術(shù)后注射BM-MSCs治療膝關(guān)節(jié)損傷（包括股骨內(nèi)側(cè)髁囊性病變和十字韌帶損傷），和對(duì)照組相比明顯降低發(fā)病率、十字韌帶功能恢復(fù)。關(guān)節(jié)鏡可以用來(lái)引導(dǎo)干細(xì)胞注射進(jìn)入關(guān)節(jié)內(nèi)治療關(guān)節(jié)軟骨缺損［6］。這種方法要求雙導(dǎo)管注射系統(tǒng)，其中一個(gè)裝有干細(xì)胞，另外一個(gè)裝牛凝血酶，注射后二者混合形成類(lèi)似病變大小的團(tuán)塊。

1.3 蹄葉炎

干細(xì)胞在治療馬蹄葉炎疾病中具有很大前景，但是關(guān)于治療的有效性、使用方法、干細(xì)胞種類(lèi)及數(shù)量等問(wèn)題還有待研究。Guedes A G等［20］證實(shí)患有蹄葉炎的馬缺乏表達(dá)p63的表皮干細(xì)胞，BM-MSCs是否有助于表皮干細(xì)胞的增殖以及來(lái)自其他部位皮膚的表皮干細(xì)胞能否治療蹄葉炎還需要試驗(yàn)證實(shí)。在完全診斷排除其他潛在疾病的情況下，目前常用的治療蹄葉炎方法是局部靜脈注射干細(xì)胞療法。注射數(shù)量為20×106個(gè)，注射次數(shù)因個(gè)體差異。通常需要注射2次，治療時(shí)機(jī)是第1次在急性發(fā)作階段，在這個(gè)階段首要任務(wù)是控制炎癥反應(yīng)；第2次在2周后。雖然關(guān)節(jié)彈響發(fā)生機(jī)率低（9%），但是也影響治療效果。為了減少關(guān)節(jié)彈響的發(fā)生，注射前可以謹(jǐn)慎使用非甾體類(lèi)抗炎藥物［21］。

2 存在問(wèn)題及展望

2.1 存在問(wèn)題

如果瘢痕組織已經(jīng)形成，在沒(méi)有獲得自體干細(xì)胞時(shí)可以使用異體干細(xì)胞進(jìn)行局部治療。盡管很多研究證實(shí) MSCs具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)的特性［2，21］，但是馬異體MSCs能否誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)還有待深入研究。Carrade D D等［21］檢測(cè)臍血和胎盤(pán)源MSCs即使經(jīng)過(guò)多次注射也不能誘發(fā)免疫反應(yīng)。實(shí)際上成年動(dòng)物源比新生動(dòng)物源的MSCs更容易誘發(fā)免疫反應(yīng)。由于MHC分子影響免疫原性，MHCⅡ分子的表達(dá)隨著干細(xì)胞傳代次數(shù)及馬的個(gè)體變化很大，不是所有同一來(lái)源的MSCs都一樣。有研究表明傳代2代的BM-MSCs高度不均一表達(dá)MHCⅡ分子范圍（0～98%），增強(qiáng)的MHCⅡ表達(dá)直接促使T淋巴細(xì)胞的增殖。然而，某些馬的BM-MSCs前2代不表達(dá)MHCⅡ，大多數(shù)在第4代或者以后才表達(dá)，因此大多數(shù)成體源性MSCs比如BM-MSCs在臨床治療時(shí)為保持其干細(xì)胞特性只能進(jìn)行有限傳代。MHCⅡ類(lèi)分子陰性、傳代次數(shù)低、通用的BMMSCs將具有重大的臨床價(jià)值。但是目前臨床使用的BM-MSCs通常是MHCⅡ陽(yáng)性，傳代次數(shù)較多，所以其安全性的評(píng)估格外重要。

2.2 展望

干細(xì)胞在馬臨床軟組織疾病應(yīng)用中有巨大的潛力，但是還有很多問(wèn)題需要解決。不同病例使用干細(xì)胞的數(shù)量、使用方法都需要深入研究。隨著組織工程技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，干細(xì)胞與組織工程材料之間的相互作用及組織工程材料對(duì)干細(xì)胞向受損傷組織趨化的作用是未來(lái)研究的主要方向。異體干細(xì)胞移植的免疫排斥性問(wèn)題也很重要。通常認(rèn)為干細(xì)胞不能誘發(fā)免疫反應(yīng)，但是超過(guò)90%早期培養(yǎng)的干細(xì)胞表達(dá)MHCⅡ分子，所以這些干細(xì)胞也能誘發(fā)免疫反應(yīng)。由于異體移植的免疫排斥、急性發(fā)作期的馬不能立即獲得自體干細(xì)胞，所以尋找萬(wàn)能的BMMSCs供體將是未來(lái)臨床需要研究的重要課題之一。由于干細(xì)胞治療需要大量細(xì)胞，成體組織中細(xì)胞數(shù)量往往不足，所以如何能提供充足的種子細(xì)胞也是細(xì)胞治療的重要問(wèn)題。誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）由于其特性具有巨大的臨床應(yīng)用潛力，未來(lái)或許可以解決BMMSCs細(xì)胞數(shù)量不足的問(wèn)題［22］。

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